一种载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明属于生物医学工程材料技术领域，公开了一种载一氧化氮的羧化壳聚糖?聚乙烯亚胺水凝胶及其制备方法和应用。该方法包括以下步骤：往羧化壳聚糖的水溶液中加入1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺盐酸盐和N?羟基琥珀酰亚胺搅拌溶解，再加入聚乙烯亚胺，搅拌反应，得到羧化壳聚糖?聚乙烯亚胺水凝胶；将其悬浮于甲醇钠/甲醇溶液中，通入一氧化氮加压反应，得到载一氧化氮的羧化壳聚糖?聚乙烯亚胺水凝胶。本发明利用水溶性羧化壳聚糖与聚乙烯亚胺发生酰胺反应，引入仲胺基团形成水凝胶再装置NO，实现NO的高装载量，并可自动缓慢释放NO，解决了现有载体材料细胞毒性大、生物相容性差、NO负载量低、突释现象严重等问题。
【专利说明】
一种载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医学工程材料技术领域，特别涉及一种载一氧化氮(NO)的羧化壳聚糖(CPCTS)-聚乙烯亚胺(PEI)水凝胶及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]自青霉素被发明利用以来，以青霉素为代表的抗生素挽救了无数伤员患者的生命，抗生素对细菌、真菌、病毒甚至是肿瘤都可起到抑制或杀灭作用，然而近年来对抗生素的滥用已经到了无以复加的地步。随着抗生素的滥用不仅使人体产生多种不良反应，还导致细菌产生了广泛的耐药性，久而久之导致无抗生素可以对已经有很强抗药性的细菌或病毒产生作用(我国抗生素滥用现状及其对策2014 09B-0175-03)。研究发现一氧化氮(NO)是内皮细胞释放的舒张因子，它不但作为生物体中重要的信号分子参与调节生物体的各种生理病理过程，而且还是抵御细菌、病毒、肿瘤细胞等病原体的有效武器，能杀死多种病原体从而保护人的机体健康。因此制备可负载一氧化氮(NO)的材料是目前生物医学工程领域研究的热点。
[0003]Wink DA等研究发现亲水性的一氧化氮(NO)供体从聚合物中渗出，在血液中形成致癌性N-亚硝胺物质(The multifaceted roles of nitric oxide in cancercarcinogenesis, 1998.19:711-721)，负载一氧化氮(NO)的材料在人体内不可降解。以二胺为基底N-偶氮稀二醇类物质也会从聚合物基体中渗出，从而生成致癌性物质(Preparat1nand characterizat1n of hydrophobic polymeric films that are thromboresistantvia nitric oxide release.B1materials.2000,21:9-21)，其生物相容性和细胞毒性成为其应用到人体最大的阻碍。高群等人研究发现用氨基酸改性壳聚糖负载一氧化氮(NO)，其一氧化氮(NO)供体在PBS液中的累计释放量最高可达到31 Onmo I /mg (新型亲核NO供体的合成及性能研究)，其累计释放量太低，从而导致其抗菌效果不佳。
[0004]因此，制备生物相容性好、在体内可降解、抗菌效果佳及可持续释放的一氧化氮(NO)供体便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。迄今为止，通过羧化壳聚糖(CPCTS)-聚乙烯亚胺(PEI)形成水凝胶载一氧化氮(NO)的制备方法、抗菌方法及其应用尚未见报道。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种载一氧化氮(NO)的羧化壳聚糖(CPCTS)-聚乙烯亚胺(PEI)水凝胶。该水凝胶具有优良的溶胀性、透过性、生物相容性以及载药不失活等特性，且释放速率可以通过调整交联度和水凝胶的化学组成实现。
[0006]本发明另一目的在于提供一种上述载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法。
[0007]本发明再一目的在于提供上述载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶作为生物医学工程材料，在抗菌、抗病毒和防治肿瘤中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述方案实现:
[0009]一种载一氧化氮(NO)的羧化壳聚糖(CPCTS)-聚乙烯亚胺(PEI)水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0010]往羧化壳聚糖的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，再加入聚乙烯亚胺，搅拌反应，得到羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶；将羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶悬浮于甲醇钠/甲醇(CH3ONa/CH3OH)溶液中，通入一氧化氮加压反应，得到载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶(CPCTS-PE1-N0)。
[0011]所用羧化壳聚糖、聚乙烯亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(I?2): (I?2):(1.2?2):(1.2?2)。
[0012]所述羧化壳聚糖的分子量优选为150000?200000。
[0013]所述羧化壳聚糖可购买得到，或通过以下方法制备得到:将壳聚糖与酸酐反应制得N-取代衍生物，即C2位羧甲基化的羧化壳聚糖。
[0014]所述聚乙烯亚胺的分子量优选为1800?20000。
[0015]所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL水中加入2?3克计。
[0016]所述搅拌反应的时间优选为24?36h，搅拌转速优选为600?800rpm。
[0017]所述反应物羧化壳聚糖、聚乙烯亚氨、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺总质量与所用水溶液体积的比例为5?15g/1 OOmL。
[0018]所述搅拌反应后，优选通过透析、冻干，得到纯化后的产物。所述透析的时间优选为3?5d，所述冻干的时间优选为3?5d。
[0019]所述CH3ONa/CH3OH溶液中，CH3ONa的加入量为每10mLCH3OH中加入4?6克计。
[0020]所述CH3ONa/CH3OH溶液的用量以摩尔比Na+/NHg (3?5)计。
[0021]所述CPCTS-PEI水凝胶的质量与CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为5?I Og/1 OOmL。
[0022]所述通入一氧化氮加压反应优选指通入氮气使反应容器内压力为600?SOOKPa。所述通入一氧化氮前优选先通氮气后抽真空。
[0023]所述通入一氧化氮反应的时间优选为6?8天。
[0024]所述通入一氧化氮反应后，优选通入氮气吹走未反应的NO，然后优选进行过滤、洗涤、真空干燥获得纯化的产物。
[0025]所述的洗涤指所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0026]本发明还提供一种上述方法制备得到的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶。
[0027]本发明通过对壳聚糖C2位进行羧化，得到水溶性羧化壳聚糖，并与聚乙烯亚胺(PEI)发生酰胺反应，引入仲胺基团-NH，形成水凝胶;亲核试剂点-NH与一氧化氮(NO)在600?800KPa条件下发生反应形成[Ν(0)Ν0]-，从而实现NO的高装载量。同时，[N(O)NO]-在PBS(pH = 7.4)溶液中自发释放一氧化氮(NO)气体，不需要电子转移、辅助因子和酶的参与。因此本发明的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶可实现NO的高负载，并可自动释放NO;采用大分子量的羧化壳聚糖和聚乙烯亚胺，一方面大分子量的PEI提高了 NO的负载量，另一方面大分子量的羧化壳聚糖与PEI交联后，所得凝胶弹性更好、物理性质更加稳定，且由于其水凝胶特性，具有缓释效果，而现有使用的载体材料并无使用凝胶的先例，且现有载体与本发明载体相比，细胞毒性大、生物相容性差、NO负载量低、突释现象严重。因此本发明的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶在生物医学工程材料领域，特别是在抗菌、抗病毒和防治肿瘤中具有巨大的潜在应用价值。
[0028]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0029](I)羧化壳聚糖是最重要的壳聚糖衍生物之一，水溶性高，具有优良的乳化性、吸湿保湿性、成膜性和生物相容性等特点；
[0030](2)羧化壳聚糖同时具备有效抑制细菌和真菌的生长和繁殖的能力，对常见的口腔致病菌、皮肤癣菌、伤口感染菌等具有显著的抑制效果，并具有促进伤口愈合和消炎、止血等功能；
[0031](3)超支化的聚乙烯亚胺(PEI)含有大量的仲胺基团-NH，作为亲核位点可以和一氧化氣(NO)发生反应，提尚一氧化氣(NO)的负载量；
[0032](4)羧化壳聚糖与聚乙烯亚胺发生酰胺反应形成水凝胶，具有优良的溶胀性、透过性、生物相容性以及载药不失活等特性；
[0033](5)该水凝胶能维持负载在水凝胶中的药物，且释放速率可以通过调整交联度和水凝胶的化学组成实现；
[0034](6)该材料显示正电性，有利于与细胞的亲和；
[0035](7)改变羧化壳聚糖(CPCTS)与聚乙烯亚胺(PEI)的投料比，可以控制水凝胶的疏松结构，应用广泛；
[0036](8)羧化壳聚糖凝胶体系是一种理想的缓释材料；
[0037](9)本发明材料成分简单、原料易得、生物相容性好，有望在生物医学工程材料领域得到广泛应用。
【附图说明】
[0038]图1为实施例2制备得到的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的红外谱图。
[0039]图2为实施例1和2制备得到的CPCTS-PE1-N0与Griess试剂的显色反应图。
[0040]图3为实施例1制备得到的CPCTS-PE1-N0在PBS(pH7.4)缓冲液中释放实验结果图。[0041 ]图4为实施例2制备得到的CPCTS-PE1-N0与大肠杆菌共培养24小时后的抗菌实验图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]下列实施例中所用的试剂均可从商业渠道购买得到。
[0044]实施例1:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0045](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0046]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36小时，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0047]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为2:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为5g/100mL。
[0048](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0049]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0050]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为5g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0051 ] 结果分析:CPCTS和PEI制备得CPCTS-PEI ,2956cm—1处的NH伸缩振动峰与PEI相同和1556cm—1处的NH弯曲振动峰与PEI相同，1666cm—1和1392cm—1处出现新的酰胺峰，图1红外谱图证实CPCTS接上PEI基团。
[0052]实施例2:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0053](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0054]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0055]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为2:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为10g/100mL。
[0056](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0057]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0058]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为10g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0059]实施例3:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备[0060 ] (I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0061]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0062]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为2:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为15g/100mL。
[0063](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0064]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0065]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为15g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0066]实施例4:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0067](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0068]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0069]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为5g/100mL。
[0070](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0071 ] 将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0072]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为10g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0073]实施例5:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0074](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0075]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0076]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为10g/100mL。
[0077](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0078]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0079]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为8g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0080]实施例6:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备[0081 ] (I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0082]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0083]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为15g/100mL。
[0084](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0085]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0086]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为5g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0087]实施例7:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0088](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0089]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0090]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:2:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为5g/100mL。[0091 ] (2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0092]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于30?60mL溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0093]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为8g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0094]实施例8:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0095](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0096]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0097]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:2:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为10g/100mL。
[0098](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0099]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0100]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为5g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0101 ]实施例9:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0102](I)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的制备
[0103]称取羧化壳聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解，转入圆底烧瓶，同时加入聚乙稀亚胺(PEI)，然后密封进行反应，反应过程中磁力搅拌，转速为600?800rpm，反应时间24?36h，pH7.0;透析3?5天、冻干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝胶产物。
[0104]所述羧化壳聚糖(CPCTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:2:1.2:1.2;所述聚乙烯亚胺(PEI)的加入量为每10mL超纯水中加入2?3克计;所述反应物总质量和水溶液体积的比例为15g/100mL。
[0105](2)羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制备
[0106]将步骤(I)制备得到的CPCTS-PEI悬浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高压反应釜中，先通氮气后抽真空，再通入NO气体，反应7天、过滤、洗涤、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0产物。
[0107]所述CH3ONa/CH3OH溶液的体积为30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝胶的质量和CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为10g/100mL;所述的高压反应釜反应为先通氮气后抽真空，除去体系中的氧气，再通入NO气体，维持压力600?800KPa，室温条件下反应7?8天，反应完成后，先通入氮气吹去未反应的NO气体;所述的洗涤是所得固体用无水甲醇和乙醚各洗涤2?3次。
[0108]实施例1O:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶的溶胀性能
[0109]对实施例2所得羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)水凝胶进行溶胀性能测试实验，结果发现羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺(CPCTS-PEI)形成的水凝胶，溶胀性能非常好，结构疏松稳定，有利于载一氧化氮(NO)及控制一氧化氮(NO)的释放。红外谱图见图1。
[0110]实施例11:一氧化氮(NO)的释放
[0111]对实施例2制备得到的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)，采用Griess试剂法测定合成产物在roS(pH7.4)缓冲溶液中一氧化氮(NO)的释放过程，称取3组平行样品，分别于0.5h、Ih、I.5h、2h、4.5h、7.5h、1h、20h、30h、40h取透析袋外侧PBS液，持续取样40h，在96孔板中依此滴加I，Π液后，溶液变为粉红色、玫瑰红色表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性。在无光的条件下稳定15min后会观察到紫色或紫红色出现，随着释放时间增长，颜色从浅到深再到浅。然后用酶标仪测定其540nm处的吸收强度，结果见图
2。图2的结果证实羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)形成的产物有一氧化氮(NO)释放；图3的结果证实羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-ΡΕΙ-Ν0)在PBS(pH7.4)缓冲液中持续释放40h，达到最大累计释放量为680nmol/mg。
[0112]实施例12:羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的抗菌性
[0113]将实施例2制备得到的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-PE1-NO)形成的产物以低浓度和高浓度分别加入含有2mL大肠杆菌菌悬液和4mL PBS缓冲液的溶液中，37°C培养24h，结果如图4所示。I号为低浓度、2号为高浓度、3号为对比样品，对比发现I号和3号一样浑浊，2号澄清透明，证实羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶载一氧化氮(CPCTS-ΡΕΙ-Ν0)形成的产物具备有效抑制细菌和真菌的生长和繁殖的能力，在常见的口腔致病菌、皮肤癣菌、伤口感染菌等抑菌效果方面具有广泛的应用前景。
[0114]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 往羧化壳聚糖的水溶液中加入1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌溶解，再加入聚乙烯亚胺，搅拌反应，得到羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶；将羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶悬浮于甲醇钠/甲醇溶液中，通入一氧化氮加压反应，得到载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶。2.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所用羧化壳聚糖、聚乙烯亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(I?2): (I?2):(1.2?2):(1.2?2)。3.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所述羧化壳聚糖的分子量为150000?200000;所述聚乙烯亚胺的分子量为1800?20000。4.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所述聚乙稀亚胺的加入量为每10mL水中加入2?3克计。5.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所述搅拌反应的时间为24?36h，搅拌转速为600?800rpm。6.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所述羧化壳聚糖、聚乙烯亚氨、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺总质量与所用水溶液体积的比例为5?15g/1 OOmL。7.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所述羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的质量与CH3ONa/CH3OH溶液体积的比例为5?1g/10mL。8.根据权利要求1所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶的制备方法，其特征在于:所述通入一氧化氮加压反应指通入氮气使反应容器内压力为600?800KPa。9.一种载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶，其特征在于由权利要求1?8任一项所述的制备方法制得。10.权利要求9所述的载一氧化氮的羧化壳聚糖-聚乙烯亚胺水凝胶在生物医学工程材料领域中的应用。
【文档编号】A61K33/00GK105832656SQ201610355430
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】马栋, 吉玉洁, 张武, 薛巍
【申请人】暨南大学