自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法与应用。一种重组载体，在穿梭质粒pMA5?HpaII的两个酶切位点EcoRI和KpnI之间插入ComQ?ComX基因，在两个酶切位点BamHI和MluI之间插入通过重叠PCR将Psrf启动子基因、Tat型信号肽PhoD基因和海藻糖合成酶基因TreS连接起来的连接片段。本发明采用枯草芽孢杆菌表面活性素启动子Psrf和海藻糖合成酶融合后进行诱导表达的效果显著优于其它诱导型表达的效果；该工程菌无需添加任何的诱导剂进行诱导海藻糖合成酶的分泌表达，这符合了食品安全级别酶制剂的制备，海藻糖合成酶在食品医疗行业中能够广泛应用。
【专利说明】
自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法与应用，特别涉及一 种自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法，属于基因工程 和酶工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C12H22O11 · 2H20,广泛分布于自然界中许多 生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生物、真菌，以及 一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。在生物细胞中其功能是保护细胞 质膜，蛋白质、核酸等大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流 失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用;增强农作物抗 逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原 性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品行业。因此，对海藻糖进行研 究具有重要的意义。
[0003] 该技术的应用建立在枯草芽孢杆菌菌株的基础上，枯草芽孢杆菌在自然界中分布 极其广泛，与人类关系非常密切，已成为革兰氏阳性细菌研究的模式菌株之一。由于大部分 芽孢杆菌菌株对人无害或有益，且其拥有诸多优于其他微生物的性质，因此芽孢杆菌在人 类生活和生产实践如工业、医药业、农业等有着非常广泛的应用。在工业方面，酶制剂是微 生物发酵产业的重要组成部分，芽孢杆菌可以大量的分泌纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，是 工业酶制剂生产中应用最广泛的菌种之一。
[0004] 枯草芽孢杆菌在生物防治方面具有一定的抗生作用，即指一种微生物通过产生某 些次生物质来抑制或杀灭其它微生物。表面活性素(sufaction)是其次级生物物中一种典 型的非核糖体合成的脂肽类抗生素，它本身具有一定的抗细菌和病毒能力，并在细菌群体 感应效应中充当一种信号物质，其浓度随着细菌细胞密度的增加而不断的增加。其机理主 要在于细菌群体密度增加时，通过相应增加 ComX和CSF信息素的表达来激活调节ComP-ComA 双组份调节系统，从而磷酸化的ComA激活表面活性素的启动子Psrf，促使其启动子后面的 基因转录表达表面活性素。
[0005] 因此，利用表面活性素启动子Psrf，使其通过自诱导高效表达我们所需要的海藻 糖合成酶来制备海藻糖来说具有重要的研究价值和海藻糖广泛应用于食品医疗行业来说 具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方 法与应用。
[0007] 本发明技术方案如下：
[0008] 一种重组载体，其特征在于，在穿梭质粒pMA5-HpaII的两个酶切位点EcoRI和KpnI 之间插入ComQ-ComX基因，在两个酶切位点BamHI和MluI之间插入通过重叠 PCR将Psrf启动 子基因、Tat型信号肽PhoD基因和海藻糖合成酶基因 TreS连接起来的连接片段；
[0009] 所述的ComQ-ComX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；自诱导型启动子Psrf核 苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;Tat型信号肽PhoD核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;海藻糖合 成酶基因 TreS核苷酸序列如SEQ ID NO.4。
[0010] 上述重组载体的制备方法，步骤如下：
[0011] (i)提取枯草芽孢杆菌subtilisl68菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到 ComQ-ComX片段；
[0012] 所述的PCR引物序列如下：
[0013] ComQ-ComX-F(上游引物）：5' -GAATTCTATGCAATGAAAATTTCGTGAAAAAG-3' ；
[0014] ComQ-ComX-R(下游引物）：5 ' -GGTACCTTAATCACCCCATTGACGGGTT-3 ' ；
[0015]其中下划线分别为酶切位点EcoRI和KpnI;
[0016] 所述的PCR扩增体系如下：
[0017] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，CldH 2O补足50μ1;
[0018] 所述的PCR扩增程序如下：
[0019] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，54°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸IOmin，-20 °C保存；
[0020] (ii)将步骤（i)制得的ComQ-ComX片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-ComQ-ComX质粒载体；然后用限制性内切酶EcoRI和KpnI对pTOPO-T-ComQ-ComX和pMA5-HpaII质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒pMA5-ComQ-ComX;
[0021 ] 所述连接pT0P0-T vector体系如下，总体系10μ1:
[0022] ComQ-ComX片段4μ1;ρΤ0Ρ0_Τ vector ΙμL; 10 XEnhancer 1μ1;(ΜΗ2〇 4μ1;
[0023] 反应条件:混合均匀，室温连接5min;
[0024] 所述双酶切体系如下，总体系40μ1:
[0025] EcoRI 内切酶 2μ1;ΚρηΙ 内切酶2以1;10\]?1〇&(11即1311打61441卬1'0?0-1'-(：〇11^-ComX 20μ1; CldH2O 12μ1;
[0026] 反应条件:37 °C恒温4h酶切；
[0027]所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μ1:
[0028] Τ4连接酶lyl;10XT4buffer ΙμL;双酶切后pMA5-HpaII质粒片段；双酶切后 pTOPO-T-ComQ-ComX 质粒片段；
[0029]反应条件：16 °C连接过夜；
[0030] (i i i)以枯草芽孢杆菌subt i I is 168菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到启 动子基因片段Psrf-I和Psrf-2,通过重叠 PCR技术将两个片段连接起来得到Psrf片段；
[0031]所述的PCR引物序列如下：
[0032] Psrf-I-F(上游引物）：
[0033] 5，-GGATCC ATCGACAAAAATGTCATGAAAGAATCG-3，；
[0034] Psrf-H(下游引物）：
[0035] 5 ' -A4CGAAAAATGGGTGAAAAGTTTCATGCGGGATGCCGAAA-3 '；
[0036] Psrf-2-F(上游引物）：
[0037] 5 ' -AAACTTTTCACCCATTTTTCGlIOAClAAAACATTTTTTTCATTlMMrGAACGGTAGA-3，；
[0038] Psrf-2-R(下游引物）：
[0039] 5 '-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATATTGTCATACCTCCCCTAA-3 '；
[0040]其中单下划线为酶切位点BamHI，双下划线为启动子Psrf的-35和-10关键区域，_ 35区由原来的"GTGATA"突变为"TTGACT"，-10区由原来的"TAAACT"突变为"TATAAT" ；该关键 区域的突变为了提高启动子Psrf的启动转录表达；
[0041 ] 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0042] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，用CldH 2O补足50μ1;
[0043] 所述的PCR扩增程序如下：
[0044] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 IOmin，-20 °C 保存；
[0045] 所述重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0046] 初次扩增体系为25yl:Psrf-l片段4yl;Psrf-2片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1;
[0047] 初次扩增程序如下：
[0048] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，5 个循环；
[0049] 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-I-F 2μ1;下游引物Psrf-2-R2yl;2XTaq PCRMasterMix 12.5yl；ddH20 8.5μ1；
[0050]所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0051 ] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸IOmin，-20 °C保存；
[0052] (iv)以枯草芽孢杆菌subtilisl68菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到信号 肽PhoD基因片段；
[0053] 所述的PCR引物序列如下：
[0054] PhoD-F(上游引物）：5'-TGACAATATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGGG-3' ；
[0055] PhoD-R (下游引物）：5 ' -CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG-3 ' ；
[0056] 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0057] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，用CldH 2O补足50μ1;
[0058] 所述的PCR扩增程序如下：
[0059] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，59°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 IOmin，-20 °C 保存；
[0060] (V)以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶基因片段 TreS；
[0061 ]所述的PCR引物序列如下：
[0062] TreS-F(上游引物）：5，-GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC-3,；
[0063] Tre S-R (下游引物）：5，-ACGCGTTCAAACATGCCCGCTGC-3，；
[0064]其中单下划线为酶切位点MluI;
[0065] 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0066] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，用CldH 2O补足50μ1;
[0067] 所述的PCR扩增程序如下：
[0068] 95°C预变性5min; 95°C变性30sec，54°C退火30sec，72°C延伸2minl0sec，30个循 环；72 °C 延伸 I Omin，-20 °C 保存；
[0069] (vi)将步骤(iii)制得的Psrf启动子片段和步骤(iv)制得的PhoD信号肽片段通过 重叠 PCR技术进行重叠 PCR扩增，扩增得到Psrf-PhoD片段；
[0070] 所述的重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0071] 初次扩增体系为25μ1:Psrf片段4μ1;PhoD片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ l；ddH20 4.5μ1；
[0072] 初次扩增程序如下：
[0073] 95。0预变性5111；[11;94。(^变性3086(3,62。(^退火3086(3,72。(^延伸1111；[111086(3,5个循环；
[0074] 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-I-F 2μ1;下游引物PhoD-R2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0075] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0076] 95°〇预变性5111；[11;95°0变性308 6(3,56°0退火308 6(3,72°0延伸1111；[111086(3,30个循 环；72 °C 延伸 IOmin，-20 °C 保存；
[0077] (vii)将步骤(V)制得的TreS片段和步骤(vi)制得的Psrf-PhoD片段通过重叠 PCR 技术进行重叠 PCR扩增，扩增得到Psrf-PhoD-TreS片段；
[0078] 所述的重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0079] 初次扩增体系为25μ1:Psrf-PhoD片段4μ1;TreS片段4μ1; 2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1;
[0080] 初次扩增程序如下：
[0081 ] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，62°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，5 个循环；
[0082] 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-I-F 2μ1;下游引物TreS-R 2μ1;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0083] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0084] 95 cC 预变性 5min; 95 cC 变性 30sec，56Γ 退火 30sec，72 cC 延伸 4min，30 个循环；72Γ 延伸IOmin，-20 °C保存；
[0085] (viii)将步骤（vii)制得的Psrf-PhoD-TreS片段连接到pT0P0-T vector上，制得 pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS;然后用限制性内切酶 BamHI 和 MluDtpTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 和步骤（i i)制得的pMA5-ComQ-ComX质粒分别进行酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组 质粒 Psrf-PhoD-TreS-pMA5_ComQ-ComX质粒；
[0086] 所述连接pT0P0-T vector体系如下，总体系10μ1:
[0087] Psrf-PhoD-TreS片段4μ1;ρΤ0Ρ0_Τ vector ΙμL; 10 X Enhancer 1μ1;(ΜΗ2〇 4μ1;
[0088] 反应条件:混合均匀，室温连接5min;
[0089] pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 和 pMA5-ComQ-ComX 质粒进行 BamHI 单酶切的酶切体系为 40μ1 ：
[0090] 内切酶BamHI 2μ1; 10 X K buffer 4μ1; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS或pMA5-ComQ-ComX 质粒 20μ1; CldH2O 14μ1;
[0091] 反应步骤:30°C酶切4h，然后琼脂糖核酸电泳回收酶切后的pTOPO-T-Psrf-PhoD-Tr e S线性质粒和pMA5 -ComQ-ComX线性质粒；
[0092] 酶切后 pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 线性质粒和 pMA5-ComQ-ComX 线性质粒进行 MluI 单酶切的酶切体系为40μ1:
[0093] 内切酶MluI 2μ1; 10 X H buffer 4μ1; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS线性质粒或ρΜΑ5-ComQ-ComX 线性质粒 20μ1; CldH2O 14μ1;
[0094] 反应步骤:37°C酶切4h，然后琼脂糖核酸电泳回收双酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS质粒片段和双酶切后pMA5-ComQ-ComX质粒片段；
[0095]所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μ1:
[0096] Τ4连接酶ΙμL; 10 X T4buffer ΙμL;双酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS质粒片段； 双酶切后pMA5-ComQ_ComX质粒片段；
[0097]反应条件：16 °C连接过夜。
[0098]所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的Tat型信号肽PhoD片段来源于 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的磷酸二酯酶基因信号肽DNA片段；
[0099] 根据本发明优选的，所述步骤（V)中的恶臭假单胞杆菌为恶臭假单胞杆菌 (Pseudomonas putida)KT2440〇
[0100] -种自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法，包括如下步骤：
[0101] (1)将上述重组质粒载体转化到枯草芽孢杆菌WB800n中，制得重组枯草芽孢杆菌；
[0102] (2)通过PCR扩增技术，扩增枯草芽孢杆菌168基因组abrB基因上下游同源臂，即上 游片段ABf和下游片段ABb;
[0103] 所述abrB基因的上游片段和下游片段的PCR扩增引物序列如下：
[0104] ABf-F:5，-CGGCATCTTGAAACCTCCT-3，；
[0105] ABf-R:5 '-TTTTATTAAAGTTCATTCTCCTCCCAAGAGATACTTA-3 '；
[0106] ABb-F:5 '-TAATGACTGGCTTTTATAATCATTTCTTGTACAAAAAACGTTC-3 '；
[0107] ABb-R:5 '-TCTTTTACGGTTTTCTCAACAGA-3 '；
[0108] (3)通过PCR扩增技术，扩增穿梭质粒PHT01含有的氯霉素抗性基因 Cnf片段；
[0109] 所述氯霉素抗性基因 Cnf片段的PCR扩增引物序列如下：
[0110] Cmr-F：5'-CTCTTGGGAGGAGAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACA-3'；
[0111] Cmr-R:5，-ACAAGAAATGATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTAT-3，；
[0112] (4)通过重叠 PCR扩增技术，将步骤(2)扩增的ABf片段与步骤(3)扩增的Cnf片段进 行重叠 PCR，扩增得到ABf-Cnf片段；
[0113] (5)通过重叠 PCR扩增技术，将步骤(2)扩增的ABb片段与步骤(4)扩增的ABb-Cnf片 段进行重叠 PCR，扩增得到ABf-Cnf-ABb片段；
[0114] 所述的abrB基因上游片段ABf核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，abrB基因下游片段 AKd核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氯霉素抗性基因 Cnf核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0115] (6)将步骤(5)制得的片段ABf-Cnf-ABb片段转化步骤（1)制得的重组枯草芽孢杆 菌，筛选有氯霉素抗性的克隆转化子，制得自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌。
[0116] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，转化的步骤如下：
[0117] 将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，卡那霉素筛选，即得。
[0118] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系为50μ1:
[0119] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，上游引物（10ymol/L)2.5yl，下游引物（10μπιο1/υ 2.5μ1，模板 2.5μ1，用 CldH2O 补足 50μ1;
[0120] 所述的PCR扩增程序如下：
[0121] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 IOmin，-20 °C 保存。
[0122] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，PCR扩增体系为50μ1:
[0123] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，上游引物（10ymol/L)2.5yl，下游引物（10μπιο1/υ 2.5μ1，模板 2.5μ1，用 CldH2O 补足 50μ1;
[0124] 所述的PCR扩增程序如下：
[0125] 95 °C 预变性 5min; 95 °C 变性 30sec，51°C 退火 30sec，72 °C 延伸 40sec，30 个循环；72 。(:延伸 I Omin，-20 °C 保存；
[0126] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，ABb-Cnf片段的重叠 PCR扩增体系如下：总体 系50μ1;
[0127] 初次扩增体系为25yl:ABf片段4yl;Cmr片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1; ddH20 4.5μ1；
[0128] 初次扩增程序如下：
[0129] 95°0预变性5111；[11;94°(^变性30860，58°(^退火30860，72°(^延伸1111；[1110860，5个循环；
[0130] 补充扩增体系为25μ1:上游引物ABf-F 2μ1;下游引物Cmlr-I^yldXTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0131 ]所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0132] 95°C预变性5min;95°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸IminlOsec，30个循 环；72 °C 延伸 IOmin，-20 °C 保存。
[0133] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，ABf-Cmi-ABb片段的重叠 PCR扩增体系如下： 总体系50μ1;
[0134] 初次扩增体系为25yl:ABf-Cmr片段4yl;ABb片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1;
[0135] 初次扩增程序如下：
[0136] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin30sec，5 个循环；
[0137] 补充扩增体系为25μ1:上游引物ABf-F 2μ1;下游引物ABb-R 2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0138] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0139] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin30sec，30 个循 环；72 °C 延伸 IOmin，-20 °C 保存。
[0140]根据本发明优选的，所述步骤(6)中，ABf-Cnf-ABb片段转化重组枯草芽孢杆菌的 步骤如下：
[0141] 将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，氯霉素筛选，即得。
[0142] 所述步骤(6)中筛选有氯霉素抗性的克隆转化子的步骤为本领域常规技术，具体 如下：
[0143] 在含有抗生素平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素的液 体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证， 将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，得到目的条 带。
[0144] 利用上述制备方法制得的自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌。
[0145] 自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
[0146] 原理说明
[0147] 本发明不需要添加任何诱导剂诱导海藻糖合成酶的分泌表达，通过利用枯草芽孢 杆菌的表面活性素启动子Psrf插入到质粒pMA5-HpaII质粒的BamHI和Mlu頂每切位点之间， 作为自诱导目的蛋白的启动子，然后将信号肽PhoD片段和目的蛋白海藻糖合成酶TreS片段 克隆到启动子Psrf的下游，在细菌群体感应系统调控条件下，随着培养液中细菌细胞密度 的增加，该质粒的启动子Psrf自动诱导海藻糖合成酶的分泌表达。为了提高启动子Psrf的 诱导效率，在质粒 PMA5的EcoRI和KpnI之间插入ComQ-ComX基因片段(整个基因含有自身的 启动子，可自发启动表达），提高ComQ-ComX基因的拷贝数，增加胞外信息素 ComX的含量，继 而增加对ComP-ComA双组份调节系统激活，提高对启动子Psrf的诱导效率。同时通过双交叉 互换将氯霉素抗性基因 Cmlr替换枯草芽孢杆菌基因组中的abrB基因片段，减少了对spoOH基 因的抑制表达（即sigma因子σ Η表达量提高），继而提高基因 phrC产更多的CSF信息素来抑制 rapC蛋白的活性，减少rapC蛋白对ComP-ComA双组份调节系统抑制，提高对启动子Psrf的诱 导效率，因此这样一种自诱导强化型的海藻糖合酶分泌表达系统提高了海藻糖合成酶在枯 草芽孢杆菌的分泌表达。
[0148] 有益效果
[0149] 1、本发明采用枯草芽孢杆菌表面活性素启动子Psrf和海藻糖合成酶融合后进行 诱导表达的效果显著优于其它诱导型表达的效果；
[0150] 2、本发明无需添加任何的诱导剂进行诱导海藻糖合成酶的分泌表达，这符合了食 品安全级别酶制剂的制备，海藻糖合成酶在食品医疗行业中能够广泛应用；
[0151] 3、本发明随着培养液中细菌细胞密度的不断增加，启动子Psrf自发诱导海藻糖合 成酶的分泌表达，可通过高密度发酵提高海藻糖合成酶的分泌表达产量，较符合工业化制 备海藻糖合成酶；
[0152] 4、本发明通过基因工程手段增加了ComX和SCF信息素表达量，提高了对启动子 Psrf的诱导启动表达，完善成为一种自诱导强化型的海藻糖合成酶分泌表达系统，同时减 少了培养成本。
[0153] 5、本发明使用Tat型转运信号肽PhoD，相对于Sec信号肽来说，该信号肽具有促进 海藻糖合成酶折叠完全功能，并将其转运到胞外，减少了胞外蛋白酶对其产生降解的作用。
【附图说明】
[0154] 图I pMA5-ComQ_ComX载体的构建示意图；
[0155] 图2 Psrf-PhoD-TreS-pMA5_ComQ-ComX载体的构建不意图；
[0156] 图3 abrB基因敲除策略示意图；
[0157] 图4筛选卡那霉素抗性Bacillus subtilis WB800n单菌落实物图。
【具体实施方式】
[0158] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0159] 生物材料来源：
[0160] 枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis)购自杭州宝赛生物有限公司
[0161 ] 恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)KT2440购自中国工业微生物菌种保藏中 心(CICC);
[0162] 穿梭质粒pMA5_HpaII购自Biovector NTCC保藏中心；
[0163] 枯草芽孢杆菌WB800n购自杭州宝赛生物有限公司；
[0164] 穿梭质粒PHTOl购自杭州宝赛生物有限公司；
[0165] pTOPO-T vector购自艾德莱生物科技有限公司。
[0166] 实施例1
[0167] 将来源枯草芽孢杆菌168的基因组的ComQ-ComX基因片段构建到穿梭质粒pMA5-Hpa II上，得到重组质粒pMA5-ComQ-ComX;
[0168] (i)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，分别设计引物ComQ-ComX-F和ComQ-ComX-R，PCR 扩增得到ComQ-ComX片段；
[0169] 所述的PCR引物序列如下：
[0170] ComQ-ComX-F(上游引物）：5 ' -GAATTCTATGCAATGAAAATTTCGTGAAAAAG-3 ' ；
[0171] ComQ-ComX-R(下游引物）：5 ' -GGTACCTTAATCACCCCATTGACGGGTT-3 ' ；
[0172] 其中下划线分别为酶切位点EcoRI和KpnI;
[0173] 所述的PCR扩增体系如下：
[0174] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，CldH 2O补足50μ1;
[0175] 所述的PCR扩增程序如下：
[0176] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，54°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸IOmin，-20 °C保存；
[0177] (ii)将步骤（i)制得的ComQ-ComX片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-ComQ-ComX质粒载体；然后用限制性内切酶EcoRI和KpnI对pTOPO-T-ComQ-ComX和pMA5-HpaII质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，制得重组质粒 PMA5-ComQ-ComX；
[0178] 所述连接pTOPO-T vector体系如下，总体系10μ1:
[0179] ComQ-ComX片段4μ1 ;pT0P0_T vector ΙμL; 10 XEnhancer ΙμL ;ddH2〇 4μ1;
[0180] 反应条件:混合均匀，室温连接5min;
[0181] 所述双酶切体系如下，总体系40μ1:
[0182] EcoRI 内切酶 2μ1;ΚρηΙ 内切酶2以1;10\]?1〇&(11即1311打61441卬1'0?0-1'-(：〇11^-ComX 20μ1; CldH2O 12μ1;
[0183] 反应条件:37 °C恒温4h酶切；
[0184] 所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μ1:
[0185] Τ4连接酶lyl;10XT4buffer ΙμL;双酶切后pMA5-HpaII质粒片段；双酶切后 pTOPO-T-ComQ-ComX 质粒片段；
[0186] 反应条件:16 °C连接过夜；
[0187] 经检测，所述的ComQ-ComX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0188] 实施例2
[0189] 以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，PCR扩增得到表面活性素启动子Psrf片段和信 号肽PhoD片段，恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida KT2440)基因组为模板，PCR扩增得 到海藻糖合成酶基因 TreS片段，通过重叠 PCR技术，将三个片段连接得到Psrf-PhoD-TreS片 段；
[0190] (i i i)以枯草芽孢杆菌subt i I is 168菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到启 动子基因片段Psrf-I和Psrf-2,通过重叠 PCR技术将两个片段连接起来得到Psrf片段；
[0191] 所述的PCR引物序列如下：
[0192] Psrf-I-F(上游引物）：
[0193] 5，-GGATCC ATCGACAAAAATGTCATGAAAGAATCG-3，；
[0194] Psrf-H(下游引物）：
[0195] 5 ' -A4CGAAAAATGGGTGAAAAGTTTCATGCGGGATGCCGAAA-3 '；
[0196] Psrf-2-F(上游引物）：
[0197] 5 ' -AAACTTTTCACCCATTTTTCG3 TGACTAAAACATTTTTTTCATTTATAATGAACGGTAGA-3，；
[0198] Psrf-2-R(下游引物）：
[0199] 5 '-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATATTGTCATACCTCCCCTAA-3 '；
[0200]其中单下划线为酶切位点BamHI，双下划线为启动子Psrf的-35和-10关键区域，_ 35区由原来的"GTGATA"突变为"TTGACT"，-10区由原来的"TAAACT"突变为"TATAAT" ；该关键 区域的突变为了提高启动子Psrf的启动转录表达；
[0201] 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0202] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，用CldH 2O补足50μ1;
[0203] 所述的PCR扩增程序如下：
[0204] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 IOmin，-20 °C 保存；
[0205] 所述重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0206] 初次扩增体系为25yl:Psrf-l片段4yl;Psrf-2片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1;
[0207] 初次扩增程序如下：
[0208] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，5 个循环；
[0209] 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-I-F 2μ1;下游引物Psrf-2-R 2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5yl；ddH20 8.5μ1；
[0210] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0211] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸IOmin，-20 °C保存；
[0212] 经检测，自诱导型启动子Psrf核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0213] (iv)以枯草芽孢杆菌subtilisl68菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到信号 肽PhoD基因片段；
[0214]所述的PCR引物序列如下：
[0215] PhoD-F(上游引物）：5，-TGACAATATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGGG-3,；
[0216] PhoD-R(下游引物）：5'-CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG-3' ；
[0217] 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0218] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，用CldH 2O补足50μ1;
[0219] 所述的PCR扩增程序如下：
[0220] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，59°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 IOmin，-20 °C 保存；
[0221] 经检测，Tat型信号肽PhoD核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0222] (V)以恶臭假单胞杆菌为恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)KT2440基因组为 模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶基因片段TreS;
[0223] 所述的PCR引物序列如下：
[0224] TreS-F(上游引物）：5，-GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC-3,；
[0225] TreS-R(下游引物）：5 ' -ACGCGTTCAAACATGCCCGCTGC-3 ' ；
[0226] 其中单下划线为酶切位点MluI;
[0227] 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0228] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度lOymol/L的上游引物2·5μ1，浓度lOymol/L的 下游引物2.5μ1，模板2.5μ1，用CldH 2O补足50μ1;
[0229] 所述的PCR扩增程序如下：
[0230] 95°C预变性5min; 95°C变性30sec，54°C退火30sec，72°C延伸2minl0sec，30个循 环；72 °C 延伸 I Omin，-20 °C 保存；
[0231] 经检测，海藻糖合成酶基因 TreS核苷酸序列如SEQ ID NO.4;
[0232] (vi)将步骤(iii)制得的Psrf启动子片段和步骤(iv)制得的PhoD信号肽片段通过 重叠 PCR技术进行重叠 PCR扩增，扩增得到Psrf-PhoD片段；
[0233] 所述的重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0234] 初次扩增体系为25μ1:Psrf片段4μ1;PhoD片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ l；ddH20 4.5μ1；
[0235] 初次扩增程序如下：
[0236] 95°0预变性5111；[11;94°(^变性3086。，62°(^退火3086。，72°(^延伸1111；[111086。，5个循环；
[0237] 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-I-F 2μ1;下游引物PhoD_R2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5ul;ddH2〇 8.5μ1;
[0238] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0239] 95°C预变性5min;95°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸IminlOsec，30个循 环；72 °C 延伸 IOmin，-20 °C 保存；
[0240] (vii)将步骤(V)制得的TreS片段和步骤(vi)制得的Psrf-PhoD片段通过重叠 PCR 技术进行重叠 PCR扩增，扩增得到Psrf-PhoD-TreS片段；
[0241] 所述的重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1:
[0242] 初次扩增体系为25μ1:Psrf-PhoD片段4μ1;TreS片段4μ1; 2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1;
[0243] 初次扩增程序如下：
[0244] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，62°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，5 个循环；
[0245] 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-I-F 2μ1;下游引物TreS-R 2μ1;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0246] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0247] 95 °C 预变性 5min; 95 °C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72 °C 延伸 4min，30 个循环；72°C 延伸I Omin，-20 °C保存；
[0248] 实施例3
[0249] (viii)将步骤（vii)制得的Psrf-PhoD-TreS片段连接到pT0P0-T vector上，制得 pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS;然后用限制性内切酶 BamHI 和 MluDtpTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 和步骤（i i)制得的pMA5-ComQ-ComX质粒分别进行酶切，然后采用T4连接酶连接，转化大肠 杆菌 DH5a，制得重组质粒 Psrf-PhoD-TreS-pMA5_ComQ-ComX 质粒；
[0250] 所述连接pT0P0-T vector体系如下，总体系10μ1:
[0251] Psrf-PhoD-TreS片段4μ1;ρΤ0Ρ0_Τ vector ΙμL; 10 X Enhancer 1μ1;(ΜΗ2〇 4μ1;
[0252] 反应条件:混合均匀，室温连接5min;
[0253] pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 和 pMA5-ComQ-ComX 质粒进行 BamHI 单酶切的酶切体系为 40μ1 ：
[0254] 内切酶BamHI 2μ1; 10 X Kbuffer 4μ1; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS或pMA5-ComQ-ComX 质粒 20μ1; CldH2O 14μ1;
[0255] 反应步骤：30°C酶切4h，然后琼脂糖核酸电泳回收酶切后的pTOPO-T-Psrf-PhoD-Tr e S线性质粒和pMA5 -ComQ-ComX线性质粒；
[0256] 酶切后 pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 线性质粒和 pMA5-ComQ-ComX 线性质粒进行 MluI 单酶切的酶切体系为40μ1:
[0257] 内切酶MluI 2μ1; 10 X H buffer 4μ1; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS线性质粒或ρΜΑ5-ComQ-ComX 线性质粒 20μ1; CldH2O 14μ1;
[0258] 反应步骤:37°C酶切4h，然后琼脂糖核酸电泳回收双酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS质粒片段和双酶切后pMA5-ComQ-ComX质粒片段；
[0259] 所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μ1:
[0260] Τ4连接酶ΙμL; 10 X T4buffer ΙμL;双酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS质粒片段； 双酶切后pMA5-ComQ_ComX质粒片段；
[0261] 反应条件:16 °C连接过夜。
[0262] 实施例4
[0263] 通过电转化方法将重组质粒Psrf-PhoD-TreS-pMA5_ComQ-ComX转化到枯草芽抱杆 菌WB800n菌株中，经卡那霉素筛选，即得含有重组质粒Psrf-PhoD-TreS-pMA5-ComQ-ComX的 自诱导重组菌株。
[0264] 枯草芽孢杆菌WB800n感受态制备与转化方法：
[0265] 接菌种于2ml溶液A中，37°C，200rpm培养IOh;将2ml培养后的菌液添加到98ml溶液 A中，37°C，200rpm培养4h;将菌体冰水浴15min，后5000rpm，4°C离心10min收集菌体;用20ml 预冷的溶液B重悬，如此漂洗3次;将洗涤后的菌体重悬于600μ1溶液C中，混匀后按60μ1每管 分装于预冷的EP管中；
[0266] 电转化方法:将质粒Psrf-PhoD-TreS-pMA5-ComQ-ComX加入感受态细胞中并冰上 预冷IOmin，后加入预冷的电转化中；感受态细胞在2500V、25uF的电击后，迅速加入SOC培养 基约 500μ1，再转至EP管中，37°C，200rpm复苏3h后涂布于含有卡那霉素的平板上。挑单菌落 筛选即得最终含有重组质粒Psrf-PhoD-TreS-pMA5_ComQ-ComX的自我诱导重组菌株。
[0267] 所述的溶液A(100mL)组分如下：
[0268] 蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCl lg，山梨醇9g，pH值为7.0;
[0269] 溶液B(100mL)组分如下：
[0270]山梨醇9g，甘露醇9.25g，葡萄糖IOg;
[0271] 溶液C(IOml)组分如下：
[0272] 9ml 溶液 B+lml 甘油；
[0273] 复苏培养基SOC培养基（100mL)组分如下：
[0274] 胰蛋白胨2g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.05g，氯化钾0.0186g，氯化镁0.095g，硫酸镁 0.128，葡萄糖0.36 8，？田直7.0±0.2;
[0275] 含有卡那霉素的平板(100mL)组分如下：
[0276]蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCl lg，琼脂粉2g，250yg卡那霉素；
[0277] 实施例5
[0278] 通过重叠 PCR技术构建重组片段ABb-Cmi-ABfjBlKABf为枯草芽孢杆菌基因组的 abrB基因的同源臂，通过电转化方法将重组片段ABb-Cnf-ABf转化到含有质粒Psrf-PhoD-TreS-pMA5-ComQ-ComX的重组WB800n菌株，经氯霉素筛选即得到abrB基因得以敲除，质粒 PSrf-Ph〇D-TreS-pMA5-C〇mQ-C〇mX在枯草芽孢杆菌得以表达的自诱导强化型海藻糖合成酶 合成的重组WB800n菌株，具体步骤如下：
[0279] (I)通过PCR扩增技术，扩增枯草芽孢杆菌168基因组abrB基因上下游同源臂，即上 游片段ABf和下游片段ABb;
[0280]所述abrB基因的上游片段和下游片段的PCR扩增引物序列如下：
[0281] ABf-F:5 '-CGGCATCTTGAAACCTCCT-3 '；
[0282] ABf-R:5 '-TTTTATTAAAGTTCATTCTCCTCCCAAGAGATACTTA-3 '；
[0283] ABb-F:5 '-TAATGACTGGCTTTTATAATCATTTCTTGTACAAAAAACGTTC-3 '；
[0284] ABb-R:5 '-TCTTTTACGGTTTTCTCAACAGA-3 '；
[0285] PCR扩增体系为50μ1:
[0286] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，上游引物（10ymol/L)2.5yl，下游引物（10μπιο1/υ 2.5μ1，模板 2.5μ1，用 CldH2O 补足 50μ1;
[0287] 所述的PCR扩增程序如下：
[0288] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 IOmin，-20 °C 保存。
[0289] (II)通过PCR扩增技术，扩增穿梭质粒PHTOl含有的氯霉素抗性基因 Cnf片段；
[0290]所述氯霉素抗性基因 Cnf片段的PCR扩增引物序列如下：
[0291] Cnf-F:5 '-CTCTTGGGAGGAGAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACA-3 '；
[0292] Cmr-RiSj-ACAAGAAATGATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTAT-S'；
[0293] PCR扩增体系为50μ1:
[0294] 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，上游引物（10ymol/L)2.5yl，下游引物（10μπιο1/υ 2.5μ1，模板 2.5μ1，用 CldH2O 补足 50μ1;
[0295] 所述的PCR扩增程序如下：
[0296] 95 °C 预变性 5min; 95 °C 变性 30sec，51°C 退火 30sec，72 °C 延伸 40sec，30 个循环；72 。(:延伸 I Omin，-20 °C 保存。
[0297] (III)通过重叠 PCR扩增技术，将步骤（I)扩增的ABf片段与步骤（II)扩增的Cnf片 段进行重叠 PCR，扩增得到ABf-Cnf片段；
[0298] ABb-Cnf片段的重叠 PCR扩增体系如下：总体系50μ1;
[0299] 初次扩增体系为25yl:ABf片段4yl;Cmr片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1; ddH20 4.5μ1；
[0300] 初次扩增程序如下：
[0301 ] 95°0预变性5111；[11;94°(^变性3086。，58°(^退火3086。，72°(^延伸1111；[111086。，5个循环；
[0302] 补充扩增体系为25μ1:上游引物ABf-F 2μ1;下游引物Cmlr-I^yldXTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0303] 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0304] 95°C预变性5min;95°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸IminlOsec，30个循 环；72 °C 延伸 IOmin，-20 °C 保存。
[0305] (IV)通过重叠 PCR扩增技术，将步骤（I)扩增的ABb片段与步骤（III)扩增的ABb- Cnf片段进行重叠 PCR，扩增得到ABf-Cmlr-ABb片段；
[0306] 所述的abrB基因上游片段ABf核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，abrB基因下游片段 AKd核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氯霉素抗性基因 Cnf核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示； [0307] ABf-Cnf-Am5片段的重叠 PCR扩增体系如下：总体系50μ1;
[0308] 初次扩增体系为25yl:ABf-Cmr片段4yl;ABb片段4μ1;2 XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1;
[0309] 初次扩增程序如下：
[0310] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin30sec，5 个循环；
[0311] 补充扩增体系为25μ1:上游引物ABf-F 2μ1;下游引物ABb-R2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8· 5μ1;
[0312]所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下：
[0313] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin30sec，30 个循 环；72 °C 延伸 I Omin，-20 °C 保存。
[0314] (V)将步骤（IV)制得的片段ABf-Cnf-ABb片段转化重组枯草芽孢杆菌，筛选有氯霉 素抗性的克隆转化子，制得自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌；
[0315] ABf-Cnf-ABb片段转化重组枯草芽孢杆菌的步骤如下：
[0316] 将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，氯霉素筛选，即得。
[0317] 所述筛选有氯霉素抗性的克隆转化子的步骤如下：
[0318] 在含有抗生素平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素的液 体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证， 将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，得到目的条 带。
[0319]含有抗生素平板(100mL)组分如下：
[0320]蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCl lg，琼脂粉2g，250ug氯霉素；
[0321] 实施例6
[0322] 海藻糖合成酶的生产，操作步骤如下：
[0323] 1) 一级种的制备:从含卡那霉素20ug/mL的LB平板上转接实施例5制得的自诱导强 化型重组枯草芽孢杆菌单菌落在3mL LB液体培养基37°C、200rpm培养过夜，所得的菌种为 一级种；
[0324] 2)二级种的制备:一级种接种于含卡那霉素20ug/mL的SOOmL LB液体培养基，于37 °C、200rpm培养至OD6QQ为0 · 9(4 · 5小时）；
[0325] 3)三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37°C，以柠檬酸、NaOH控 制pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20-30%，培养至OD6qq为0.9(4.5小时）；
[0326] 4)生产罐发酵:将三级种接种到3吨发酵罐中，LB液体培养基，36-37Γ，通风搅拌， 溶氧控制在20-30%，以柠檬酸、NaOH控PH6-8，当培24-26小时，1000 Og离心除菌，用截留分 子量5000-10000超滤膜浓缩上清液后，即得海藻糖合成酶浓缩原液。
[0327] 5)海藻糖合成酶酶活的测定按如下方法进行：
[0328] 取ImL适当稀释的酶液+ImL 60%麦芽糖底物（用50mM pH6.5磷酸缓冲液配制），混 勾后在37°C反应30min，反应液1000 Orpm离心3min取上清。
[0329] 用按还原糖测定方法(3,5_二硝基水杨酸比色法)测定还原糖含量。
[0330] 对照则取 1ml 60%+lml 50mM pH6.5磷酸缓冲液，37°C反应30min，10000rpm离心 3min取上清，同上方法测定还原糖含量。
[0331]活力单位(U)定义为Iml酶液在pH6.5,37°C条件下，每分钟转化Iug麦芽糖为非还 原糖为一个海藻糖合成酶活力单位。计算方法如下：
[0332] U(μg/ml .min) = (Vi XM X (0Di-0D2)/0Di)/(T X V2) = (Iml X lOOmg/ml X (ODi-0D2)/0DiX 1000)/(30minX lml)
[0333] V1:底物体积(ml)，V2:参加反应的酶液体积(ml)，M:底物溶度(mg/ml)，0D 1:对照样 测还原糖时的吸光值，OD2:样品测还原糖的吸光值，1000: mg转化成yg的系数，T:酶反应时 间(min)〇
[0334] 经测定，发酵原液离心后，各枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵表达的最高酶活(包 括发酵液中已经转化完的海藻糖部分)见表1:
[0335]表 1
[0337] 结果分析：
[0338] 发明人通过研究发现，σΗ因子是phrC基因转录的重要sigma因子，phrC基因翻译表 达的CSF蛋白是诱导启动子Psrf启动表达的重要信息素。abrB是枯草芽孢杆菌中重要的全 局调控因子之一，它调控的是对数期与稳定期过渡阶段的一些基因的表达，而σ Η因子的表 达却受到abrB的负调控，abr B基因的缺失更有利于启动子Psr f的高效启动表达。通过对 已13池基因进行敲除的^380011[?81；1^-?1100-1>63-。]\^5-(]〇111( >)-(]〇1]1?(] + [八313池]菌株自诱导表 达海藻糖合成酶效果高于未对abrB基因进行敲除的??800n[Psrf-PhoD-TreS-pMA5-ComQ-C OmX] 菌株自诱导表达效果，从而验证了该发现，为后续海藻糖合酶的工业生产奠定了基 础。
【主权项】
1. 一种重组载体，其特征在于，在穿梭质粒pMA5-HpaII的两个酶切位点EcoRI和ΚρηΙ之 间插入ComQ-ComX基因，在两个酶切位点BamHI和Mlul之间插入通过重叠 PCR将Psrf启动子 基因、Tat型信号肽PhoD基因和海藻糖合成酶基因 TreS连接起来的连接片段； 所述的ComQ-ComX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；自诱导型启动子Psrf核苷酸 序列如SEQ ID NO.2所示;Tat型信号肽PhoD核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;海藻糖合成酶 基因 TreS核苷酸序列如SEQ ID NO.4。2. 权利要求1所述的重组载体的制备方法，其特征在于，步骤如下： (i)提取枯草芽孢杆菌subti 1 isl68菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到ComQ-ComX片段； 所述的PCR引物序列如下： ComQ-ComX-F:5 '-GAATTCTATGCAATGAAAATTTCGTGAAAAAG-3'； ComQ-ComX-R:5 '-GGTACCTTAATCACCCCATTGACGGGTT-3'； 其中下划线分别为酶切位点EcoRI和ΚρηΙ; 所述的PCR扩增体系如下： 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度ΙΟμ mol/L的上游引物2·5μ1，浓度ΙΟμ mol/L的下游 引物2.5μ1，模板 2.5μ1，ddH20 补足 50μ1; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，54°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸 10min，-2(TC 保存； (i i)将步骤（i)制得的ComQ-ComX片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-ComQ-ComX质粒载体;然后用限制性内切酶EcoRI和ΚρηΙ对pTOPO-T-ComQ-ComX和pMA5-HpaII质粒 进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒pMA5-ComQ-ComX; 所述连接pTOPO-T vector体系如下，总体系10μ1: ComQ-ComX片段4μ1; pTOPO-T vector ΙμL; 10 X Enhancer ΙμL; ddH2〇 4μ1; 反应条件:混合均匀，室温连接5min; 所述双酶切体系如下，总体系40μ1: EcoRI 内切酶2μ1; ΚρηΙ 内切酶2μ1; 10 X M loading buffer 4μ1; pTOPO-T-ComQ-ComX 20μ1;(ΜΗ2〇 12μ1; 反应条件:37 °C恒温4h酶切； 所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μ1: Τ4连接酶ΙμL; 10 X T4buffer ΙμL;双酶切后pMA5_HpaII质粒片段；双酶切后pTOPO-T-ComQ-ComX质粒片段； 反应条件：16 °C连接过夜； (i i i)以枯草芽孢杆菌subt i 1 i s 168菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到启动子 基因片段Psrf-Ι和Psrf-2，通过重叠 PCR技术将两个片段连接起来得到Psrf片段； 所述的PCR引物序列如下： Psrf-1-F： 5，-GGATCC ATCGACAAAAATGTCATGAAAGAATCG-3，； Psrf-1-R： 5' -aAcgaaaaatgggtgaaaagtttcatgcgggatgccgaaa-3'； Psrf-2-F： 5J -AAACTTTTCACCCATTTTTCGlIfi^lAAAACATTTTTTTCATTiMA^GAACGGTAGA-3、 Psrf-2-R： 5 '-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATATTGTCATACCTCCCCTAA-3 '； 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1: 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度ΙΟμ mol/L的上游引物2·5μ1，浓度ΙΟμ mol/L的下游 引物2.5μ1，模板 2.5μ1，用ddH20 补足 50μ1; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72°C 延 伸 10min，-20°C 保存； 所述重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1: 初次扩增体系为25yl:Psrf-l片段4yl;Psrf-2片段4yl;2XTaq PCR MasterMix 12·5μ l；ddH20 4.5μ1； 初次扩增程序如下： 95 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30sec，58 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 lmin，5 个循环； 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-1-F 2μ1;下游引物Psrf-2-R 2yl;2XTaq PCR MasterMix 12·5μ1;(ΜΗ2〇 8·5μ1; 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸 10min，-2(TC 保存； (iv) 以枯草芽孢杆菌subtilisl68菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到信号肽 PhoD基因片段； 所述的PCR引物序列如下： PhoD-F:5 '-TGACAATATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGGG-3 '； PhoD-R:5 '-CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG-3 '； 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1: 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度ΙΟμ mol/L的上游引物2·5μ1，浓度ΙΟμ mol/L的下游 引物2.5μ1，模板 2.5μ1，用ddH20 补足 50μ1; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，59°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72°C 延 伸 10min，-20°C 保存； (v) 以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶基因片段TreS; 所述的PCR引物序列如下： TreS-F(上游引物）：5'-GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC-3' ； TreS-R(下游引物）：5'-ACGCGTTCAAACATGCCCGCTGC-3' ； 所述的PCR扩增体系如下，总体系50μ1: 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，浓度ΙΟμ mol/L的上游引物2·5μ1，浓度ΙΟμ mol/L的下游 引物2.5μ1，模板 2.5μ1，用ddH20 补足 50μ1; 所述的PCR扩增程序如下： 95 °C 预变性 5min; 95 °C 变性 30sec，54°C 退火 30sec，72 °C 延伸 2minl0sec，30 个循环；72 。(:延伸 10min，-20°C 保存； (vi) 将步骤(iii)制得的Psrf启动子片段和步骤（iv)制得的PhoD信号肽片段通过重叠 PCR技术进行重叠 PCR扩增，扩增得到Psrf-PhoD片段； 所述的重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1: 初次扩增体系为25yl:Psrf片段4yl;PhoD片段4yl;2XTaq PCR MasterMix 12·5μ1; ddH20 4.5μ1； 初次扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，62°C 退火 30sec，72°C 延伸 IminlOsec，5 个循环； 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-1-F 2μ1;下游引物PhoD-R 2yl;2XTaq PCR MasterMix 12·5μ1;(ΜΗ2〇 8·5μ1; 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下： 95°(：预变性5111丨11;95°(：变性3〇86(3,56°(：退火3〇86(3,72°(：延伸1111丨111〇86(3,30个循环 ；72 。(:延伸 10min，-20°C 保存； (vii) 将步骤(v)制得的TreS片段和步骤(vi)制得的Psrf-PhoD片段通过重叠 PCR技术 进行重叠 PCR扩增，扩增得到Psrf-PhoD-TreS片段； 所述的重叠 PCR扩增体系如下，总体系50μ1: 初次扩增体系为25yl:Psrf-PhoD片段4yl;TreS片段4yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5 μ1;(ΜΗ2〇 4.5μ1; 初次扩增程序如下： 95 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30sec，62 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 4min，5 个循环； 补充扩增体系为25μ1:上游引物Psrf-1-F 2μ1;下游引物TreS-R 2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8 ·5μ1; 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 个循环；72°C 延伸 10min，-2(TC 保存； (viii) 将步骤（vii)制得的Psrf-PhoD-TreS片段连接到pTOPO-T vector上，制得 pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS;然后用限制性内切酶 BamHI 和 Mlul 对 pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 和步骤（i i)制得的pMA5-ComQ-ComX质粒分别进行酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组 质粒 Psrf-PhoD-TreS-pMA5_ComQ-ComX质粒； 所述连接pTOPO-T vector体系如下，总体系10μ1: Psrf-PhoD-TreS片段4μ1;ρΤ0Ρ0_Τ vector ΙμL; 10 X Enhancer 1μ1;(ΜΗ2〇 4μ1; 反应条件:混合均匀，室温连接5min; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 和 pMA5-ComQ-ComX 质粒进行 BamHI 单酶切的酶切体系为 40μ 1： 内切酶BamHI 2μ1; 10 XK buffer 4μ1; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS或pMA5-ComQ-ComX质 粒 20μ1;(ΜΗ2〇 14μ1; 反应步骤:30°C酶切4h，然后琼脂糖核酸电泳回收酶切后的pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 线性质粒和pMA5-ComQ-ComX线性质粒； 酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS线性质粒和pMA5-ComQ-ComX线性质粒进行Mlul单酶 切的酶切体系为40μ1: 内切酶Mlul 2μ1; 10 X H buffer 4μ1; pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS线性质粒或ρΜΑ5-ComQ-ComX 线性质粒 20μ1; ddH20 14μ1; 反应步骤:37°C酶切4h，然后琼脂糖核酸电泳回收双酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS 质粒片段和双酶切后pMA5-C〇mQ-C〇mX质粒片段； 所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μ1: Τ4连接酶ΙμL; 10 X T4buffer ΙμL;双酶切后pTOPO-T-Psrf-PhoD-TreS质粒片段;双酶切 后pMA5_ComQ-ComX质粒片段； 反应条件：16 °C连接过夜。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(v)中的恶臭假单胞杆菌为恶 臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)KT2440〇4. 一种自诱导强化型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将权利要求1所述重组质粒载体转化到枯草芽孢杆菌WB800n中，制得重组枯草芽孢 杆菌； (2) 通过PCR扩增技术，扩增枯草芽孢杆菌168基因组abrB基因上下游同源臂，即上游片 段ABf和下游片段ABb; 所述abrB基因的上游片段和下游片段的PCR扩增引物序列如下： ABf-F：5'-CGGCATCTTGAAACCTCCT-3'； ABf-R:5 '-TTTTATTAAAGTTCATTCTCCTCCCAAGAGATACTTA-3 '； ABb-F:5 '-TAATGACTGGCTTTTATAATCATTTCTTGTACAAAAAACGTTC-3 '； ABb-R:5 '-TCTTTTACGGTTTTCTCAACAGA-3 '； (3) 通过PCR扩增技术，扩增穿梭质粒ΡΗΤΟΙ含有的氯霉素抗性基因 Cii^片段； 所述氯霉素抗性基因况片段的PCR扩增引物序列如下： Cmr-F：5'-CTCTTGGGAGGAGAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACA-3'； Cmr-R：5'-ACAAGAAATGATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTAT-3'； (4) 通过重叠 PCR扩增技术，将步骤(2)扩增的ABf片段与步骤(3)扩增的CmTt段进行重 叠 PCR，扩增得到ABf-Cnf片段； (5) 通过重叠 PCR扩增技术，将步骤⑵扩增的ABb片段与步骤(4)扩增的ABb-Cnf片段进 行重叠 PCR，扩增得到ABf-Cnf-ABb片段； 所述的abrB基因上游片段ABf核苷酸序列如SEQ ID如.5所示，&13池基因下游片段八8匕 核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氯霉素抗性基因 Cnf核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示； (6) 将步骤(5)制得的片段ABf-Cnf-ABb片段转化步骤（1)制得的重组枯草芽孢杆菌，筛 选有氯霉素抗性的克隆转化子，制得自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，转化的步骤如下： 将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，卡那霉素筛选，即得。6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增体系为50μ1: 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，上游引物（10μπιο1/υ2·5μ1，下游引物（10μπιο1/υ2·5μ 1，模板 2.5μ1，用 ddH20 补足 50μ1; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72°C 延 伸 10min，-20°C 保存； 优选的，所述步骤(3)中，PCR扩增体系为50μ1: 2XTaq PCR MasterMix 25μ1，上游引物（10ymol/L)2.5yl，下游引物（10ymol/L)2.5y 1，模板 2.5μ1，用 ddH20 补足 50μ1; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，51°C 退火 30sec，72°C 延伸 40sec，30 个循环；72°C 延 伸 10min，-20°C 保存； 优选的，所述步骤(4)中，ABb-Cn^片段的重叠 PCR扩增体系如下：总体系50μ1; 初次扩增体系为25yl:ABf片段4yl;Cmr片段4yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5yl;ddH2〇 4.5μ1； 初次扩增程序如下： 95°〇预变性5111；[11;94°(^变性3〇86〇，58°(^退火3〇86〇，72°(^延伸1111；[111〇86〇，5个循环； 补充扩增体系为25μ1:上游引物ABf-F 2μ1;下游引物Cnf-R2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8.5μ1; 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C 延伸 lminl0sec，30 个循环；72 。(:延伸 10min，-20°C 保存。7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，ABf-Cnf-ABb片段的重叠 PCR扩增体系如下:总体系50μ1; 初次扩增体系为25yl:ABf-Cnf片段4yl;ABb片段4yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1; ddH20 4.5μ1； 初次扩增程序如下： 95 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30sec，57 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 lmin30sec，5 个循环； 补充扩增体系为25μ1:上游引物ABf-F 2μ1;下游引物ABb-R 2yl;2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1;(ΜΗ2〇 8 ·5μ1; 所述的重叠 PCR的补充扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin30sec，30 个循环；72 。(:延伸 10min，-20°C 保存。8. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，ABf-Cnf-ABb片段转化重 组枯草芽孢杆菌的步骤如下： 将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，氯霉素筛选，即得。9. 利用权利要求4所述制备方法制得的自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌。10. 权利要求9所述自诱导强化型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK105861536SQ201610246849
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】王腾飞, 王瑞明, 刘强, 隋松森
【申请人】齐鲁工业大学, 诸城东晓生物科技有限公司