一组dna分子及重组载体、重组酮古龙酸杆菌和生产2-酮-l-古龙酸的方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，公开了一组DNA分子及重组载体、重组酮古龙酸杆菌和生产2?酮?L?古龙酸的方法。本发明所述DNA分子至少包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的一种。本发明提供能够编码酮古龙酸杆菌硫辛酸代谢途径中的关键酶的DNA分子，通过嵌入载体的形式转入酮古龙酸杆菌，使其能够表达所缺失的关键酶，生成内源硫辛酸，促进菌株的生长，提高产酸水平和产酸效率，实现了无需添加成本较高的外源硫辛酸营养因子且依然能够进行单菌发酵产酸的目的。
【专利说明】
一组DNA分子及重组载体、重组酮古龙酸杆菌和生产2-酮-L- 古龙酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一组DNA分子及重组载体、重组 酮古龙酸杆菌和生产2-酮-L-古龙酸的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素 C是维持机体生长和代谢所必须的一种水溶性维生素，目前广泛应用于医 药、食品、饲料和化妆品领域，市场稳定。目前维生素 C的主流生产法是二步发酵法，主要指 从D-山梨醇开始，经过两步发酵转化为维生素 C前体一2_酮-L-古龙酸的过程。第一步，利用 氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，第二步利用生酮古龙酸杆菌及其伴生菌 (主要为芽孢杆菌)的混菌体系将L-山梨糖转化为2-酮-L-古龙酸。但是，这种大小菌的混菌 发酵给工艺控制增加了难度，造成发酵培养基营养成分和能源的浪费，增加了环境污染，提 高生产成本。
[0003] 通过单菌发酵实现糖酸转化（由L-山梨糖到2-酮-L-古龙酸)一直是维生素 C发酵 工艺追求的目标。中国专利CN102321698A公开了一种促进酮古龙酸杆菌生长和产酸的方 法，其在培养基中添加营养因子硫辛酸，提高了酮古龙酸杆菌的生长速度和产酸能力，进而 达到了利用单菌发酵的方法实现糖酸转化的目的。然而市场上目前混旋硫辛酸的市场报价 在550元/公斤，而R-硫辛酸达到2000-3000元/公斤，价格相差巨大。硫辛酸生产目前处于R-硫辛酸(右旋)取代混旋硫辛酸的过程之中，细菌生产的硫辛酸是R-硫辛酸，因而在酮古龙 酸杆菌体内构建硫辛酸模块促进其生长和产酸更具有生物学意义。
[0004] 虽然有研究指出酮古龙酸杆菌的硫辛酸合成代谢途径中酶不完整，但是具体是何 种酶的不完整并没有在本领域中得出确切结论，同时酮古龙酸杆菌是非模式生物，分子操 作存在很大困难，存在极大挑战性，因此关于在酮古龙酸杆菌体内构建硫辛酸模块这些方 面鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一组DNA分子，使得所述DNA分子编码的蛋白弥 补酮古龙酸杆菌体硫辛酸合成代谢途径中的酶不完整，实现硫辛酸合成代谢。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种包含所述DNA分子的重组载体，使得所述重组 载体能够转化到酮古龙酸杆菌中，实现酮古龙酸杆菌硫辛酸合成代谢，提高其产酸能力，缩 短其发酵周期。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种重组酮古龙酸杆菌，使得所述重组酮古龙酸杆 菌能够进行硫辛酸合成代谢，具有较高的产酸能力和效率。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种生产2-酮-L-古龙酸的方法，使得所述方法能 够提高2-酮-L-古龙酸的产量和生产效率。
[0009] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0010] 一组DNA分子，至少包含以下一种核苷酸序列：
[0011] SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列；
[0012] SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
[0013] 针对酮古龙酸杆菌硫辛酸代谢途径中酶不完整以及现有技术对何种酶缺失无确 切结论的缺陷，本发明提供了编码缺失的关键酶的一组DNA分子，即SEQ ID N0:l-2所示核 苷酸序列，编码的关键酶本发明分别命名为IipA和lipB。所述编码的关键酶能够使酮古龙 酸杆菌硫辛酸代谢途径完善并合成内源硫辛酸，实现酮古龙酸杆菌单菌生长和产酸，无需 添加外源的硫辛酸。
[0014] 在本发明的一些技术方案中，所述DNA分子包含SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列。 而在另外一些技术方案中，所述DNA分子由SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列组成。
[0015]基于所述DNA分子的作用，本发明提供了其在生产2-酮-L-古龙酸，以及在制备用 于生产2-酮-L-古龙酸的重组载体和重组菌株中的应用。针对此应用，本发明相应提供了一 种重组载体，包含本发明任意一项技术方案所述的DNA分子，即所述DNA分子可以是以下任 一情形：
[0016] (I)SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；
[0017] (2)SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列，同时包含不影响本发明所述DNA 分子编码表达蛋白的其他DNA分子；
[0018] (3)SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；
[0019] (4)SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列，同时包含不影响本发明所述DNA 分子编码表达蛋白的其他DNA分子。
[0020] 本发明所述DNA分子可以嵌入到载体中任意合适位点中，SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示核苷酸序列既可以相邻也可以分开存在于载体上，这可以根据载体的选择进行适 应性调整，同时为了能够顺利编码表达，所述重组载体中，在SEQ ID N0:1所示核苷酸序列 或SEQ ID N0:2所示核苷酸序列上游还应有启动子，下游具有终止子。在本发明的一些技术 方案中，所述启动子选择16S启动子，所述终止子选择5S终止子。
[0021] 本发明对于载体的选择给出了较为具体的选择，所述载体可选择为PBBR1MCS2质 粒载体，根据该质粒载体上酶切位点，可对本发明所述DNA分子的两端设计对应酶切位点进 行嵌入，以组成重组载体。如酶切位点KpnI、HindIII、BamHI等，同样，更换其他质粒载体可 根据其具有的酶切位点相应调整。
[0022]基于本发明所述DNA分子的作用，所述重组载体也能够被用于生产2-酮-L-古龙 酸，以及在用于制备生产2-酮-L-古龙酸的重组菌株。
[0023] 此外，本发明还提供了一种重组酮古龙酸杆菌，其转化有本发明上述任意技术方 案中提及的重组载体，所述转化可采用电转化的方式进行。本发明获得的重组酮古龙酸杆 菌无需添加外源硫辛酸即可达到通过添加外源硫辛酸的原始菌株产酸水平，同时优于原始 未添加外源硫辛酸的酮古龙酸杆菌。在发酵周期上，本发明所述重组酮古龙酸杆菌相比原 始的酮古龙酸杆菌缩短了5小时，提高了生产效率。由此，本发明还提供了所述重组酮古龙 酸杆菌在生产2-酮-L-古龙酸中的应用。
[0024] 对应于本发明提供的相关应用，本发明分别提供了一种摇瓶发酵生产2-酮-L-古 龙酸的方法和一种发酵罐发酵生产2-酮-L-古龙酸的方法。其中，摇瓶发酵方法如下：
[0025] 将本发明所述重组酮古龙酸杆菌加入到固体种子培养基中活化，然后转接到种子 培养基中进行摇瓶发酵。
[0026] 其中，所述固体种子培养基为加入琼脂后的种子培养基，所述种子培养基组成为： [0027]牛肉膏3.0g/L，玉米楽；6.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，无水硫酸镁 0 · 2g/L，尿素1 · Og/L，磷酸氢二钾1 · Og/L，碳酸钙1 · Og/L，另取山梨糖20g/L，pH=6 · 8。
[0028]所述活化为在30°C下培养24h;所述摇瓶发酵为在30°C、250r/min下摇瓶发酵。 [0029]发酵罐发酵方法如下：
[0030] 将本发明所述重组酮古龙酸杆菌加入到发酵培养基中进行发酵罐发酵，发酵期间 补加山梨糖。
[0031] 其中，所述发酵培养基为：
[0032] 玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙lg/L，山梨糖 80g/L，消泡剂 lml/3L，pH 值为 6 · 7-7 · 0。
[0033]所述发酵期间补加山梨糖为发酵第24h-30h补80g/L的山梨糖。
[0034] 发酵罐发酵条件为30°C，500r/min，pH控制7 ·0，通气1 · SvvnupH控制7·0，用2· 5mol 硫酸和5mol氢氧化钠调节pH。
[0035] 由以上技术方案可知，本发明提供能够编码酮古龙酸杆菌硫辛酸代谢途径中的关 键酶的DNA分子，通过嵌入载体的形式转入酮古龙酸杆菌，使其能够表达所缺失的关键酶， 生成内源硫辛酸，促进菌株的生长，提高产酸水平和产酸效率，实现了无需添加成本较高的 外源硫辛酸营养因子且依然能够进行单菌发酵产酸的目的。
【附图说明】
[0036]图1所示为以PBBR1MCS2质粒载体为基础的重组载体图谱；
[0037] 图2所示为kv组和lip-kv组的不同时间点摇瓶发酵菌浓度折线图；kv组为原始酮 古龙酸杆菌，I ip-kv组为本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0038] 图3所示为kv组和lip-kv组的不同时间点摇瓶发酵产酸量折线图；kv组为原始酮 古龙酸杆菌，I ip-kv组为本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0039]图4所示为不同处理组72h摇瓶发酵产酸柱形图；kv:原始酮古龙酸杆菌;kv-lxs : 添加外源硫辛酸的原始酮古龙酸杆菌；lip-kv:本发明所述重组酮古龙酸杆菌；lip-kv-Ixs:添加外源硫辛酸的本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0040] 图5所示为kv组和lip-kv组的不同时间点发酵罐发酵菌浓度折线图；kv组为原始 酮古龙酸杆菌，I ip-kv组为本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0041] 图6所示为kv组和lip-kv组的不同时间点发酵罐发酵产酸量折线图；kv组为原始 酮古龙酸杆菌，I ip-kv组为本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0042]图7所示为kv组和lip-kv组的不同时间点发酵罐发酵底物山梨糖消耗折线图；kv 组为原始酮古龙酸杆菌，I ip-kv组为本发明所述重组酮古龙酸杆菌。
【具体实施方式】
[0043] 本发明公开了一组DNA分子及重组载体、重组酮古龙酸杆菌和生产2-酮-L-古龙酸 的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明所述DNA分子、重组载体、重组菌株以及生产方法已经通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0044]在本发明中所涉及的一些质粒载体、菌株均可市售获得，如roBRlMCS2质粒可通过 中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心(Biovector Science Lab, Inc)购得，原始酮古龙 酸杆菌可从华北制药集团维尔康制药有限公司获得。
[0045]依照本发明的
【发明内容】
，本领域技术人员在知晓本发明所述DNA分子后可通过本 领域已经公开的技术操作将其嵌入到合适的载体质粒中。本发明实施例中所涉及的重组载 体以市售TOBR1MCS2质粒为基础，在其KpnI和HindIII、HindIII和BamM酶切位点之间分别 嵌入本发明所述DNA分子中的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列，其中还包括两 个序列的启动子和终止子序列等必须的基因元件，整体嵌入的核苷酸序列依次为KpnI酶切 位点-16S启动子-SEQ ID NO: 2所示序列-5S终止子-HindIII酶切位点-6S启动子-SEQ ID NO:1所示序列-5S终止子-BamHI酶切位点，可通过生物技术公司完成合成（如SEQ ID NO: 3 所示，l-6bp为Kprα酶切位点，7-383bp为16S启动子，384-1067bp为SEQIDN0:2所示编码 IipB 的序列，1068-1395bp 为 5S 终止子，1396-1401bp 为 Hindin 酶切位点，1402-1778bp 为 16S启动子，1779-2747bp为SEQ ID N0:1所示编码IipA的序列，2746-3075bp为5S终止子， 3076-3081bp为BamM酶切位点）。
[0046] 酶切位点的引入是为了在制备过程中通过酶切来验证目的基因是否已成功转入 以及重组质粒是否成功转化，重组后的PBBR1MCS2质粒图谱见图1。
[0047]本发明在完成重组载体的制备后在2000V条件下通过电转化的方式转入酮古龙酸 杆菌，具体的方法如下：
[0048] I .K. vulgare(酮古龙酸杆菌)感受态细胞的制备
[0049] K. vulgare甘油菌经过固体平板活化，转接于50mL HJ培养基中，培养13h至菌体到 达指数期后期；取40mL菌体于50mL预冷的离心管中，冰浴15min;在4°C冷冻离心机内 4500rpm离心15min，倒掉上清液；用预冷的10 %的甘油进行洗涤，重悬细胞，4500rpm离心 15min，同样去除上清液;重复上一步骤;加入30mL的灭菌预冷的超纯水重悬细胞，4500rpm 离心15min，倒掉上清;加入900yL提前预冷的10 %甘油，重悬细胞，用预冷的枪头分装感受 态细胞于1.5mL EP管内，每管内有感受态细胞90yL。制备好的感受态细胞放置于-80°C冰箱 内保存，需要时取出使用。
[0050] 2.电转
[00511从_80°C冰箱中取出已制备好的K. vulgare感受态细胞，置于冰上融化；用冷冻枪 头加入IOyL质粒(浓度最好在IOOng以上），注意质粒需缓慢加入，且不可反复吹吸感受态细 胞，小心轻弹EP管外壁混匀细胞和质粒，然后静置5min;将EP管内的混合物用冷冻枪头转移 到事先预冷的电转杯中，电转杯始终进行冰浴;设置电击电压2. OkV，控制电击时间4~6ms， 电击后迅速加入预冷的无抗HJ培养基;在30°C，150rpm摇床中进行复苏3h，离心菌体涂布于 与质粒抗性基因对应的抗性平板上。
[0052]通过提质粒酶切验证获得正确的转化子。
[0053] HJ培养基:称量酵母浸粉5 . Og，蛋白胨15 . Og，尿素5. Og，无水硫酸镁2.5g，定容至 0.8L，另称取15.(^山梨糖定容至0.2匕均115°(：灭菌151^11。接菌前将20〇1111，7.5%糖溶液加 入HJ培养基中混合。
[0054]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0055]实施例1:本发明所述重组酮古龙酸杆菌的制备 [0056] 1、所述重组载体的体外扩增
[0057]按照本发明提供的DNA分子和重组载体的制备方案，通过生物技术公司代为合成， 重组后的载体质粒图谱见图1，其中嵌入的序列如SEQ ID N0:3所示序列，即KpnI酶切位点-16S启动子-SEQ ID NO: 1所示序列-5S终止子-HindIII酶切位点-6S启动子-SEQ ID NO:2所 示序列-5S终止子-BamHI酶切位点。
[0058]将所述重组载体通过大肠转化常用的经典热激法，使用的感受态细胞购自北京博 迈德科技发展有限公BDH5a。转化后，根据转入质粒所携带的抗性(所用抗性为kana抗性)选 择合适的LB抗性平板涂板后进行过夜培养。过夜培养长出单菌落后，再通过菌落PCR的方式 进行阳性转化子的筛选(菌落PCR的模板为单菌落，其他一样，菌落PCR程序设计与普通PCR 程序类似）ICR完成后，进行电泳，通过条带大小即可挑选出阳性(正确)转化子。进一步的 转化子验证方式有提质粒酶切验证和测序，通过进一步的验证(酶切验证手段)获得最终的 正确转化子。
[0059] 热激步骤如下：
[0060] 1)取IOOyL感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预 冷的离心管中，置于冰浴中。
[0061 ] 2)取IOyL连接产物加入IOOyL感受态细胞中，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰 洛中静置30min。
[0062] 3)将离心管置于42°C水浴中放置90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 2min，该过程不要摇动离心管。
[0063] 4)向每个离心管中加入500yL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37°C、 150rpm摇床振荡培养45min，使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
[0064] 5)无菌条件下，取适量菌液加到含相应抗生素的LB固体培养平板上，用无菌的细 菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37°C培养12-16h〇
[0065] 6)保留剩余的菌液于4°C冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。
[0066] LB培养基：10.0 g/L氯化钠，10 . Og/L胰蛋白胨，5. Og/Ι酵母提取物。相应固体培养 基中加入2%琼脂粉。灭菌条件：121°C，20min。
[0067] 2、酮古龙酸杆菌的转化
[0068] 利用LB培养基培养含有正确转化子的大肠杆菌，得到一定浓度后再提含有目的基 因的质粒，再将获得的硫辛酸基因在2000V条件下电转入酮古龙酸杆菌，获得编码硫辛酸基 因载体的酮古龙酸杆菌。
[0069] I .K. vulgare(酮古龙酸杆菌)感受态细胞的制备
[0070] K. vulgare甘油菌经过固体平板活化，转接于50mL HJ培养基中，培养13h至菌体到 达指数期后期；取40mL菌体于50mL预冷的离心管中，冰浴15min;在4°C冷冻离心机内 4500rpm离心15min，倒掉上清液；用预冷的10 %的甘油进行洗涤，重悬细胞，4500rpm离心 15min，同样去除上清液;重复上一步骤;加入30mL的灭菌预冷的超纯水重悬细胞，4500rpm 离心15min，倒掉上清;加入900yL提前预冷的10 %甘油，重悬细胞，用预冷的枪头分装感受 态细胞于1.5mL EP管内，每管内有感受态细胞90yL。制备好的感受态细胞放置于-80°C冰箱 内保存，需要时取出使用。
[0071] 2.电转
[0072]从-80°C冰箱中取出已制备好的K. vulgare感受态细胞，置于冰上融化；用冷冻枪 头加入IOyL质粒(浓度最好在IOOng以上），注意质粒需缓慢加入，且不可反复吹吸感受态细 胞，小心轻弹EP管外壁混匀细胞和质粒，然后静置5min;将EP管内的混合物用冷冻枪头转移 到事先预冷的电转杯中，电转杯始终进行冰浴;设置电击电压2. OkV，控制电击时间4~6ms， 电击后迅速加入预冷的无抗HJ培养基;在30°C，150rpm摇床中进行复苏3h，离心菌体涂布于 与质粒抗性基因对应的抗性平板上。
[0073]通过提质粒酶切验证获得正确的转化子。
[0074]实施例2:本发明所述重组酮古龙酸杆菌的摇瓶发酵试验 [0075] 1、试验分组
[0076] kv:原始酮古龙酸杆菌；
[0077] kv-lxs:添加外源硫辛酸的原始酮古龙酸杆菌；
[0078] lip-kv:本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0079] lip-kv-lxs:添加外源硫辛酸的本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0080] 2、kv组和I ip-kv组的不同时间点摇瓶发酵对比试验
[0081]将各组菌株先加入到固体种子培养基中在30°C下培养24h，进行活化，然后以相同 的初始OD转接到种子培养基中在30 °C、250r/min下摇瓶发酵，Oh、3h、6h、9h、12h、19h、24h、 30h等不同时间点取样分析。
[0082]所述固体种子培养基为加入琼脂后的种子培养基，所述种子培养基组成为：
[0083]牛肉膏3.0g/L，玉米楽；6.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，无水硫酸镁 0 · 2g/L，尿素1 · Og/L，磷酸氢二钾1 · Og/L，碳酸钙1 · Og/L，另取山梨糖20g/L，pH=6 · 8。
[0084] 3、4组的72h摇瓶发酵对比试验
[0085]将各组菌株先加入到固体种子培养基中在30°C下培养24h，进行活化，然后以相同 的初始OD转接到种子培养基中在30°C、250r/min下摇瓶发酵，72h时间点取样分析。需要添 加外源硫辛酸的组在种子培养基中添加，终浓度为〇.64mg/L。
[0086] 4、分析检测
[0087]菌浓度测定:使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中菌株的生长曲线，波长 采用 600nm，即 0D600。
[0088]酮古龙酸产量测定：高效液相色谱检测，采用Aminex HPX-87H色谱柱，示差检测 器。0.5mM硫酸作流动相，柱温65°C，检测器温度50°C。
[0089] 5、试验结果
[0090] kv组和I ip-kv组的不同时间点摇瓶发酵对比试验结果见图2和图3，由图可知，在 相同时间点下，本发明所述重组酮古龙酸杆菌在菌浓度以及产酸水平上都要高于原始酮古 龙酸杆菌。
[0091] 4组的72h摇瓶发酵对比试验结果见图4及对应的表1，由图和表的试验结果可以看 出，本发明所述重组酮古龙酸杆菌的产酸能力略优于添加外源硫辛酸的原始酮古龙酸杆 菌，相比原始酮古龙酸杆菌产酸量提高了6.5%。
[0092]表1 72h摇瓶发酵对比试验结果
[0094]实施例3:本发明所述重组酮古龙酸杆菌的发酵罐发酵试验
[0095] 1、试验分组
[0096] kv:原始酮古龙酸杆菌；
[0097] lip-kv:本发明所述重组酮古龙酸杆菌；
[0098] 2、kv组和I ip-kv组的不同时间点摇瓶发酵对比试验
[0099]将经过活化的两组菌株，以相同的初始密度接入发酵罐发酵，发酵期间第24h_30h 补80g/L的山梨糖。
[0100]所述发酵培养基为：
[0101] 玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙lg/L，山梨糖 80g/L，消泡剂 lml/3L，pH 值为 6 · 7-7 · 0。
[0102] 发酵罐发酵条件为30°C，500r/min，pH控制7 ·0，通气1 · δννπ^ρΗ控制7·0，用2· 5mol 硫酸和5mol氢氧化钠调节pH。
[0103] 3、分析检测
[0104] 菌浓度测定:使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中菌株的生长曲线，波长 采用 600nm，即 0D600。
[0105]底物消耗和产酸测定:高效液相色谱检测，采用Aminex HPX-87H色谱柱，示差检测 器。0.5mM硫酸作流动相，柱温65°C，检测器温度50°C。
[0106] 4、试验结果
[0107] 结果见图5-7,结果显示，在相同时间点下，本发明所述重组酮古龙酸杆菌在菌浓 度以及产酸水平上都要高于原始酮古龙酸杆菌。
[0108] 由图7的山梨糖底物消耗的情况可以看出，本发明所述重组酮古龙酸杆菌比原始 菌株缩短了发酵周期5h，减少了添加外源物质所需要的成本，促进了酮古龙酸杆菌的生长 和产酸
[0109]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一组DNA分子，其特征在于，至少包含以下一种核苷酸序列： SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列； SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述DNA分子，其特征在于，包含SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述DNA分子，其特征在于，由SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列组成。4. 权利要求1-3任意一项所述DNA分子在生产2-酮-L-古龙酸，以及在制备用于生产2-酮-L-古龙酸的重组载体和重组菌株中的应用。5. -种重组载体，其特征在于，包含权利要求1-3任意一项所述DNA分子。6. 根据权利要求5所述重组载体，其特征在于，SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列上游为启动子，下游为终止子。7. 根据权利要求6所述重组载体，其特征在于，所述启动子为16S启动子。8. 根据权利要求6所述重组载体，其特征在于，所述终止子为5S终止子。9. 根据权利要求5所述重组载体，其特征在于，所述载体为PBBR1MCS2质粒载体。10. 权利要求5-9任意一项所述重组载体在生产2-酮-L-古龙酸，以及在制备用于生产 2-酮-L-古龙酸的重组菌株中的应用。11. 一种重组酮古龙酸杆菌，其特征在于，转化有权利要求5-9任意一项所述重组载体。12. 权利要求11所述重组酮古龙酸杆菌在生产2-酮-L-古龙酸中的应用。13. -种摇瓶发酵生产2-酮-L-古龙酸的方法，其特征在于，将权利要求11所述重组酮 古龙酸杆菌加入到固体种子培养基中活化，然后转接到种子培养基中进行摇瓶发酵。14. 根据权利要求13所述方法，其特征在于，所述固体种子培养基为加入琼脂后的种子 培养基，所述种子培养基组成为： 牛肉膏3. Og/L，玉米楽；6. Og/L，酵母浸粉3. Og/L，蛋白胨10.0 g/L，无水硫酸镁0.2g/L， 尿素1. Og/L，磷酸氢二钾1. Og/L，碳酸钙1. Og/L，另取山梨糖20g/L，pH=6.8。15. -种发酵罐发酵生产2-酮-L-古龙酸的方法，其特征在于，将权利要求11所述重组 酮古龙酸杆菌加入到发酵培养基中进行发酵罐发酵，发酵期间补加山梨糖。16. 根据权利要求15所述方法，其特征在于，所述发酵培养基为： 玉米浆l〇g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙lg/L，山梨糖80g/L， 消泡剂 lml/3L，pH 值为 6 · 7-7 · 0。17. 根据权利要求15所述方法，其特征在于，所述发酵期间补加山梨糖为发酵第24h-30h补80g/L的山梨糖。18. 根据权利要求15所述方法，其特征在于，所述发酵罐发酵的条件为： 30°C，500r/min，pH控制7.0,通气 1.5vvm。
【文档编号】C12N1/21GK105861526SQ201610246687
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】元英进, 潘才惠, 丁明珠, 王瑞钊, 贾楠
【申请人】天津大学