一种非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因EgDGAT3-1及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因EgDGAT3?1及其应用，属于III型二酰甘油酰基转移酶的基因技术领域。本发明通过PCR和RACE技术，从非洲油棕果实的果皮中克隆到了其全长cDNA序列，命名为EgDGAT3?1。该基因在其他生物体内表达时可以增加宿主细胞质油脂的含量，能够广阔应用于农业作物和生物能源等领域。本发明还提供了该基因在大肠杆菌、酵母和紫萍中表达时重组质粒的构建方法及转化方法。
【专利说明】
一种非洲油棕的M I型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-1及 其应用
技术领域
[0001]本发明属于III型二酰甘油酰基转移酶的基因技术领域，特别涉及一种非洲油棕 的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l及其应用。
【背景技术】
[0002] 非洲油棕，学名Elaeis guineensis，属于被子植物门（Magnoliophyta)-单子叶植 物纲(LiIiopsida)-棕榈亚纲(Arecidae)-棕榈目（Arecales)-棕榈科(Arecaceae)-油棕属 (Elaeis)。油棕是世界上单位面积产油量最高的一种植物，一般亩产油200千克左右，比花 生产油量高五六倍，是大豆产油量的近10倍，因此有"世界油王"之称。油棕的耕作面积仅占 全世界油料作物种植面积的5%，但其占全世界植物油比例的33%、占总食用油的45%。目 前实行经济栽培的大多是非洲油棕榈。非洲油棕原产非洲热带地区，现广植于热带各地，我 国云南、广西、广东和海南有引种。
[0003] 2009年11月，马来西亚棕榈油总署(MPOB)与Orion Genomics公司宣布，MPOB高级 生物技术和育种中心与Orion Genomics公司共同领导的联合研究团队完成了油棕全基因 组测序工作(ACCesSi〇n:PRJNA192219)。油棕基因组的完整测序、拼接和功能注释，为人们 在提高这一具有重要商业意义的植物的生产力和可持续性的道路上树立了重要的里程碑。 该研究团队还分析了油棕生长过程中各个阶段的基因表达，通过测序12个转录组来阐明其 油脂的生物合成机制。2013年，油棕基因组同时发表了两篇Nature文章，一篇文章主要进行 非洲油棕和美洲油棕的全基因组de nove测序，以及非洲油棕的转录组测序。另一篇文章则 主要进行非洲油棕、美洲油棕及其杂交品种的全基因组重测序，利用与SHELL基因相关的 SNP及SSR标记构建遗传连锁图谱并进行数量性状分析，揭示不同表型中SHELL等位基因的 存在形式及其对产油性状的影响。
[0004] 非洲油棕果实积累油脂与普通油料作物果实积累油脂有完全不同的模式。普通油 料作物果实油脂积累场所主要是在胚乳或子叶，其油体形成需要油体蛋白的参与，而且其 油脂积累受到果实发育相关调控因子的调控，油脂的积累是为后期胚的发育存储能量;而 非洲油棕果实油脂主要是在其果皮中积累，果皮油体的形成不需要油体蛋白，这些油脂的 积累也不是为后期胚的发育存储能量。
[0005] 二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)主要有三种类型，分别如下：
[0006] I型DGAT基因（DGAT1):DGAT1-般包含500多个氨基酸残基，分子量50-60kDa，蛋白 三维结构中包含9-10个预测的跨膜区域。DGATl在各物种间的结构差异主要存在于N端，这 与不同DGATl对酰基辅酶A底物的选择性有关，这由100多个氨基酸组成的亲水区域朝向内 质网的胞质面。植物DGATl基因常具有16个左右的外显子，大多数外显子的长度相似，区别 主要在于内含子。
[0007] II型DGAT基因（DGAT2):DGAT2-般包含300多个氨基酸残基，分子量30-40kDa，蛋 白三维结构中包含1-2个预测的跨膜区域。DGAT2在各物种间的结构差异主要存在于N端，这 与不同DGAT2对酰基辅酶A底物的选择性有关，这由100多个氨基酸组成的亲水区域朝向内 质网的内腔面。植物DGAT2基因常具有9个左右的外显子，大多数外显子的长度相似，区别主 要在于内含子。
[0008] III型DGAT基因（DGAT3):DGAT3-般包含300多个氨基酸残基，分子量30-40kDa，蛋 白三维结构预测没有跨膜区域，与DGATl和DGAT2的相似性不足10%，但是其保守区域中却 包含已推测的DGAT结构基序以及活性位点。植物DGAT3基因常具有2个左右的外显子，大多 数外显子的长度相似，区别主要在于内含子。
【发明内容】
[0009] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种非洲 油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l。所述的基因来自于非洲油棕(Elaeis guineensis)，命名为EgDGAT3_l。
[0010] 本发明的另一目的在于提供上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l的应用。本发明的EgDGAT3-l基因在其他生物体内表达时可以增加宿主细胞质油 脂的含量，能够广阔应用于农业作物和生物能源等领域。
[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移 酶基因 EgDGAT3-l，本发明利用PCR和RACE技术，从非洲油棕果实的果皮中克隆到了一个III 型二酰甘油酰基转移酶的基因的全长cDNA序列，该基因被命名为EgDGAT3-l;其核苷酸序列 SEQ ID NO. 1如下所示：
[0012] atggagatct ccggtgctgc gctccggcga gtzccggccg tctccagcgc cgggztccag 60 cgtgatgccg gcgagccttc cttttctggc ttctcgatcg ccgccggctg tgggagattt 120- ggggtcaaga zatcatcctg gccgaggcgg gtzcgcggcg gttgcgggtt ctccgacgag 18C ggatacttga ggtactacgc gacgccggca acfatgcggcg gggggaggaa gaacrgaggag 24C
[0013] aagaggaggg- G-gaggttggt. 'ggagagcz'tg gcgagggatt t-gt.cggcctt ctattcggtg 300 ggtttcqqcg tggaggccgg acaagcagtc g~gggagatq tcaaggcgaa gatgatcacg 36D gaggcggcag aggttttgct g'gcacagctg aaccagctaa gagctggcga gaaaqacatg 420 a 二g.dd.gdg.cid .d.cicggddggd· 匕 48.0 gcaat-Ljaaag caqcaaggLt qdaaqaz gc cga t Lg aLgccLccd.g udcttcc 匕c 匕 54? gaatccagca acagtgatgg ggaaacagta gtcaagatga gcagcctaag aactactt-ct- 600 cttccacacc ccagactgaa aagcttggaa gc^cgaaaag aggcacctaa gtgcaatgaa 660 gacccaataa ctctggaact tggaacagaa gaaagaatgg aagagaatcg cacccttctg '720 =5^gcctgacc aagaatgcag cagcagcagc agcac^gata ttagctgtaa grgcagtgag 780 Hf agtsgtcg aagagcrtgc ggataggatr gaagt ^fgrg tgggagggaa atgcaagrigg^ 84,0 tctggttctG tagagctatt gaatgaactc -cagaggaagg ：cgggcattga aggtgttgtt 900 gttggctgca agtgcatggg caaacgcagg ga^ggaccaa atgttagagt trcagatcat 96.0 tgtgtggatt Gtgttaagcc· tcctggcaac 'Cccttgtrla ttggtgttgg at-tagaggat 10：20 gttggtacaa t.t.ttaga：Gga· gttctt~g：gg gagaagaaag. atgtaggeet tgttgctgct- 1080 tag If) 83 c
[0014] 所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l的氨基酸序列SEQ ID NO.2如下所示：
[0015] MEISGAALRRVPAVSSAGFQRDAGEPSFSGFSIAAGCGRFGVKISSWPRRVRGGCGFSDEGYLRYYATPARCGGGRK KEEKRRARLVESLARDLSAFYSVGFGVEAGQAVVGDVKAKMITEAAEVLLAQLNQLRAGEKDMERKRKEEKKEMKRK RKEEKAAMKAARLKDSADLDASSTSSESSNSDGETVVKMSSLRTTSLPHPRLKSLEVRKEAPKCNEDPITLELGTEE RMEENRTLLKPDQECSSSSSTDVSCKCSEIVVEEPADRIEVCVGGKCKRSGSLELLNELQRKAGIEGVVVGCKCMGK CRDGPNVRVSDHCVDSVKPPGNPLFIGVGLEDVGTILAEFFGEKKDVGLVAAo
[0016] 上述氨基酸序列的多肽的分子量为38.95kDa，等电点为8.26。
[0017]上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高生物体内油 脂含量中的应用。
[0018] 上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高大肠杆菌体 内油脂含量中的应用。上述的非洲油棕的ΠΙ型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在大肠 杆菌M15中表达时，可以提高大肠杆菌M15细胞质油脂的含量，该提高值能达到20倍以上。 EgDGAT3-l基因克隆到pQE-30表达载体上，再转化宿主大肠杆菌菌株M15,经低浓度IPTG持 续诱导后，大肠杆菌Ml 5细胞质中油脂含量明显提高。
[0019] 上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高酵母体内油 脂含量中的应用。非洲油棕ΠΙ型二酰甘油酰基转移酶基因（EgDGAT3-l)在酵母H1266中表 达时，可以提高酵母H1266细胞质油脂的含量，该提高值能达到30倍以上。EgDGAT3-l基因克 隆到PYES2表达载体上，再转化宿主酵母菌株H1266,酵母菌株H1266细胞质中油脂含量明显 提尚。
[0020] 上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高紫萍体内油 脂含量中的应用。非洲油棕ΠΙ型二酰甘油酰基转移酶基因（EgDGAT3-l)在紫萍中表达时， 可以提高紫萍叶状体细胞质油脂的含量，该提高值能达到10倍以上。EgDGAT3-l基因克隆到 pBI 121表达载体上，再转化进农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌侵染紫萍愈伤获得转基因紫 萍植株，筛选出来的阳性转化紫萍植株叶状体中油脂含量明显提高。
[0021] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022] 本发明通过PCR和RACE技术获得非洲油棕的111型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l。通过超表达非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l能够提高多 种生物体内油脂含量中的应用，尤其在大肠杆菌，酵母和紫萍中，油脂含量提高达到10-30 倍以上。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 [0024] 实施例1
[0025]非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因(EgDGAT3-l)的基因克隆：
[0026] (l)利用引物扩增EgDGAT3-l基因中间片段，退火温度为60.8度，引物如下：
[0027] 上游引物Fl:22-mer 5，-ATGCCGGCGAGCCTTCCTTTTC-3,；
[0028] 下游引物Rl:22-mer 5，-TTCAATGCCCGCCTTCCTCTGG-3,；
[0029] (2)双向测序确定扩增序列；
[0030] (3)根据中间cDNA片段设计上下游引物进行5' -RACE和3' -RACE;双向测序确定扩 增序列；
[0031] (4)根据三次克隆得到的基因序列拼接出EgDGAT3-l基因的全长序列;序列信息如 SEQ ID NO. 1所示；
[0032] (5)利用引物扩增EgDGAT3-l基因的全长片段，退火温度为56.3度，引物如下：
[0033] 上游引物F2:20-mer 5，-ATGGAGATCTCCGGTGCTGC-3，；
[0034] 下游引物R2:24-mer 5，-CTAAGCAGCAACAAGGCCTACATC-3 ' ；
[0035] (6)扩增的全长基因 EgDGAT3-l克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌JM109,测序 确定序列完整性，-80度保存。
[0036] 实施例2
[0037]非洲油棕III型二酰甘油酰基转移酶基因(EgDGAT3_l)基因在大肠杆菌中的表达： [0038] (1)利用引物从pMD19-T载体上扩增EgDGAT3-l基因全长片段，退火温度为56 · 3度， 引物如下：
[0039] 上游引物F3:
[0040] 26-mer 5'-GGA TCC(BamH I)ATGGAGATCTCCGGTGCTGC-3'；
[0041] 下游引物R3:
[0042] 30-mer 5,-GAG CTC(Sac I)CTAAGCAGCAACAAGGCCTACATC-3，；
[0043] (2)扩增的全长基因 EgDGAT3-l克隆到pMD19-T载体上，得到重组质粒pMD19-EgDGAT3-l，转化大肠杆菌JM109，测序确定序列完整性，-80度保存；
[0044] (3)分别提取质粒pMD19-EgDGAT3-l和pQE30质粒，用BamH I和Sac I双酶切，分别 回收小片段和大片段;连接得到重组质粒pQE30-EgDGAT3-l;
[0045] (4)重组质粒转化大肠杆菌JM109，PCR和双酶切检测转化子;-80度保存阳性克隆；
[0046] (5)从大肠杆菌JM109中提取质粒pQE30-EgDGAT3-l，转化大肠杆菌Ml5，PCR和双酶 切检测转化子;-80度保存阳性克隆；
[0047] (6)对阳性克隆进行油脂提取，并用GC-MS检测油脂含量。
[0048]上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在大肠杆菌M15中表 达时，可以提高大肠杆菌M15细胞质油脂的含量，该提高值能达到20倍以上。EgDGAT3-l基因 克隆到PQE-30表达载体上，再转化宿主大肠杆菌菌株M15，经低浓度IPTG持续诱导后，大肠 杆菌M15细胞质中油脂含量明显提高。
[0049] 实施例3
[0050]非洲油棕III型二酰甘油酰基转移酶基因(EgDGAT3-l)基因在酵母中的表达：
[00511 (1)利用引物从PMD19-T载体上扩增EgDGAT3-l基因全长片段，退火温度为56.3度， 引物如下：
[0052] 上游引物F4:
[0053] 26-mer 5,-GGA TCC(BamH I)ATGGAGATCTCCGGTGCTGC-3，；
[0054] 下游引物R4:
[0055] 30-mer 5'-GAA TTC(EcoR I)CTAAGCAGCAACAAGGCCTACATC-3'。
[0056] (2)扩增的全长基因 EgDGAT3-l克隆到pMD19-T载体上，得到重组质粒pMD19-EgDGAT3-l，转化大肠杆菌JM109，测序确定序列完整性，-80度保存；
[0057] (3)分别提取质粒pMD19-EgDGAT3-l和pYES2质粒，用BamH I和EcoR I双酶切，分别 回收小片段和大片段;连接得到重组质粒pYES2-EgDGAT3-l;
[0058] (4)重组质粒转化大肠杆菌JM109，PCR和双酶切检测转化子;-80度保存阳性克隆；
[0059] (5)从大肠杆菌JM109中提取质粒pYES2-EgDGAT3-l，转化酵母Hl266，PCR和双酶切 检测转化子;-80度保存阳性克隆；
[0060] (6)对阳性克隆进行油脂提取，并用GC-MS检测油脂含量。
[00611上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高酵母体内油 脂含量中的应用。非洲油棕ΠΙ型二酰甘油酰基转移酶基因（EgDGAT3-l)在酵母H1266中表 达时，可以提高酵母H1266细胞质油脂的含量，该提高值能达到30倍以上。EgDGAT3-l基因克 隆到PYES2表达载体上，再转化宿主酵母菌株H1266,酵母菌株H1266细胞质中油脂含量明显 提尚。
[0062] 实施例4
[0063]非洲油棕III型二酰甘油酰基转移酶基因(EgDGAT3-l)基因在紫萍中的表达：
[0064] (1)利用引物从PMD19-T载体上扩增EgDGAT3-l基因全长片段，退火温度为56 · 3度， 引物如下：
[0065] 上游引物F5:
[0066] 26-mer 5,-GGA TCC(BamH I)ATGGAGATCTCCGGTGCTGC-3，；
[0067] 下游引物R5:
[0068] 30-mer 5,-GAG CTC(Sac I)CTAAGCAGCAACAAGGCCTACATC-3，；
[0069] (2)扩增的全长基因 EgDGAT3-l克隆到pMD19-T载体上，得到重组质粒pMD19-EgDGAT3-l，转化大肠杆菌JM109，测序确定序列完整性，-80度保存；
[0070] (3)分别提取质粒pMD19-EgDGAT3-l和PBI121质粒，用BamH I和Sac I双酶切，分别 回收小片段和大片段;连接得到重组质粒pBI121-EgDGAT3-l;
[0071] (4)重组质粒转化大肠杆菌JM109，PCR和双酶切检测转化子;-80度保存阳性克隆；
[0072] (5)从大肠杆菌JM109中提取质粒pBI 12l-EgDGAT3-l，转化农杆菌EHA105，PCR和双 酶切检测转化子;-80度保存阳性克隆；
[0073] (6)用EHA105(包含pBI121-EgDGAT3-l)农杆菌转化紫萍愈伤获得转基因植株(紫 萍愈伤诱导、再生和基因转化参见专利CN201410097053.X)，PCR和western blot检测转化 植株;MS(含1 %蔗糖+10mg/L Kan)液体培养基扩大培养转化植株；
[0074] (7)对阳性转基因植株进行油脂提取，并用GC-MS检测油脂含量。
[0075]上述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3_l在提高紫萍体内油 脂含量中的应用。非洲油棕ΠΙ型二酰甘油酰基转移酶基因（EgDGAT3-l)在紫萍中表达时， 可以提高紫萍叶状体细胞质油脂的含量，该提高值能达到10倍以上。EgDGAT3-l基因克隆到 pBI 121表达载体上，再转化进农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌侵染紫萍愈伤获得转基因紫 萍植株，筛选出来的阳性转化紫萍植株叶状体中油脂含量明显提高。
[0076]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l，其特征在于:所述的非 洲油棕的ΠΙ型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l，其特 征在于:所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。3. 权利要求1所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高生物 体内油脂含量中的应用。4. 根据权利要求3所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高 生物体内油脂含量中的应用，其特征在于:所述的生物体为大肠杆菌。5. 根据权利要求3所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高 生物体内油脂含量中的应用，其特征在于:所述的生物体为酵母。6. 根据权利要求3所述的非洲油棕的III型二酰甘油酰基转移酶基因 EgDGAT3-l在提高 生物体内油脂含量中的应用，其特征在于:所述的生物体为紫萍。
【文档编号】C12N15/63GK105861525SQ201610293869
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】黄明星
【申请人】广东工业大学