一种具有三脂酰甘油合成功能的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种具有Η脂醜甘油（TAG)合成功能的基 因及其应用。
【背景技术】
[0002] 在当今节能、减排、低碳等理念的引导下，开发可再生能源成为热口的研究方向。 目前大多数可再生能源都是W发电的形式提供能量，但是由于绝大多数运输工具仍W液体 燃料作为能源，因此电能无法直接解决目前运输工具的动力问题。
[0003] 生物燃料是目前惟一可W作为液体燃料的可再生能源，因此在可再生能源的发展 中占据着重要地位。生物己醇和生物柴油由于具有大规模生产的潜质，成为最有希望取代 石油的两种生物燃料。二者中，生物柴油更适合目前的内燃机，意味着从石油到生物柴油 基本不会影响当前运输网络的运行。况且生物柴油还拥有许多优于石油的特点，如降低一 氧化碳排放W及提高燃烧效率等等值emirbas，2007)。不同于生物己醇和天然气，生物柴 油可W利用目前成熟的石油运输系统进行快速配送，送为其大规模推广创造了有利条件 值emirbas，2008)。生物柴油主要来源于植物中的储存脂质，例如油料作物（花生、大豆、油 踪）中的Η脂醜甘油（tria巧Iglycerols,TAG)。理论上，如果大规模生产油料作物，必定能 够满足当前的能源需求，然而送一举措也会产生诸多问题，包括油料作物与人争粮争地，W 及提局净碳排放等等。
[0004] 在送种情况下，产油微藻成为生物柴油行业的重要关注对象。大多数微藻的油脂 单位产量高于陆生植物，据报道，某些微藻的含油量占干重的75%W上（化isti，2008)。此 夕b微藻培养不占用耕地，且具有水上培养的潜在可能，海生藻更避免了与人争夺淡水的隐 患，因此微藻产油具有十分乐观的前景。
[0005] TAG是绝大多数微藻中最重要的储存油脂，在形成TAG的通路中，Η个脂醜辅酶 A分子通过内质网中的Kennedy Pathway,先后结合在甘油-3-磯酸分子的sn-1、sn-2和 sn-3位置（Kresge等，2005)。其中，甘油-3-磯酸脂醜转移酶（glycerolS-phosphate ac}dtransferase, GPAT)和溶血磯脂酸醜基转移酶（lyso地os地atidic acid ac}dtransferase, LPAT)分别将前两个脂醜基结合在甘油-3-磯酸分子的sn-1和sn-2 位，磯脂酸醋酶（Phosphatidic acid地os地atase,PAP)随后除去sn-3位上的磯酸基 团，形成二脂醜甘油（dia巧IglyceroLDAG)。TAG合成的最后一步反应也是该通路惟一 的限速步骤，该反应WDAG作为醜基受体，主要由二醜甘油醜基转移酶（diacylglycerol ac}dtransferases, DGAT)进行催化。
[0006] DGAT存在于所有已研究过的真核细胞中，与KennedyPathway中的其他醜基转移 酶相似，DGATW脂醜辅酶A作为醜基供体。目前已发现至少2类主要的DGAT家族，分别被 命名为I型和II型DGAT，送两类DGAT都是膜蛋白，尽管他们在TAG生物合成中扮演相同 角色，但在氨基酸序列上没有任何相似性。位于细胞基质的III型DGAT也已在植物中有报 道，目前认为参与角质素的合成（Rani等，2010)。在动物中，与I型DGAT相比，II型DGAT 对底物有更强的亲和力，积累TAG的速度也更快灯en等，2008)，小鼠的基因敲除实验表明 送两类DGAT在功能上是不重叠的一敲除掉I型DGAT的小鼠会肥胖化，而敲除掉II型 DGAT的小鼠则会在出生数小时之内死亡（化en等，2002)。在高等植物中，虽然I型和II 型DGAT的功能差异尚在争论中，但目前的报道都倾向于认为二者的表达模式在时空上都 存在差异。在油桐中进行的亚细胞英光免疫实验表明送两类DGAT在内质网上的分布并不 重叠（Shockey等，2006)，有关橄揽的研究发现I型DGAT在橄揽的油脂积累中起主要作用 度anilas等，2010)，而在油桐和藍麻（都含有稀有脂肪酸）油脂积累的报道中，则认为II 型DGAT起主要作用（Kroon等，2006)。对于两类DGAT的生化研究也为二者的差异提供了 线索，目前普遍认为I型DGAT负责催化16:0和18:1脂肪酸与DAG的sn-3位的结合，而II 型DGAT则负责催化稀有脂肪酸的结合（Li等，2010)。
[0007] 综上所述，DGAT在促进TAG的生物合成W及改良TAG品质等方面，都具有极其重要 的作用。因此，利用微藻中丰富多样的DGAT基因资源、采用基因工程的手段来提高生物体 TAG的含量和组分，进而提高产油量及燃料品质，在生物能源行业中必将拥有巨大的发展潜 力。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种具有Η脂醜甘油（TAG)合成功能的基因及其应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0010] 一种具有Η脂醜甘油合成功能的基因，基因为述核巧酸序列：
[0011] 1)基因为SEQIDΝ01所不的碱基序列；或，
[0012] 2)基因与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%W上同源性、且编码相同生 物学功能蛋白质的DNA序列。
[0013] 一种具有Η脂醜甘油合成功能的基因编码蛋白，所述基因编码的蛋白为下列氨基 酸序列
[0014] 1)基因编码的蛋白为SEQIDΝ02所示的氨基酸序列；或
[0015] 2)基因编码的蛋白通过将SEQIDN02的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸 残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQIDN02 的蛋白具有相同的生物学功能。
[0016] 一种具有Η脂醜甘油合成功能的基因的克隆方法，
[0017] 1)从ΙΜΕΤ1 的cDNA中扩增DGAT基因；
[0018] 2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻DGAT基因的全长编 码序列；
[0019] 其中，步骤1)所采用的引物为
[0020] NoDGAT-for;5'ATGACGCCGCAAGCCGAC3';
[0021] NoDGAT-rev: 5'CTCAATGGACAACGGGCGCGTCT3'。
[0022] -种重组载体，该重组载体含有权利要求1所述的基因序列。
[0023] -种宿主细胞，该宿主细胞含权利要求4所述的重组载体。所述的宿主细胞为酵 母。
[0024] -种具有Η脂醜甘油合成功能的基因的应用，将所述基因作为二醜甘油醜基转移 酶，应用于促进Η脂醜甘油的生物合成W及改良Η脂醜甘油的品质中。
[00巧]本发明所具有的优点：
[0026] 本发明的基因位于微拟球藻藻株ΙΜΕΤ1的核基因组，所编码的蛋白全名为二脂醜 甘油醜基转移酶值GAT)，本发明还涉及该基因的功能和用途。本发明分离出了该DGAT基因 的全长cDNA序列，并采用酵母DGAT缺失突变系统，进行该基因的功能互补实验，实验证明 该基因能够提高模式生物酵母的TAG合成能力，而且该DGAT在合成TAG时，对于不同脂肪 酸底物的吸收具有偏好性。所公开的全长基因及氨基酸序列为微拟球藻中的首次报道，丰 富了DGAT基因家族的成员；该基因能够显著提高酵母合成TAG的能力，证明了其在利用基 因工程手段提高生物体生产TAG方面的应用价值；此外，该基因在合成TAG时，对于不同脂 肪酸底物的吸收具有偏好性，因而还具有改良生物体产油品质的应用潜力。
[0027] 本发明的TAG合成功能的基因，该基因是从微拟球藻（Nannochloropsis)中分离 出来的二醜甘油醜基转移酶DGAT基因。该TAG合成功能的基因在提高生物体TAG含量方 面具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例提供的基因的物种间同源性分析图。
[0029] 图2为本发明实施例提供的酵母表达载体的构建过程图。
[0030] 图3为本发明实施例提供的基因在酵母中产生TAG的检测结果图。其中，图3A是 薄层色谱的检测结果，图3B是用ESI-MS对TAG进行定量的结果。
[0031] 图4为本发明实施例提供的基因对酵母TAG中的脂肪酸链组成的影响图。其中X 轴为脂肪酸种类，y轴为脂肪酸所占百分比，*表示t检验有显著差异（P<0. 05)。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。
[0033] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆 (Mole州larCloning:AL油oratoryManual,3rded.)或酵母遗传法实验指南（Method inYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual,AdamsAetal 编，ColdSpringHarborL油oratory, 1998出版）中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
[0034] 实施例一；NoDGAT全长编码区的克隆与分析
[0035]利用PCR技术从产油微拟球藻Nannochloropsisoceanica(IMETl)的cDNA中克 隆DGAT基因，所用引物依据本实验室前期的数据分析基础进行设计，并在引物的两端引入 需要的酶切位点，交由上海生工合成：
[0036]NoDGAT-for;5'ATGACGCCGCAAGCCGAC3';
[0037]NoDGAT-rev: 5'CTCAATGGACAACGGGCGCGTCT3'。
[0038] 所用PCR仪为邱pendo;rf公司的Master切cler,反应体系50μL,包括4μL dNTP(2. 5mMeach,TAKARA)，正反向引物各 2uL(10uM)，5uL10Xbuffer(Mg2+plus， TAKARA)，0. 4μLrTaq酶巧U/μLTAKARA)，1μLDM模板巧Ong/μL正、负对照分别加 入等体积的相应质粒和野生型DM)，W及超纯水35. 6μL。反应体系如下：起始94°C预变 性3min，然后94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸l-2min，30个循环，最后72°C反应 7min。
[0039] 反应结束后，取5μΙPCR产物与luL6XloadingbuffeHTAKARA)混匀，点入 1% (w/v)的琼脂糖度I0WEST)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上W120V电泳 25min后，使