专利名称：：新型甘油糖磷脂及其抗体和支原体的检测方法
技术领域：
：本发明涉及来自发酵支原体的新型甘油糖磷脂、特异地存在于发酵支原体的对于甘油糖磷脂的抗体以及使用该抗体对甘油糖磷脂进行测定的方法和检测发酵支原体的方法。
背景技术：
：本发明者们曾从MT-4细胞(HTLV-I(人T淋巴细胞趋向性逆转录病毒I)感染的人辅助T细胞(Miyoshi等.Gann，71，155-156(1980)))发现5种甘油糖磷脂(含有磷酸胆碱的甘油糖脂)，其中的1种是6′-O-磷酸胆碱-α-吡喃葡糖基(1′-3)-1，2-二酰基-sn甘油(脂质生化学研究，第35卷、第111～114页、1993年)。另一方面，有报告说发酵支原体(Mycoplasmafermentans)是人体获得性免疫缺损症(爱滋病；AIDS)的增恶因子(Lo.S.，-C等，1991，科学2511074-1076；美国专利第5,242,820号)、或风湿症的原因(Williams，M.H.等，1970，柳叶刀ii277-280)。以往，已知有各种支原体的抗体，并应用于临床检查，但大多是针对肺炎支原体(M.Pneumoniae)或生殖支原体(M.genitalium)的抗体。另外，也有对于这些支原体的单克隆抗体，但一般认为这些抗体是同时识别支原体的蛋白质或蛋白质和脂质的抗体，不论任何一种对发酵支原体都不显示特异性(特开昭63-298、特开昭63-184064、特开昭63-32496、特开平5-304990、美国专利第5,158,870号、美国专利第4,945,041号、美国专利第5,242,820号)。此外，美国专利第5,242,820号公开了对于发酵支原体显示特异性的抗体，但这是以菌体的全提取物作为免疫原而得到的抗体，可认为是识别蛋白质的抗体。所以若使用该抗体检测含有各种蛋白质的血清等体液中的支原体时，一般认为该抗体进行非特异结合的可能性高，不能期待高灵敏度。另外，也要充分考虑到抗原是蛋白质时，由于蛋白质的氨基酸序列的变化而完全有可能失去抗原性。据本发明者们所知，还没有关于支原体具含有磷酸胆碱的甘油糖磷脂的报告。而且也不知道来自支原体的甘油糖磷脂质作为免疫原，得到对该甘油糖磷脂显示特异性的抗体例子。进而，也全然不知对于该甘油糖磷脂显示特异性的抗体，对于发酵支原体会显示出高特异性。发明的公开有关于支原体感染可加速人体获得性免疫缺损病毒感染者的爱滋病病情的报告(1991，科学2514991)，如上所述，也有所谓发酵支原体是爱滋病的增恶因子的报告，但还没有可正确检测出在生物体中，这种发酵支原体的消长动态的手段，从而希望能有在免疫学上可检测出生物体内的发酵支原体的抗体。本发明就是从上述观点着手，对特异地存在于发酵支原体内的甘油糖磷脂质的进行解析，研制出对于该甘油糖磷脂的抗体，最终提供使用该抗体的甘油糖磷脂的测定法及检测发酵支原体的方法作为课题而展开的。本发明者为了查明由于逆转录病毒感染而引起细菌异常增生、细胞破坏及免疫异常，在解析这些感染细胞脂质的过程中，意外地确认了从人体辅助T细胞株提取的甘油糖磷脂(含有磷酸胆碱的甘油糖脂质)就是来自发酵支原体的甘油糖磷脂(含有磷酸胆碱的甘油糖脂以下简称为“甘油糖磷脂”)并解析出该脂质的结构。进而在制成对于该脂质的抗体，确认对于各种支原体的特异性时，发现该抗体特异地识别发酵支原体，从而实现了本发明的目的。即，本发明的从发酵支原体提取得到甘油糖磷脂具有以下性质(A)与地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道尔夫试剂及茚三酮反应。(B)可用碱分解。(C)在通过具有二乙胺基乙基的阴离子交换体分级中，作为非吸附级分而得到。(D)通过质谱仪测定的分子量是1048+28n(n是-1、0、1或2)。上述甘油糖磷脂可能是以α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油、磷酸胆碱及氨基丙二醇的磷酸酯作成构成成分的这种可能性很高。另外，本申请发明至少是含有磷酸胆碱、葡萄糖、脂肪酸及甘油，对具有二乙胺基乙基的阴离子交换体呈非吸附性的脂质，是对于碱不稳定的甘油糖磷脂具有反应特异性的抗甘油糖磷脂质抗体。该甘油糖磷脂可以是，例如特异地存在于发酵支原体的甘油糖磷脂。作为上述抗甘油糖磷脂抗体的具体形式，本申请发明提供了能与6′-O-磷酸胆碱-α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油和具有以下性质的，从发酵支原体提取得到的甘油糖磷脂两者进行反应的抗甘油糖磷脂多克隆抗体以及对于有以下性质的甘油糖磷脂质的，具有反应特异性的抗甘油糖磷脂质单克隆抗体(A)与地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道尔夫试剂及茚三酮反应。(B)可用碱分解。(C)在通过具有二乙胺基乙基的阴离子交换体分级中，作为非吸附级分而得到。(D)通过质谱仪测定的分子量是1048+28n(n是-1、0、1或2)。另外，本申请发明提供了甘油糖磷脂测定法，其特征是使用上述抗甘油糖磷脂抗体，用免疫学方法测定检样中具有上述性质的甘油糖磷脂；还提供了发酵支原体的检出法，其特征是用该方法测定检样中的甘油糖磷脂，将该甘油糖磷脂是否存在或其存在量和检样中的发酵支原体是否存在或其存在量相互联系起来。进而，本发明提供了甘油糖磷脂和/或与该甘油糖磷脂质的抗原性类似的物质测定法，其特征是使用上述抗甘油糖磷脂抗体免疫地测定检样中具有上述(A)～(D)性质的甘油糖磷脂和/或抗原性类似该甘油糖磷脂的类似物。另外，本申请发明提供了检测试剂盒，它是通过免疫学方法检测检样中的发酵支原体或发酵支原体的甘油糖磷脂的试剂盒，其特征是，其含有上述抗甘油糖磷脂抗体和用标记物质标记的发酵支原体的甘油糖磷脂或用标记物质标记对于免疫动物的免疫球蛋白抗体的二次抗体。上述免疫动物球蛋白是使用制备上述抗体的免疫动物以外的动物制备的。进而，本申请发明提供选自爱滋病、肾炎及HTLV-1的有关骨髓病的疾病的检测法，其特征是检测含在血液中的，具有上述(A)～(D)性质的甘油糖磷脂或抗原性与该甘油糖磷脂质类似的物质或对于这些甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体。另外，本说明书中，将特异存在于发酵支原体的甘油糖磷脂，简称为“甘油糖磷脂”。以下，详细地说明本发明。<1>本发明的甘油糖磷脂本发明的抗体是对于发酵支原体(Mycoplasmafermentans)的甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体，是以该甘油糖磷脂作为抗原而产生的。首先，对发酵支原体的甘油糖磷脂加以说明。以往，已知在逆转录病毒感染细胞中是存在特有的脂质的，从HTLV-I感染的人体辅助T细胞中发现5种甘油糖磷脂(GGPLsGGPL-I、GGPL-II、GGPL-III、GGPL-IV、GGPL-V)。由本发明者们确定了其中的GGPL-I的结构(西田等，日本农业化学会志，第68卷第3号(1994)“1994大会讲演要旨集”第39页)。除GGPL-I以外，还确认了GGPLs的存在，但只是不知道其物性、结构等。本发明者们用HPTLC(高速薄层色谱)从确认的HTLV-I感染人体辅助T细胞(MT-4(GGPLT))和将其用抗支原体剂(Mc201(大日本制药(株)制))处理的MT-4(GGPL-)产生的脂质组中，分离出GGPLs，在用地衣酚(orcinol)试剂染色糖脂、用地特马(Dittmer)试剂染色磷脂时，检测出在T-4(GGPL+)上看到、而在MT-4(GGPL-)上没有看到的2条带，(图4)。这2条带，也可从加入能透过微孔直径为0.22μm的过滤器的MT-4(GGPL+)细胞培养上清液后，从培养的MT-4(GGPL-)细胞中检测出。如以下实施例所述，其中的一种是GGPL-I，另一种是GGPL-III。还没有支原体属微生物是以含有磷酸胆碱的甘油糖磷脂作为细胞构成成分的报告，一般认为GGPLs是来自人体细胞的，但上述结果表明是来自发酵支原体。因此，可认为只要得到对于上述甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体，就可检测出发酵支原体。发酵支原体的甘油糖磷脂可从发酵支原体的培养物中制备。发酵支原体可用如下方法得到。将确认有GGPLs的(“GGPL阳性”)培养细胞，例如MT-4细胞[HTLV-I(人体T淋巴细胞趋向性逆转录病毒1型)感染的人体辅助T细胞]的培养上清液，用孔隙尺寸0.22μm的过滤器过滤，在滤液中可得到发酵支原体。另外，也可使用发酵支原体PG18株等的模式菌株等。使用PPLObroth(DifcoLaboratories)琼脂培养基等培养得到的发酵支原体，将菌落分离后，若在含有10％(V/V)牛胎血清(FBS)、5％(W/V)酵母提取物(フロ-ラボラトリ-ズ制)、1000单位/ml青霉素、1％(w/v)右旋糖、0.002％(w/v)酚红的PPLObroth(ディフコラボラトリ-ズ制)等的液体培养基中培养，就可得到发酵支原体的培养菌体。接着，在发酵支原体的菌体中加入甲醇，放置数小时后，加入氯仿进行超声波处理，进而，放置数小时后，使用手提型聚四氟乙烯匀浆器匀化菌体，回收上清液，蒸馏该上清液，可得到脂质提取物。这样得到的脂质提取物含有甘油糖磷脂。如实施例所述，将该脂质组分涂敷在HPLC(高速薄层色谱)板上，用氯仿∶甲醇∶0.2％(w/v)氯化钙水溶液＝50∶45∶10(v/v/v)的混合溶剂展开，进行磷脂的分析时，可检测出6条带(脂i、脂ii、脂iii、脂iv、脂v及脂vi)(图3)。由TLC上的谱带表明其中的脂v及脂vi分别相当于GGPL-I及GGPL-III。另外，由FAB质谱测定的结果，可确认GGPL-I与脂v相同，GGPL-III与脂vi相同。发酵支原体的甘油糖磷脂也可由感染的发酵支原体的MT-4细胞得到。例如，用添加10％(v/v)FCS(小牛胎血清)的RPMI-1640培养基培养MT-4细胞，对于用PBS(磷酸缓冲生理食盐水)洗涤的细胞，使用氯仿∶甲醇(＝2∶1、1∶1或1∶2)的混合液400ml，进行脂质提取。将上述得到的发酵支原体或MT-4细胞的脂质提取物，使用具有二乙胺基乙基(DEAE)基的阴离子交换树脂，例如DEAE-交联葡聚糖A25(法马西亚公司制)等，分成非吸附组分(中性组分)和吸附组分(酸性组分)，得到非吸附组分。将该非吸附组分加入到二氧化硅柱中，用氯仿/甲醇/水(83∶16∶0.5～20∶80∶8(v/v)的浓度梯度进行冲洗，可将GGPL-III与其他磷脂分开。进而，用1-丙醇/氨水/水(80∶5∶15～75∶5∶20)的浓度梯度洗脱，分离出GGPL-I。GGPL-I及GGPL-III的任一种，对于地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道尔夫试剂(Dragendorff)(染色胆碱)均呈阳性，此外还可被温和碱处理而分解。进而，GGPL-I在茚三酮反应(染色氨基)中呈阴性，但GGPL-III是阳性。对精制的GGPL-III进行的物理化学分析，其结果如下所示。①红外线吸收光谱检测出分别对应于-CH2及-CH3基、羟基、酯羰基、磷酸基、胆碱基及伯氨基的吸收峰。②液体2次离子质量分析(LSIMS)检测结果表明在分子中至少存在3种脂肪酸。另外GGPL-III中至少存在4种分子，其中，主要成分的分子量是1048。而且表明也存在分子量1020、1076及1104的GGPL-III。③串联质谱(MS/MS)测定表明在分子中存在磷酸胆碱。另外得知GGPL-III主要成分的分子量是1048。④一维NMR氢(1H)谱检测出甘油的信号、胆碱的信号以及葡萄糖的信号。进而，由于预测到存在氨基丙二醇，所以与用3-氨基丙烷-1，2-二醇(1-氨基丙烷-2，3-二醇)及2-氨基丙烷-1，3-二醇的标准品得到的一维NMR氢(1H)谱和GGPL-III氢谱进行比较，结果表明了GGPL-III作为构成成分含有2-氨基丙烷-1，3-二醇的可能性。⑤二维NMR氢谱(PH-DQF-COSY法)确认了来自二酰基甘油的质子信号。另外还确认了胆碱质子信号。⑥二维1H-32P的NMR谱显示在1个分子GGPL-III中含有2个P(磷)。另外还推断含有磷的化合物，结合在葡萄糖残基的1位或6位上。该位置中6位的可能性更高。而且提示在胆碱上结合了磷酸基的磷酸胆碱的结构，推断在葡萄糖残基的6位上，首先结合氨基丙二醇的磷酸酯，进而，在该氨基丙二醇的磷酸酯上具有结合磷酸胆碱的结构。从以上结果来看，GGPL-III是具有下述性质的新型甘油糖磷脂。(A)能与地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道尔夫试剂及茚三酮试剂反应。(B)能被碱分解。(C)在DEAE基的阴离子交换柱的分级中，可作为非吸附组分而得到。(D)由质谱仪测定的分子量是1048+28n(n是-1、0、1或2)。进而，上述结果表明GGPL-III是以α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油、磷酸胆碱及氨基丙二醇的磷酸酯作为构成成分。可推断该氨基丙二醇的磷酸酯是2-氨基丙烷-1，3-二醇的磷酸酯，其结合部位是α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-Sn-甘油的葡萄糖残基的6′位。而且提示在该2-氨基丙烷-1，3-二醇的磷酸酯上结合有磷酸胆碱。另外，可推断GGPL-III的主要成分作为酰基具有2个棕榈酰基，其推定结构如下述(I)式，是在GGPL-I(6′-O-磷酸胆碱-α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二棕榈酰基-sn-甘油)的葡萄糖残基和磷酸胆碱之间插入有2-氨基丙烷-1，3-二醇的磷酸酯的结构。另外，可推断分子量不同的其他的GGPL-III分子，是α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油中的酰基不同种类物质，对于分子量1020的，具有肉豆蔻酰基和棕榈酰基，对于1076的，具有棕榈酰基和硬脂酰基，对于1140的，推断具有2个硬脂酰基或是棕榈酰基和二十烷酰基，但详细情况不明。<2>本发明的抗体的制备本发明的抗体可以来自发酵支原体的甘油糖磷脂作为抗原，进行动物免疫，再从该动物分离血清，或取该动物产生的抗体细胞，继续传代培养，从其培养物中回收得到。以下举例说明本发明抗体的制备法，但不限制本发明，只要用发酵支原体的甘油糖磷脂做抗原，即使通过其他方法制备也可。(1)多克隆抗体的制备在由上述得到的发酵支原体的脂质提取物中，加入单磷脂、弗罗因德式完全佐剂及矿物油，混合后再加入含有0.1％(v/v)Tween80的PBS(磷酸缓冲生理食盐水)进行乳化。接着，将得到的乳化物对小白鼠、白鼠、兔子、豚鼠、羊等动物进行皮下注射或注入腹腔中。初次免疫后，用常法在第2～3周后进行追加免疫，可得到效价高的抗血清。最终免疫1周后，采取血样，分离血清。将该血清进行热处理，使补体失活后，用硫酸铵沉淀，用与离子交换色谱等通常抗体精制相同方法，得到免疫球蛋白组分。只是在最终免疫后，最好通过酶免疫测定法等确认血中抗体效价的高低。如上述得到的抗体，对于发酵支原体的甘油糖磷脂，具有反应特异性，不与关节炎支原体及人型支原体等其他的支原体的甘油糖磷脂反应。若不使用发酵支原体的脂质提取物，而使用精制的GGPL-III，可得到对于GGPL-III具有反应特异性的多克隆抗体。(2)单克隆抗体的调制可通过凯乐和密尔斯坦的方法(自然，495～492页，1975年)制得单克隆抗体。即，用对甘油糖磷脂产生抗体的哺乳动物的抗体产生细胞和骨髓瘤(myeloma)细胞融合，制作杂交细胞瘤，筛选出能产生目的抗体的杂交细胞瘤，通过培养该杂交细胞瘤，可在培养液中得到单克隆抗体。以下，对于每个工序分别加以说明。(i)动物的免疫及产生抗体细胞的制备产生对甘油糖磷脂抗体的细胞，可通过用甘油糖磷脂，免疫小白鼠、白鼠、兔子、豚鼠、羊等动物，可从该动物的脾脏细胞、淋巴节细胞、末梢血液等调配获得。用甘油糖磷脂将上述动物免疫可用与(1)相同的方法进行。为了得到对于GGPL-III具有反应特异性的单克隆抗体，也可用纯化的GGPL-III进行动物免疫，但也可使用由甘油糖磷脂质混合物免疫的动物产生抗体细胞，制备杂交细胞瘤从得到的杂交细胞瘤中，选择对于GGPL-III产生具有反应特异性的单克隆抗体株。按照该方法，不需要得到对于动物免疫所必需量的GGPL-III，只要有用酶免疫法可检测的微量GGPL-III就可以了。(ii)杂交细胞瘤的制备从用甘油糖磷脂免疫的动物采集产生抗体细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合。虽然用于细胞融合骨髓瘤细胞，可利用各种哺乳动物的细胞株，但优选的是使用与制备产生抗体细胞所用的动物相同的动物细胞株。另外，为了在细胞融合后能区别未融合细胞和融合细胞，骨髓瘤细胞株最好是用未融合的骨髓瘤细胞不能生存，只是杂交细胞瘤可以增殖，并具有标记的细胞株。例如，8-氮鸟嘌呤耐性株是次黄质-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT)缺陷型，其核酸合成是依靠denovo合成通路。这样的骨髓瘤细胞和产生正常抗体细胞的融合细胞(杂交细胞瘤)在含有次黄质、氨基喋呤、胸苷的培养基(HAT培养基)中，即使由于氨基喋呤阻碍denovo合成通路，由于存在胸苷、次黄质所以可通过来自淋巴细胞的补救回路合成核酸，所以能进行增殖。与此相反，8-氮鸟嘌呤抗性的骨髓瘤细胞，由于氨基喋呤阻碍denovo合成通路，所以不能合成核酸而死亡，另外，作为正常细胞的产生抗体细胞也不能长期培养。因此，由于产生抗体细胞和骨髓瘤细胞融合生成的杂交细胞瘤能在HAT培养基上增殖，所以可从非融合细胞选择出融合细胞(科学第145卷709页，1964年)。另外，作为骨髓瘤细胞，使用不分泌固有的免疫球蛋白的细胞株对于容易从杂交细胞瘤培养上清液取得目的抗体来看，是理想的。为了得到杂交细胞瘤的细胞融合，可进行例如以下的操作从免疫动物中摘出脾脏，悬浮于PRMI1640培养基中，调制细胞悬浮液。使该脾细胞和处于对数生长期白鼠骨髓瘤细胞例如SP2/0细胞(氮鸟嘌呤耐性、IgG非分泌ATCCCRL-1581)，按10∶1～1∶1左右进行混合，离心沉淀后，在沉淀中加入平均分子量1,000～6,000的聚乙二醇，使最终浓度达30～50％，进行细胞融合。不加入聚乙二醇，而在细胞混合液中加上电脉冲，也可进行融合。进行融合处理后的细胞，可在含有10％(v/v)牛胎血清(FCS)的RPMI1640培养基等上进行培养，然后悬浮在HAT培养基等的选择培养基上，分注于具96个孔的微型板上进行培养，使杂交细胞瘤生长。(iii)筛选产生对甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体的杂交细胞瘤上述得到的杂交细胞瘤，由于是产生了对应于多个抗原或抗原决定部位的各种单克隆抗体的杂交细胞瘤的混合物，所以从其中筛选出对于甘油糖磷脂具有反应特异性的单克隆抗体，特别是选择产生对于GGPL-III具有反应特异性的单克隆抗体的细胞株。另外，在与GGPL-III结合的单克隆抗体中，优选地选择对抗原性强的抗原决定部位产生的单克隆抗体的细胞株。产生对糖脂质的单克隆抗体的细胞株，可通过将其作为抗原使用的酶免疫法来进行选择。这样的方法，有如ELISA法，即是一种将抗原在微型板等上进行固相化，在其上加入杂交细胞瘤培养液再加入用酶、荧光物质、发光物质等标记的第2抗体后进行培养，根据结合的标记物质，检出抗体的方法。此时，也可将抗体固相化，在其中，依次加入抗原标记第2抗体，进行培养。此外，对于ELISA法，在下面还要进行详述。在不能得到精制的GGPL-III时，使用高速薄层色谱(HPTLC)板，分离发酵支原体的脂质组分，在该板上，依次加入杂交细胞瘤培养液、标记的2次抗体并培养后，能检测出标记物质结合的位置。只要该位置与通过HPTLC展开GGPL-III的位置相同，就可认为杂交细胞瘤产生了对于GGPL-III的单克隆抗体。只要得到对于GGPL-III的单克隆抗体，就可通过使用亲和层析等，从脂质组分中纯化出GGPL-III。只要确认出含有产生作为目标单克隆抗体的杂交细胞瘤，就可通过有限稀释法等从含有该杂交细胞瘤的孔中筛选出目的克隆。如后述的实施例所示，这样得到的对于GGPL-III产生具有反应特异性的单克隆抗体的杂交细胞瘤株，于1994年5月24日，在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所以FERMP-14324的保藏号收藏，于1995年5月26日，根据布达佩斯条约，移送到国际保藏，其保藏号为FERMBP-5115。(iv)单克隆抗体的制备若在适当的培养基中培养上述得到的杂交细胞瘤，在该培养上清液中，可得到本发明的单克隆抗体。进而，用常法，通过硫铵沉淀、离子交换层析、蛋白A或蛋白G的亲和色谱或者固定抗原的免疫吸附色谱等，可精制单克隆抗体。这样得到的单克隆抗体，与存在于没有感染发酵支原体的健康人血清中的含唾液酸糖脂质(神经节苷脂)、血小板活化因子(1-烷基-2-乙酰甘油-3-磷酸胆碱)或其部分脱酰基化物、磷酰胆碱或其部分脱酰基化物或鞘磷脂等的糖脂质及磷脂质，不显示交叉反应。本发明的单克隆抗体也可以直接使用，但也可使用相互分开的各组成成分。在抗体分级时，由于保存抗体的抗原结合部位(Fab)是抗原和抗体结合的必要条件，所以可使用不分解抗原结合部位的蛋白酶(例如纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶、木瓜酶)来处理抗体得到的含有抗原结合部位(Fab)的组分然后再使用该组分。另外，只要确定编码本发明的单克隆抗体的基因的碱基序列或抗体的氨基酸序列，就可进行基因工程，制出含有抗原结合部位(Fab)的片段。<3>本发明甘油糖磷脂及其抗体的利用方法本发明的抗体由于是对发酵支原体的特有的甘油糖磷脂具有反应特异性，所以可用该抗体对样品中的甘油糖磷脂进行免疫学检测。在检测中若使用对于GGPL-I及GGPL-III两者都具有反应特异性的抗体，就可测定GGPL-I及GGPL-III，只要使用GGPL-III具有反应特异性的抗体，就可选择性地测定GGPL-III。在测定GGPL-III时，上述得到的GGPL-III作为标准物来使用。另外，作为上述待检测样品中的甘油糖磷脂，可有从生物体的检样提取的脂质组分。作为免疫学的测定法，可使ELISA法、免疫染色法等以及使用抗体的通常的免疫学的方法。例如通过使检样液与抗甘油糖磷脂抗体结合的固相接触，再使含在检样液中的甘油糖磷脂与上述抗体结合，从固相分离除去非吸附组分，接着，使用标记物质标记的发酵支原体的甘油糖磷脂质与上述固相接触，使含在上述检样液中的甘油糖磷脂质和标记化的甘油糖磷脂质进行竞争反应，检测出结合在固相的标记物质或未结合在固相的标记物质中的任何一种，可测定检样液中的甘油糖磷脂质。另外，通过使检样液和用标记物质标记的甘油糖磷脂质在抗甘油糖磷脂质抗体结合的固相上接触，然后再使含在上述检样液中的甘油糖磷脂质和标记的甘油糖磷脂质与上述抗体进行竞争结合，通过检测结合在固相的标记物质或未结合在标记物质的任何一种，可测定出检样中的甘油糖磷脂。此时，不用标记的甘油糖磷脂，而用无标记的标准甘油糖磷脂，使检样中的甘油糖磷脂和标准甘油糖磷脂进行竞争反应后，使标记物质标记化的抗甘油糖磷脂抗体与固相接触，也可以检测出结合在固相的标记物质或未结合在固相的标记物质的任何一种。另外在测定时，也可使用标记化的二次抗体。进而，将检样液中的甘油糖磷脂结合在固相上，使标记了的抗甘油糖磷脂抗体与其接触，也可检测出结合在固相标记物质或未结合在固相的标记物质中的任何一种。另外，使标准甘油糖磷脂结合在固相，将检样液及标记化的抗甘油糖磷脂质抗体与其接触，也可检测出结合在固相的标记物质或未结合在固相的标记物质中的任何一种。在此时也可使用标记二次抗体。作为标准甘油糖磷脂，如使用精制的GGPL-III，就可测定出检样中的GGPL-III含量。进而，使检样液与甘油糖磷脂抗体结合的固相接触，再使含在检样中的抗甘油糖磷脂抗体与上述抗体结合，从固相分离除去非吸附成分，接着，使抗人体免疫球蛋白抗体与用标记物质标记的二次抗体反应，通过检测出标记物质，测定出检样中的抗甘油糖磷脂抗体。由于本发明的甘油糖磷脂质是发酵支原体所特有的，所以可通过检查检样中有无抗甘油糖磷脂抗体，得知有无发酵支原体的感染。另外，已知对免疫测定法有各种方法，任一种方法均能适用于本发明。除了使用上述固相的方法之外，也可采用用于测定半抗原、抗原的免疫测定法例如可采用液相法，该法是使检样中的甘油糖磷脂和标记化的甘油糖磷脂与上述抗体进行竞争反应，如聚乙二醇、右旋糖、二次抗体等来分离与抗体结合的抗原和游离的抗原，然后检测出游离的标记抗原的标记物质的方法。作为上述固相，可举出琼脂糖、胶乳粒子、聚苯乙烯、尼龙等微型板等带孔的通常材料及形态(粒子、微粒子、试管、微型板、带型等)的。在使抗体或甘油糖磷脂结合在固相上后，最好是使用BSA(牛血清白蛋白)和明胶等进行阻断。另外，作为标记物质，可举出过氧化物酶、碱性磷酸酯酶等，通过酶反应可使色素发色的酶；放射性同位素；荧光素异硫氰酸盐等的荧光色素等。色素对于过氧化物酶，可以使用4-氯-1-萘酚、邻苯二胺(OPD)或3，3′-二氨基联苯胺等，对于碱性磷酸酯酶，使用对硝基苯磷酸酯等。由于发酵支原体具有本发明所述甘油糖磷脂，所以可使用本发明的抗甘油糖磷脂抗体来检测发酵支原体。例如从检样提取脂质组分，使该脂质提取物与固相接触，吸附脂质，用本发明的抗体与吸附脂质的固相反应，在同时或在其后，再与能对标记物质标记的该抗体反应的抗免疫球蛋白抗体反应，通过检测标记物质，可检测出检样中的发酵支原体。另外，由于本发明所述的甘油糖磷脂是发酵支原体所特有的，所以用上述方法，测定检样中的甘油糖磷脂，将甘油糖磷脂是否存在或其存在量和检样中发酵支原体是否存在或其存在量联系起来，也可检测发酵支原体。在上述甘油糖磷脂的测定法或发酵支原体的检测法中，作为检样，可以是血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿、关节液或细胞培养液(上清)等。除了上述方法之外，也可通过将生物体组织或细胞，直接或将甘油糖磷脂进行固定处理后，使其与用标记物标记的抗甘油糖磷脂抗体反应，使标记化的抗体与发酵支原体感染的生物体组织或细胞结合，通过测定标记物质，也可检测出发酵支原体。作为固定处理的方法，可举出例如使用甲醛、戊二醛、多聚甲醛等的方法。另外，不使用标记物标记的抗甘油糖磷脂，也可使无标记的抗甘油糖磷脂抗体与固定处理的生物体组织或细胞反应，在同时或其后，使用标记物标记的针对上述免疫动物的免疫球蛋白的二次抗体(该免疫球蛋白抗体是使用制备上述抗体免疫动物以外的动物制备的)进行反应，再将标记了的二次抗体与发酵支原体感染的生物体组织或细胞结合，然后测定标记物质来进行。采用免疫学方法检测被检样品中的甘油糖磷脂或发酵支原体时，若预先准备好含有对于发酵支原体的甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体和用标记物质标记针对上述免疫动物的免疫球蛋白抗体的二次抗体的试剂盒，(上述免疫球蛋白抗体是使用制备上述抗体免疫动物以外的动物制备的)就可以简便地进行测定。作为具体的试剂盒例子，可以是由微型板、BSA(牛血清白蛋白)等的阻断试剂、发酵支原体的甘油糖磷脂(标准物)、本发明的抗体、过氧化物酶标记的抗白鼠IgG抗体、过氧化氢水、OPD、洗涤用缓冲液所组成的试剂盒。抗体类、发酵支原体的甘油糖磷脂等最好是冷冻干燥品，或将其溶解在可稳定保存的溶剂中。发酵支原体的检测，可应用于下述的诊断法。①逆转录病毒感染症的发病预测有关于发酵支原体是爱滋病(后天性获得性免疫缺损综合症)的增生因子的报告(Lo，S.-C.等，1993.微生物学研究144，489-493)。爱滋病即HIV(人体免疫缺损病毒)感染，也不一定发病，通常潜伏期长，发病与发酵支原体的复合感染有关。同样，可以认为其他的逆转录病毒感染症发病也可能与发酵支原体有关。在HIV潜伏感染的细胞培养液中，以表1表示的脂质浓度(最终浓度)，加入由各种支原体提取的脂质，进行培养用光学显微镜检查被破坏的细胞数，用作HIV的诱导频率的指标。其结果如表1所示。表1</tables>由该结果及以往的报告表明，发酵支原体具有诱导逆转录病毒增殖的活性。因此，通过对逆转录病毒感染者的血液等检查，看有无发酵支原体的复合感染，可进行发病的预测，进而采取适宜的处理措施。②风湿病的诊断已有发酵支原体是风湿病的原因的报告(Williams，M.H.等，柳叶刀ii277-280(1970))。因此，通过使用本发明抗体，通过检测发酵支原体，有可能对风湿病进行诊断。③对于击靶疗法的应用将叠氮脱氧胸腺嘧啶核苷、双脱氧肌苷等抗HIV药剂或/和抗支原体剂结合的本发明抗体给药于逆转录病毒感染者及风湿病患者，可期待应用在逆转录病毒发病的预防或风湿病的治疗上。④作为中和抗体在治疗上应用本发明的抗体与发酵支原体结合后可以期待具有作为可阻止由其感染的中和体的活性，将该抗体注入生物体内，可用于发酵支原体复合感染可能性高的病毒感染的病害的治疗及预防。如后述实施例所示，认为在肾炎患者的血液中，本发明的抗甘油糖磷脂抗体与脂质的结合率高，表明了可通过检测该脂质，进行肾炎的诊断。该脂质，从HPTLC上的位置可与GGPL-III区别，但从能与识别GGPL-III的单克隆抗体结合来看，可认为在抗原性方面是与GGPL-III类似的脂质。因此使用本发明抗甘油糖磷脂可免疫地测定抗原性类似于GGPL-III的物质。图的简单说明图1是表示各种支原体的16S-23S核糖体RNA基因之间间隔区域的第一阶段PCR的扩增产物的电泳结果图。1.从MT-4细胞分离的发酵支原体GGPL株2.发酵支原体PG183.猪鼻支原体DBS10504.精氨酸支原体G2305.口腔支原体CH192996.唾液支原体PG207.透过支原体GTV-54-6A18.阴性对照(negativecontrol)图2是表示用各种限制酶处理发酵支原体的16S-23S核糖体RNA基因间间隔区域的第二阶段PCR的扩增产物的片段电泳结果图。1.VspI，2.HindIII3.ClaI，4.HincII，5.HaeIII，6.无处理图3是表示含在发酵支原体脂质组份的磷脂的TLC带形(密度测定法)图。图4是表示含在发酵支原体感染的或非感染的MT-4细胞的脂质组份的磷脂质及糖脂质的TLC带形图。PC是表示磷酰胆碱，SPM表示鞘磷脂，图5是表示GGPL-III的红外吸收光谱6是表示用GGPL-III的(+)法的液体2次离子质谱图。图7是表示用GGPL-III的(-)法的液体2次离子质谱图。图8是表示用GGPL-III的(+)法的串联质谱图。图9是表示用GGPL-III的(-)法的串联质谱图。图10是表示一维NMR氢(1H)谱11是表示3-氨其丙烷-1，2-二醇(1-氨基丙烷-2，3-二醇)(A)及2-氨基丙烷-1，3-二醇的一维NMR氢(1H)谱(B)图。图12是表示用GGPL-III的PH-DQF-DOSY法的二维NMR氢(1H)图。图13是表示GGPL-III的二维NMR(1H-31P)谱图。图14是表示含在各种支原体的脂质组份的磷脂的TLC结果(用地特马试剂染色)图。1.发酵支原体GGPL株2.隐性发酵支原体ィンコゲニタス3.发酵支原体PG18株4.发酵支原体F17株5.发酵支原体F1株6.发酵支原体F7株7.关节炎支原体8.人型支原体图15是表示用实施例2的多克隆直抗体对用HPTLC分离的MT-4细胞的脂质组份进行免疫染色的结果照片。图16是表示使用实施例3的单克隆抗体，进行对用HPTLC分离的各种支原体的脂质组份结果照片。(数字与图14相同。)图17是表示使用本发明的单克隆抗体，免疫染色发酵支原体感染的MT-4细胞结果的照片。图18是表示使用实施例3的单克隆抗体，免疫染色用HPTLC分离的肾炎患者及正常人血液中提取的脂质的结果图。“肾炎患者”是表示从肾炎患者血液提取的脂质，“正常个体”是从正常人血液提取的脂质结果。为了实施本发明的最佳条件以下，用实施例进一步具体地说明本发明。实施例1新型甘油糖磷脂的分离及其结构解析<1>发酵支原体的培养及脂质的制备用孔隙尺寸0.22μm的过滤器，过滤含有GGPLs的MT-4细胞(人体T淋巴细胞趋向性逆转录病毒I(HTLV-I)感染的人体辅助T细胞株(的培养上清液，将该滤液接种在PPLObroth(ディフコ·ラボラトリ-ズ制)琼脂培养基上进行培养，分离菌落后，在含有10％(v/v)牛胎血清(FBS)、5％(w/v)酵母提取物(フロ·ラボラトリ-ズ制)、青霉素1000单元/ml、1％(w/v)右旋糖、0.002％(w/v)酚红的PPLObroth(ディフコ·ラボラトリ-ズ制)的液体培养基中培养。形成的菌落呈现碎(フラィド)蛋状，可确认是支原体。进而提取上述支原体的DNA，用2步PCR(Harasawa，R.等，1993微生物学研究，144489-493)对16～23S核糖体RNA基因的间隔区域进行扩增，并与发酵支原体模式菌株PG18、猪鼻支原体(M.hyorhinis)DBS1050(ATCC17981)、精氨酸支原体(M.arginini)G230(ATCC23838)、口腔支原体(M.orale)CH19299、唾液支原体(M.salivarium)PG20(ATCC23064)、透过支原体(M.penetrans)GTU-54-6A1的各菌种进行比较。其结果，第1阶段PCR产物与发酵支原体的模式株的PG18株一致(图1)。进而，使用该PCR产物进行第2阶段的PCR得到的扩增产物能被VspI及HindIII切断，而ClaI、HincII及HaeIII不能切断(图2)，所以本微生物被确认为发酵支原体，被命名为GGPL株(M.fermentansGGPLstrain)。在用上述方法培养的发酵支原体菌体1g中，加入100ml甲醇，放置数小时后，加入200ml的氯仿，进行超声波处理，进而放置数小时。将其用手提型聚四氟乙烯匀浆器匀浆后，将得到的悬浮液以10,000rpm进行离心，回收其上清液。通过蒸发其上清液，得到50mg的脂质提取物。<2>发酵支原体脂质组分的分析将由上述得到的发酵支原体的脂质组分涂敷在HPTLC(高速薄层色谱)板(默克公司制)上，用氯仿∶甲醇∶0.2％(w/v)氯化钾水溶液＝50∶45∶10(v/v/v)的混合溶剂展开，使用地特马试剂染色磷脂。用TLC光密度计(岛津制作所制CS910)，检测在580nm的吸收。其结果，检测出6条带(脂i、脂ii、脂iii、脂iv、脂v及脂vi)(图3)。另一方面，用已知方法(Bligh和Dyer，加拿大生理生化杂志，37，911-917(1959)提取来自发酵支原体感染的MT-4细胞及将其用抗支原体剂(MC201(大日本制药(株)制))处理得到的MT-4细胞的脂质组分。将各脂质组分提取物涂敷在HPTLC(高速薄层色谱)板(默克公司制)上，用氯仿∶甲醇∶0.2％(v/v)氯化钙水溶液＝50∶45∶10(v/v/v)的混合溶剂展开，使用地衣酚(orcinol)试剂染色糖脂质，使用地特马试剂(Dittmer)试剂，染色磷脂质时，检测出在MT-4(GGPL+)看到，而在MT-4(GGPL-)没看到的2条带(图4)。在这些带中的一条是已经知道结构的GGPL-I，另一条是GGPL-III。另外，其他的对地特马试剂呈阳性的带被认定是GM2、GM1a、GD1a，对地衣酚试剂呈阳性的带被认定是磷酰胆碱及神经磷脂(Matsuda，K.等Biochem.Biophys.Acta.，1168，123-129(1993))。另外，加入能透过微孔直径为0.22μm的过滤器的MT-4细胞(发酵支原体感染的)的培养上清液后，从培养的MT-4(用抗支原体剂PC201处理的)细胞提取的脂质组分，用HPTLC与上述相同的分析时，检测出上述2条带。因此，表明这些带，即GGPL-I及GGPL-III是来自发酵支原体的。这些GGPL-I及GGPL-III，从在TLC上的迁移率来看，分别相当于来自上述发酵支原体的脂v及脂vi。另外从FAB谱的结果可确认GGPL-I与脂v相同，GGPL-III与脂vi相同。在发酵支原体感染的MT-4细胞60ml(湿体积)中，加入400ml的氯仿∶甲醇＝2∶1，1∶1及1∶2，进行提取，得到993mg的总脂质。将总脂质上DEAESephadexA-25柱，分成非吸附组分(中性组分)及吸附组分(酸性组分)得到非吸附组分775mg。将该非吸附组分上依阿特柱(依阿特公司制)中，以氯仿/甲醇/水(83∶16∶0.5～20∶80∶8，v/v/v)的浓度梯度洗脱3次，最后以1-丙醇/氨水/水(80∶5∶15～75∶5∶20，v/v/v)的浓度梯度溶出，得到GGPL-III3mg。<3>GGPL-III的结构解析GGPL-III对于地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道尔夫试剂呈阳性，另外，用温和的碱处理时分解。进而，GGPL-I对于茚三酮反应呈阴性，但GGPL-III呈阳性。从这些结果表明GGPL-III是含有胆碱的糖磷脂。进而，如以下所示的方法进行了GGPL-III的结构解析。(1)红外线吸收光谱测定使用装有红外线显微镜(IMS-8000，岛津制作所制)的红外分光光度计(FTIR-8100M岛津制作所制)测定GGPL-III的红外线吸收光谱。其结果如图5所示。其结果，检测出分别对应于-CH2及-CH3基(2957、2920、2852、1467、1419、1378cm-1)、羟基(3271cm-1)、酯羰基(1740，1165cm-1)、磷酸基(1091cm-1)、胆碱基(970cm-1)，及伯氨基(1560-1670cm-1)的吸收。(2)液体2次离子质量分析(LSIMS)将上述纯的GGPL-III约1μg溶解在氯仿∶甲醇(1体积∶1体积)的混合溶液1μl中，在(+)法时，加入0.5mL3-硝基苄醇；在(-)法时，加0.5ml三乙胺作为基质进行混合。以这些混合溶液作为试样，使用TSQ70三连四层极型质量分析计(FinneganMAT制)进行液体2次离子质量分析。作为一次离子流使用加速到20KeV的铯离子(Cs+)。以250原子质量单位(amu)/sec的速度得到光谱。(+)法的光谱如图6所示，(-)法的光谱如图7所示。其结果用(+)法确认M/Z1021、M/Z1049及M/Z1077离子。由此提示，脂肪酸组成不同的GGPL-III分子至少存在3种。另外，其结论，GGPL-III的主要成分是M/Z1049的峰，其分子量是从1049减去质子质量1的1048。其他成分的分子量同样也是1020及1076。另外，对于(-)法，可确认M/Z1047、M/Z1076及M/Z1103离子，若与(+)法的光谱解析合并，说明GGPL-III分子至少存在4种脂肪酸组成不同的分子。其结论，(-)法的GGPL-III的主要成分是M/Z1047的峰，其分子量是在1047上加上质子质量1的1048。其他成分的分子量同样也是1104。从M/Z1076离子推断的分子量是1077，但从(+)法的结果推断的分子量是1076，由于与其他成分的分子量的差的相当于2个亚甲基，所以是1076。(3)串联质谱分析(MS/MS)将与LSIMS的试样相同制备的试样(用(+)法的试样及用(-)法的试样)，使用TSQ70三连四层极形质量分析仪(FinneganMAT制)进行串联质谱测定。作为一次离子流，使用加速到20KeV的铯离子(Cs+)，作为CAD(低能冲突活性化开裂)气体，使用维持在0.26帕斯卡(2.0mTorr)的氩气。以250原子质量单位(amu)/sec的速度得到谱。(+)法的谱如图8所示，(-)法的谱如图9所示。其结果，对于(+)法，可确认M/Z184离子及M/Z1049离子。提示了从M/Z184离子，GGPL-III的分子中存在磷酸胆碱。另外，得出结论，GGPL-III的分子量是从1049减去质子质量1的1048。对于(-)液，可确认M/Z1047离子。由此得出结论，GGPL-III的分子是在1047上加上质子质量1的1048。另外，通过LSIMS提示的多种GGPL-III中，分子量1048的分子是主要成分。(4)一维1HNMR谱将用重氮(H)置换的GGPL-III(500μg)、磷酰胆碱(2mg)、D-葡萄糖6-磷酸·2钠盐(东方酵母制)(约200μg)，分别溶解在0.5mL的〔2H〕二甲基亚砜((C2H3)2SO∶2H2O(98体积∶2体积))中使用GX-400光谱仪(日本电子制)，在60℃下，得到400MHz下的1H-NMR谱。作为标准样品的是四甲基硅烷。以葡萄糖(GlcH1)的信号的积分值作为1.00进行标准化，量化其他的信号强度。其结果如图10所示。其结果，在4.319ppm(GroH1b)、4.145ppm(GroH1a)、5.118ppm(GroH2)、3.677ppm(GroH3b)、3.562ppm(GroH3a)处检测出葡萄糖(Gro)的信号。另外，胆碱的信号是在4.074ppm(-POCH2-)、3.529ppm(-CH2N≡)、3.139ppm(-N(CH3)3)处检测到的。另外，使用3-氨基丙烷-1，2-二醇(1-氨基丙烷-2，3-二醇)及2-氨基丙烷-1，3-二醇的标准品，将分别用上述方法得到的一维1HNMR谱(分别是图11A、图11B)和GGPL-III的谱进行比较结果，GGPL-III中含有2-氨基丙烷-1，3-二醇的可能性高。进而，作为葡萄糖(Glc)的信号，明显地检测出4.647ppm(GlcH1)。(5)二维1HNMR谱使用与一维1HNMR相同制备的试样，用FX-400谱仪(日本电子制)，在60℃下，以400MHz，各维2000Hz宽，进行用PH-DQF-COSY法的二维1HNMR分析。其结果如图12所示。其结果可确认来自二酰基丙二醇的质子信号(图12中GroH2/H1b、GroH2/H1a、GroH2/H3b、GroH2/H3a)。另外，可确认胆碱(图中，-CH2-N-/-CH2OP-)的质子信号。(6)二维1H～31PNMR谱使用与一维1HNMR相同制备的试样，用FX-400谱仪(日本电子制)，在60℃下，以400MHz得到二维的1H-31PHMQC谱。其结果如图13所示。其结果一维(1HNMR)可得到与上述1HNMR相同的谱，而二维(31PNMR)可得到2条信号。这表示在1分子的GGPL-III中含有2个P(磷)。另外，在一维中，由于在出现葡萄糖残基的2位、3位、4位、5位的质子信号的位置(2.9～3.0ppm附近)和在二维测试中出现磷信号的位置(-0.9ppm及1.1ppm)上未检测出交叉的峰，所以可推断含磷的化合物结合在葡萄糖残基的1位或6位上。进而，分别检测出葡萄糖残基的6a位的质子信号(一维的在4.0ppm附近)和二维的磷的信号(-0.9ppm)及葡萄糖残基的6b位的质子信号(一维的在3.6ppm附近)和二维的磷的信号(-0.9ppm及1.1ppm)的信号交叉的峰。另外，由于检测出一维的胆碱信号(约4.05～约4.1ppm)和二维的磷的信号(-0.9ppm)的交叉峰，所以可在胆碱上可找到结合磷酸基的磷酸胆碱结构。进而，由于该磷酸胆碱的交叉峰葡萄糖残基的6a位的质子信号(第一元的4.0ppm附近)错开，所以可推断在葡萄糖残基的6位上首先结合氨基丙二醇的硝酸酯，进而在该氨基丙二醇的硝酸酯上结合磷酸胆碱的结构。归纳以上结果，GGPL-III是具有下述性质的新的甘油糖磷脂。(A)能与地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道尔夫试剂及茚三酮试剂反应。(B)可用碱分解。(C)可在具有DEAE基的阴离子交换柱的分级中，作为非吸附组分得到。(D)由质谱仪测定的分子量是1048+28n(n是-1、0、1或2)。进而，由上述结果提示了GGPL-III是以α-吡喃葡萄糖基(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油、磷酸胆碱及氨基丙二醇的磷酸酯作为构成成分。该氨基丙二醇的磷酸酯是2-氨基丙烷-1，3-二醇的磷酸酯，可推断其结合部位是α-吡喃葡糖-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油的葡糖残基的6′位。进而，提示在该2-氨基丙烷-1，3-二醇的磷酸酯上结合着磷酸胆碱。分子量不同的各GGPL-III分子，是α-吡喃葡糖-(1′-3)1，2-二酰基-Sn-甘油中具有不同种类的酰基的分子，可推断在主要成分(分子量1048)的酰基都是十六烷酰基，总的推断结构如上述(I)式所示。另外，具有其他的分子量的GGPL-III分子，酰基的长度不同，对于分子量1020的，可推断具有十四烷酰基和十六烷酰基，对于1076的，具有十六烷酰基和硬脂酰基、对于1104的，具有2个硬脂酰基或十六烷酰基和二十烷酰基。但详细情况不清楚。<4>各种支原体的脂质成分的解析在含有10％(v/v)FBS(牛胎血清)、5％(w/v)酵母提取物(フロ·ラボラトリ-ズ制)、100单元/ml青霉素、1％(w/v)右旋糖、0.002％(w/v)酚红的PPLObroth(ディフコ·ラボラトリ-ズ制)的液体培养基中培养各种支原体(发酵支原体GGPL株、隐性发酵支原体(incognitus)(ATCC53949)、发酵支原体PG18株、发酵支原体F17株、发酵支原体F1株、发酵支原体F7株、关节炎支原体(M.arthritidis)、人型支原体(M.hominis)(ATCC15488))。从该培养液中，用已知方法(Bligh和Dyer，加拿大生理生化杂志，37，911-917(1959)提取脂质，将该脂质提取物涂敷在HPTLC板(默克公司制)上，用氯仿∶甲醇∶0.2％(w/v)氯化钙水溶液＝50∶45∶10(v/v/v)的混合溶剂展开。将该板浸渍在己烷中溶解有0.4％聚异丁基甲基丙烯酸盐溶液中，浸渍时间30秒。将该板，按照常法，用地特马试剂染色。其结果如图14所示。通过该结果，只是对各种发酵支原体上看到相当于GGPL-I及GGPL-III的带，在其他的支原体菌种上未看到。由此结论，GGPL-I及GGPL-III对于发酵支原体是特征的甘油糖磷脂。实施例2制备抗支原体糖脂多克隆抗体在上述得到的发酵支原体的脂质提取物50mg中，加入单磷酸盐类脂A(リビ·ィムノケム·リサ-チ公司)50μg和完全佐剂(ナカラィチスク(株))50μg，再加入矿物油250μl，以400rpm研磨2分钟。尔后加入250μl的含0.1％(v/v)Tween80的PBS，再以400rpm研磨2分钟，得到含有脂质提取物的乳化液0.5ml。将用上述方法制备的乳化液注射7周龄的雌性BALB/c白鼠的皮下，每一只注射0.5ml。初次免疫后的第2周和第3周时，将用上述方法调制的含有脂质提取物的乳化液，每只以0.5ml注射在腹腔内。用常法，从上述免疫的白鼠血液中分离血清。用该血清，进行如下的免疫染色。从GGPL阳性的MT-4细胞，用已知方法(Bligh和Dyer，加拿大生理生化杂志，37，911-917(1959))提取脂质组分，在高速薄层色谱(HPTLC)板(默克公司制)上涂敷脂质级分提取物，用氯仿∶甲醇∶0.2％(w/v)氯化钙水溶液＝50∶45∶10(v/v/v)的混合溶剂展开。将该板浸在溶解有0.4％聚异丁基甲基丙烯酸盐的己烷溶液30秒钟后，进行风干。作为1次抗体，将上述血清或未免疫的白鼠血清添加在HPTLC板上，在4℃下培养1夜。用PBS洗净HPTLC板后，作为2次抗体，将过氧化酶标记兔子IgG抗体(カペル公司制)添加在HPTLC板上，在室温下，培养4小时。用纯水洗净HPTLC板后，使用抗过氧化酶发色试剂盒(KONICA免疫染色HRPKit柯尼卡公司制)检测抗原带。其结果如图15所示。从该结果，可确认上述血清含有对于GGPL-I及GGPL-III的多克隆抗体。实施例3制备抗GGPL-III单克隆抗体(1)杂交细胞瘤的制备与实施例2相同地，将含有发酵支原体的脂质提取物，在7周龄的雌性BALB/c白鼠的皮下，每只注射0.5ml。在初次免疫后的第2周和第3周，将用上述方法制备的脂质提取物的乳化液，以每只0.5ml注射到腹腔内。在最终免疫4天后，摘出白鼠的脾脏，用RPMI1640培养基制备细胞悬浮液。将该2×108个脾细胞和对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞〔氮鸟嘌呤耐性、IgG非分泌；ATCCCRL-1581〕(2×107个)混合，离心沉淀后，在沉淀中，一边缓慢振荡1分钟一边加入45％聚乙二醇(PEG4000(和光纯药(株)制)1ml，然后，在37℃下，一边缓慢振荡一边培养2分钟。在其中，1分钟内加入RPMI1640培养基1ml后，缓慢振荡，而后同样1分钟内再加入1ml，缓慢振荡后，进而在3分钟内再加入8ml。将上述细胞混合液离心沉淀后，将细胞悬浮在含有10％牛胎血清(FCS)的RPMI1640培养基50ml中，在4个96孔微型板上，每个孔各注入100μl，在二氧化碳培养器(5％二氧化碳，37℃)中培养。24小时后，将培养基换成HAT培养基(含有次黄质、氨基喋呤、胸苷、10％(v/v)FCS培养基)，继续在二氧化碳培养器(5％碳酸气，37℃)中培养。在HAT培养基中培养开始后的第4天，每1个孔追加100μl新的HAT培养基。在HAT培养基培养开始后的第7天，换成HT培养基(从HAT培养基除去氨基喋呤的)，在其第2天，换成含有10％(v/v)FCS的RPMI1640培养基后，确认有无菌落形成。(2)产生抗体杂交细胞瘤的选择在96孔微型板的每1个孔中加入50μl的将发酵支原体的脂质组分20μg溶解在10ml乙醇的溶液后，用干燥器干燥30分钟。在每1孔中加入100μl的含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS，在室温下静置1小时。用100μl的0.3M蔗糖溶液洗涤每1个孔5次后，在各孔中各加100μl的上述培养上清液，在室温下振荡60分钟。用0.05％Tween20溶液洗涤各孔后，在每个孔中，加入50μl的用PBS稀释500倍的过氧化物标记的抗白鼠IgG抗体(カペル公司制)，在室温下振荡60分钟。用0.05％Tween20溶液洗涤各孔后，在每1个孔中加入100ul的含有10mg邻苯二胺及50μl的30％(v/v)过氧化氢水的10ml柠檬酸缓冲液，在室温下培养15分钟。在每1个孔中加入100μl的0.5M硫酸，使过氧化物酶的酶反应停止后，用微板读出器测定490nm的吸光度。对于产生抗体的杂交细胞瘤，通过有限稀释法，反复进行筛选，通过将发酵支原体的脂质组分用于抗原的ELISA进行第一次筛选，对于ELISA阳性的菌落，进一步通过发酵支原体的脂质组分的HPTLC的免疫染色进行二次筛选，得到可产生对于GGPL-III具有反应特异性的单克隆抗体的杂交细胞瘤株MF-III-1株。该株在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所中以FERMP-14324的保藏号保藏，于1995年5月26日按照布达佩斯条约，移至国际保藏，保藏编号是FERMBP-5115。(3)单克隆抗体的制备接着，在含有10％(v/v)FCS的RPMI1640培养基中培养MF-III-1株，通过回收其培养上清液，得到对于GGPL-III的单克隆抗体。实施例4对单克隆抗体的免疫染色法评价使用得到的抗GGPL-III单克隆抗体，进行如下的免疫染色。用已知方法(Bligh和Dyer，加拿大生理生化杂志，37，911-917(1959)提取各种支原体(发酵支原体GGPL株、隐性发酵支原体(incognitus)(ATCC53949)、发酵支原体PG18株、发酵支原体F17株、发酵支原体F1株、发酵支原体、F7株、关节炎支原体(M.arthritidis)、人型支原体(M.hominis)(ATCC15488))的脂质组分，在高速薄层色谱(HPTLC)板上(默克公司制)涂敷脂质组分提取物，用氯仿∶甲醇∶0.2％(w/v)氯化钙水溶液＝50∶45∶10(v/v/v)的混合溶剂展开。将上述板，浸在溶解有0.4％(w/v)聚异丁基甲基丙烯酸盐的己烷液体中30秒钟后，进行风干。作为1次抗体，将上述抗GGPL-III单克隆抗体添加在HPTLC板上，在4℃下培养一夜。用PBS洗涤HPTLC板后，作为2次抗体，将过氧化物酶标记抗白鼠IgG抗体(カペル公司制)添加在HPTLC板上，在室温下培养4小时。用纯水洗涤HPTLC板后，用过氧化酶发色试剂盒(KONICA免疫染色HRPKit柯尼卡公司制)检测抗原带。其结果如图16所示。该结果表明，本发明的单克隆抗体，特异地与发酵支原体的甘油糖磷脂结合，而不与关节炎支原体及人型支原体的磷脂及糖脂结合。进而，在HPTLC上，用地特马试剂及地衣酚试剂染色带中，在免疫染色中没有看到GM2、GM1a、GDIa、磷脂酰胆碱及神经磷脂的带及GGPL-I的带，本发明的单克隆抗体，只与GGPL-III特异地结合。接着，作为1次抗体使用抗GGPL-III单克隆抗体、作为2次抗体使用用异硫氰酸荧光素(FITC)标记白鼠IgG抗体，将发酵支原体感染的MT-4细胞进行免疫染色，用荧光显微镜观察的结果如图17所示。该结果表明，使用本发明的单克隆抗体可检测出发酵支原体。实施例5肾炎患者的血液中的GGPL-III或类似于GGPL-III抗原性的物质的检测从肾炎患者的血液及正常人的血液，按照已知方法(Bligh和Dyer，加拿大生理生化杂志，37，911-917(1959))，对于用常法制备的血清100μl，分别使用100μl的氯仿∶甲醇(2∶1、1∶1及1∶2(v/v))的混合溶剂提取血清中的总脂质。萃取溶剂分成3层，回收其中的最下层，将其对于水进行透析、冻结、干燥，将这样得到的试样涂敷在高速薄层色谱(HPTLC)板(默克公司制)上，用氯仿∶甲醇∶0.2％(w/v)氯化钙水溶液的混合溶剂(50∶45∶10(v/v/v))展开。另外，作为标准物质，使用精制的GGPL-III，同样涂敷在HPTLC板上，展开。将上述板浸在溶解有0.4％(w/v)聚异丁基甲基丙烯酸盐的己烷溶液30秒钟后，风干。作为1次抗体，将上述抗GGPL-III单克隆抗体添加在HPTLC板上，在4℃下培养一夜。用PBS洗涤HPTLC板后，作为2次抗体，将过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(カペル公司制)添加在HPTLC板上，在室温下培养4小时。用纯水洗涤HPTLC板后，用过氧化物酶发色盒(KONICA免疫染色HRPKit柯尼卡公司制)检测该抗原带。用上述方法，对肾炎患者的血清9个检样及正常人的血清9个检样进行了检测，肾炎患者9个检样中有6个检样，在GGPL-III附近确认有信号(图18)。对于正常人的检样未检测出该信号(图18)。肾炎患者样品中明显看到的该信号，从HPTLC上的位置看，与GGPL-III不同，这可被认为是抗原性类似的脂质。另外，这样提取脂质后，也可将各冷冻干燥试样溶解在氯仿∶甲醇∶水(83∶16∶0.5(v/v/v)的混合溶剂中，加在装有ィァトロビ-ズ6RS-8060(ィァトロン公司制)的ィァトロビ-ズ柱(以氯仿∶甲醇∶水的组成，将阶段地洗脱出的物质加在HPTLC上。实施例6用精制GGPL-III作为抗原的ELISA法，检测血液中的抗GGPL-III抗体将用实施例1精制的GGPL-III40μg溶解在10ml的乙醇中的溶液，加入到96孔微孔板中，每1个孔加入50μl，然后用干燥器干燥30分钟。再加入100μl的含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS到每个孔中，在室温下静置1小时。每个孔，用100μl的0.3M蔗糖溶液洗涤5次后，将从正常人、爱滋病患者、肾炎(nephritis)患者、HTLV-I有关的骨髓病(HAM；HTLV-1associatedmyelopathy)患者的血液用常法制备的血清各100μl加入到各个孔中，在室温下振荡60分钟。用0.05％Tween20溶液。洗涤各孔后，将50μl的用PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记抗人体IgG抗体(カペル公司制)加到各个孔中，在室温下振荡60分钟。用0.05％Tween20溶液洗涤各孔后，在每个孔加入100μl的含有10mg邻苯二胺及50μl的30％(v/v)过氧化氢水溶液的10ml的柠檬酸缓冲液，在室温下培养15分钟。在每个孔中，加入100μl的0.5M硫酸，使过氧化物酶的酶反应停止后，用微板阅读器测定450nm的吸光度。对于正常人血清46个检样、爱滋病(AIDS)患者血清10个检样、肾炎(nephritis)患者血清22个检样、HTLV-I骨髓病(HAM；HTLV-1associatedmyelopathy)患者血清9个检样，用上述方法测定450nm的吸光度，以正常人作为对照，将比正常人450nm吸光度大的血清检样，作为抗GGPL-III抗体阳性。其结果如表2所示。表2如表2所示，正常人的46个检样中的1个检样(2.2％)、爱滋病患者的10个检样中的8个检样(80.0％)、肾炎患者22个检样中的3检样(13.8％)、HTLV-I骨髓病患者的9个检样中的2个检样(22.2％)是各血清中的抗GGPL-III抗体阳性的。另外，代替上述的2次抗体(过氧化物酶标记抗人的IgG抗体)，而使用抗过氧化物酶标记人的IgM抗体(カペル公司制)进行同样制备时，肾炎患者血清中的抗GGPL-III抗体阳性率进一步增加。产业上的利用性由本发明可得到来自发酵支原体的新型甘油糖磷脂，GGPL-III。另外，可得到对于来自发酵支原体的甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体，特别是对于GGPL-I及GGPL-III具有反应特异性的多克隆抗体、及只对于GGPL-III具有反应特异性的单克隆抗体。通过使用本发明的抗体，可期待能特异地检测发酵支原体，预测爱滋病的逆转录病毒感染症的发病、及风湿病的诊断、肾炎的诊断等的应用。进而，可应用于治疗或预防发酵支原体复合感染可能性高的病毒感染症。权利要求1.从发酵支原体提取出来的具有以下性质的甘油糖磷脂(A)能与地衣酚试剂、地特马试剂、德雷根道乐夫试剂及茚三酮反应；(B)可被碱分解；(C)在用二乙胺基乙基阴离子交换柱分离时，是以非吸附级分形式得到的；(D)用质谱仪测定的分子量是1048+28n(n是-1、0、1或2)。2.根据权利要求1所述的甘油糖磷脂，它是以α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油、磷酸胆碱及氨基丙二醇的磷酸酯作为构成成分的。3.对甘油糖磷脂具有反应特异性的抗甘油糖磷脂抗体，这种甘油糖磷脂至少含有磷酸胆碱、葡萄糖、脂肪酸及甘油，对二乙胺基乙基离子交换柱是非吸附性脂质，对碱不稳定。4.根据权利要求3所述的抗甘油糖磷脂抗体，其中所述甘油糖磷脂是特异地存在于发酵支原体中的甘油糖磷脂。5.根据权利要求3或4所述的抗甘油糖磷脂抗体，它与6′-O-磷酸胆碱-α-吡喃葡糖基-(1′-3)-1，2-二酰基-sn-甘油和权利要求1所述的甘油糖磷脂两者反应。6.根据权利要求3-5的任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体，它是多克隆抗体。7.根据权利要求3或4所述的抗甘油糖磷脂抗体，它只是对权利要求1所述的甘油糖磷脂具有反应特异性。8.根据权利要求3、4、5或7的任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体，它是单克隆抗体或其片段。9.根据权利要求3所述的抗甘油糖磷脂抗体，它特异地识别发酵支原体，对其它支原体不识别。10.根据权利要求9所述的抗甘油糖磷脂抗体，其中所述的其它支原体是关节炎支原体及人型支原体。11.根据权利要求4所述的抗甘油糖磷脂抗体，它对于含唾液酸糖脂(神经节苷脂)、血小板活性化因子(1-烷基-2-乙酰甘油基-3-磷酸胆碱)或其部分脱酰化物、磷脂酰胆碱或其脱酰化物、或者神经磷脂不显示交叉反应。12.甘油糖磷脂的测定方法，其特征是使用权利要求3-11的任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体免疫性地测定检样中具有以下性质的甘油糖磷脂它是至少含有磷酸胆碱、葡萄糖、脂肪酸及甘油，对于二乙胺基乙基阴离子交换柱是非吸附性脂质，对碱不稳定的甘油糖磷脂。13.甘油糖磷脂抗原性类似物质的测定方法，其特征是使用权利要求3-11的任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体免疫性地测定含在检样中的权利要求1所述的甘油糖磷脂的抗原性类似物质。14.甘油糖磷脂的测定方法，其特征是使用权利要求3-11的任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体免疫性地测定检样中的特异地存在于发酵支原体中的甘油糖磷脂。15.检样中甘油糖磷脂的测定方法，其特征是使检样液与权利要求3-11中任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体所结合的固相接触，使含在检样液中的甘油糖磷脂与上述抗体结合，从固相分离除去非吸附成分，接着将用标记物质标记的发酵支原体的甘油糖磷脂与上述固相接触，使含在上述检样液中的甘油糖磷脂和标记的甘油糖磷脂竞争反应，检测出结合在固相上的标记物质或未结合在固相上的标记物质中的任何一个。16.检样中抗甘油糖磷脂抗体的测定方法，其特征是使检样液与结合了权利要求1所述的抗甘油糖磷脂的固相接触，使含在检样液中的抗甘油糖磷脂抗体与上述甘油糖磷脂结合，从固相分离除去非吸附成分，接着再与用标记物质标记的抗人体免疫球蛋白抗体的二次抗体进行反应，检测出标记物质。17.发酵支原体的检测方法，其特征是使用权利要求14或15所述的测定法测定检样中的甘油糖磷脂，使得此甘油糖磷脂的存在与否或其存在量与检样中的发酵支原体的存在与否或其存在量联系起来。18.根据权利要求17所述的发酵支原体的检测法，其中上述检样中的甘油糖磷脂是从生物检样中提取的脂质组分。19.根据权利要求18所述的发酵支原体的检测法，其中生物检样是血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿、关节液或细胞培养液。20.检样中发酵支原体的检测方法，其特征是从检样提取脂质组分，使该脂质提取物与固相接触后，吸附脂质，吸附了脂质的固相与权利要求3-11任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体反应，同时或其后，与用标记物质标记的针对上述免疫动物球蛋白抗体的二次抗体反应，测定标记物质，其中上述免疫动物球蛋白抗体是使用制备上述抗体以外的动物制备的。21.发酵支原体的检测方法，其特征是将生物组织或细胞，直接或在实施甘油糖磷脂的固定处理后，与标记物质标记的权利要求3～11任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体反应，在发酵支原体感染的生物组织或细胞上结合标记化抗体，测定标记物质。22.发酵支原体的检测方法，其特征是将生物组织或细胞，直接或在实施甘油糖磷脂的固定处理后，与权利要求3-11任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体反应，同时或其后，再与用标记物质标记的针对上述免疫动物球蛋白抗体的二次抗体反应，而后在发酵支原体感染的生物组织或细胞上结合标记化二次抗体，测定标记物质，其中上述免疫动物球蛋白抗体是使用制备上述抗体以外的动物制备的。23.通过免疫学方法检测检样中的发酵支原体或发酵支原体的甘油糖磷脂的试剂盒，其特征是含有权利要求3-11任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体和用标记物质标记的发酵支原体的甘油糖磷脂。24.通过免疫学方法检测检样中的发酵支原体或发酵支原体的甘油糖磷脂的试剂盒，其特征是含有权利要求3～11任何一项所述的抗甘油糖磷脂抗体和使用制备上述抗体的免疫动物以外的动物制备的，针对上述免疫动物的免疫球蛋白的抗体用标记物质标记的二次抗体。25.对选自爱滋病、肾炎及与HTL-I相关的骨髓病的疾病的检测方法，其特征是检测含在血液中的权利要求1所述的甘油糖磷脂或这些甘油糖磷脂的抗原性类似的物质，或者对这些甘油糖磷脂具有反应特异性的抗体。全文摘要以发酵支原体的脂质组分作为抗原来免疫白鼠，将脾细胞和白鼠骨髓瘤细胞融合后，制作出杂交细胞瘤。选择产生对GGPL-III具反应特异性的单克隆抗体的杂交细胞瘤。使用得到的抗体来检测发酵支原体。上述GGPL-III是发酵支原体中所特异的磷酸胆碱的甘油糖脂质。文档编号C07K16/12GK1154700SQ95194470公开日1997年7月16日申请日期1995年6月2日优先权日1995年6月2日发明者松田和洋,山本直树申请人:生化学工业株式会社