专利名称：具有抗巨细胞病毒活性的寡核苷酸的制作方法
背景技术：
本发明涉及巨细胞病毒的侵染，更具体地说本发明涉及利用反义寡核苷酸预防及治疗巨细胞病毒的感染。
巨细胞病毒属于疱疹病毒家族，该病毒家族可感染多种动物包括人类。人类CMV(HCMV)感染人口总数的50-80％，其感染程度从具有免疫能力的成人的轻度的或无病症的感染，到引起新生儿及免疫损伤个体(例如移植受体或艾滋病患者)的严重发病，对于新生儿这种感染将引起严重的神经系统缺陷，对于成人常见的病症可能是，严重的单核细胞增多症、肺炎、肝炎、胃肠炎和脉络膜视风膜炎。此病毒通过频繁或长期性亲密接触而传播，通常是通过母乳喂养或性交。(Schooley in Harrison’s Principles ofInternal Medicine (13th Ed.)(Isselbacher等人编辑)Mc Graw-Hill，Inc.，纽约，1994，第794-796页)。
CMV具有典型疱疹病毒结构由二十面体衣壳包裹的双链DNA基因组，外周由脂蛋白外膜包被。此病毒在细胞核内复制并引起裂解及倾向性或潜在性感染。个体一旦被感染，将以潜伏期形式终生携带此病毒，除非感染者受T细胞调节的免疫力损伤。CMV具致癌能力，使人类细胞及非人类细胞发生变态，刺激细胞增生。
阻止CMV感染的预防措施有组织移植，血清反应阴性供体者血液的移注，或移注经过冻融去甘油化(减少移植相关传染)处理的血液。现已证明α干扰素可以防止再活化CMV综合症复发，并可延缓高危肾移植受体的CMV的分泌(Schooley in Harrison，s Principles of Internal Medicine(Bth Ed.)(Isselbacher等人编辑)Mcgow-Hill，Inc纽约，1994，794-796页)。预防性非环化鸟苷是一种核苷类似物，其已被证明可以减少血清反应阴性的肾脏移植受体受CMV感染。
其它防治措施包括抗人类巨细胞病毒疫苗的研制。但疫苗不能完全防治HCMV感染或复发(EP 0277773；Elek等(1974)Lancet 11-5；Neff等(1979(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.16032-37)。US 5,273,876公开了一种由减毒的HCMV组成的疫苗，此减毒病毒具有一段HCMV复制所必需的DNA序列，及至少一个可表达抗原性多肽的外源DNA序列。
CMV治疗前景还不够乐观，现已知的抗病毒药物如核苷类似物无环鸟苷(非环式鸟苷)和ara-A(腺嘌呤阿拉伯糖苷)对HCMV活性感染无显著疗效。现在已发现环丙鸟苷(9-(1，2-二羟基-2-丙氧甲基鸟嘌呤)在细胞内转变为其三磷酸形式后可以作为CMV聚合酶的抑制物。携带CMV的艾滋病患者连续使用此药物可以控制CMV侵染，但接受三个月以上治疗的患者通常会引起外围血嗜中性白细胞减少症，并且产生对此药物有抗性的毒株。
Foscarnet(磷酸基甲酸钠)被用来治疗HCMV感染(参见Azad et al.(1993)Antimicrob.Agents Chemother.371945-1954)。但对于免疫损伤患者(如AIDS)这种病症仍会复发，另外服用此药物要求使用输入泵及封闭式临床监测，而且长期服用该药物所带来的的毒性及长期治疗出现的抗病毒株限制了它的效用(参见，例如Azad等人，文献同上)。因此，由于目前所知药物的毒性、抗性所造成的局限性说明需要新的策略治疗CMV。
最近，已经研制了新的化学治疗药物，这些药物能够调节细胞内基因及外源基因的表达。根据Waston-Crick或Hoogsteen的碱基配对原则，这些称之为反义寡核苷酸的药物可以结合到单链靶核酸分子上，一般通过这样几种机制破坏靶基因的功能阻止在正常转录、剪接、翻译过程中所需因子的结合；激发RNaseH对mRNA的酶活性破坏；或反应基因直接结合反义寡核苷酸来破坏靶。
反义寡核苷酸已被用来抑制多种不同病毒的表达包括HIV-1，流感病毒及其它病毒，(参见Agrawal等，U.S.专利5,194,428；Pederson等，U.S.专利5,149,797；Agrawal(1992)，Trends Biotechnol.10152-158；Agrawal等，基因调节反义RNA和DNA的生物学，Erickson and Izant编辑)Raven Rress Ltd，纽约(1992)273-283页)；Agrawal(1991)反义核酸治疗癌症和AIDS的前景，(Wickstrom编辑)Liss，纽约，145-148页)。
反义寡聚脱氧核苷酸也被用来治疗各种疱疹病毒的感染，例如，已报道的能与EBV病毒的EBNA-1基因互补的寡核苷酸可以抑制EBV的感染(U.S.专利5,242,906)。U.S.专利5,248,670公开了与I型单纯疱疹病毒基因UL13，UL39，UL40互补的寡核苷酸可用来抑制病毒在培养的Hela细胞中的复制。
另外，反义脱氧寡核苷酸已被设计用来专门治疗CMV感染。例如，与HCMV主要立即早期区(IE2)RNA互补的焦磷酸硫代寡核苷酸可以减少在培养的人类表皮成纤维细胞中侵染性病毒的生产(Azad et al.(1993)Antimicrob.Agents Chemother.37(1945-1954)，而IE2区编码可调节病毒基因表达的蛋白。(该核苷酸序列同等对应物(即系统命名)来自Chee等人已发表的DNA序列数据。(Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1990)154125-169)。
PCT/US91/05815公开了与部分CMV的mRNA互补的寡核苷酸，这些mRNA编码IE1、IE2或DNA聚合酶(UL54)蛋白质，还包括至少部分mRNA帽区，AUG区，保守氨基酸区，位于DNA聚合酶基因特异碱基间的CMV插入区，IE1或IE2基因的内含子/外显子连接区或IE2基因的核定位信号区。
当然，仍旧迫切需要治疗和预防HCMV感染的新方法，特别是需要低量长期使用具疗效并且不或很少产生细胞毒性的药物组合物及使用这些组合物的治疗方法。
另外，现在迫切需要其关键基因已突变的CMV菌株来研究该病毒的遗传特性。但不幸的是仍未得到这类突变株因而阻碍了对于此重要病毒的遗传性的研究。发明概述现在已发现某些HCMV基因至今未被公认为病毒DNA复制的必要基因，但对这些基因表达的抑制确实可抑制病毒DNA表达。此出其不意的发现已被应用于开发和研制本发明的合成寡核苷酸以抑制HCMV的DNA复制。在正常生理条件下，这些寡核苷酸可以与巨细胞病毒基因组特异部分杂交或与转录子部分杂交，由此抑制其表达。
正如本文中使用的，术语“合成寡核苷酸”包括人工合成的具有5-50、优选15-约30个核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸单体的多聚物，单体之间被至少一个5’-3’核苷酸间键合连接，(人工合成即不是在细胞内由DNA聚合酶或RNA聚合酶合成)。
本发明的优选实施方案中，本发明的合成寡核苷酸可以与至少部分的来自巨细胞病毒基因UL36，UL84，UL101x-102或UL112-113的RNA或DNA特异地杂交。至今这些特定基因并未被认定为病毒DNA复制所必需的基因。
本发明的特定实施方案中，寡核苷酸可以与以下基因的至少一部分特异地结合UL36或UL112-113的外显子/内含子交接片段，推测的翻译起始区或UL101X的5’末端未转译区，或者UL84 RNA的推测翻译起始区或编码这些翻译起始区的DNA序列。
本文中“UL101x”指UL102开放读框上游的一个小开放读框(ORF)。UL101x和UL102包含很可能编码解旋酶-引物酶复合物中与引物酶有关的因子的一段区域(“UL101x-102”区域)。
本发明的某些优选实施方案中，靶击UL36的内含子-外显子区域的寡核苷酸(UL36I/X1，UL36I/X1A，UL36I/X1C)具有列于序列表中SEQ ID NOS1-3的核苷酸系列。在另一优选实施方案中，靶击UL84 5’未翻译区的寡核苷酸(UL84a和UL85b)具有列于序列表SED ID NOS4和5的序列。在再一个优选的实施方案中，靶击推测的翻译起始区的寡核苷酸(UL101Xa)具有列于SEQ ID NO6的序列。在又一个优选的实施方案中，靶序列为UL112-113区的内含子/外显子交接区域的聚核苷酸序列具有SEQ ID NOS7-9的序列。
在本发明的某些优选实例中，寡核苷酸被修饰，在本文中术语“修饰的寡核苷酸”是指有至少两个核苷酸被合成的键合共价连接的寡核苷酸，所谓合成的键合是指在一个核苷酸5’端与另一个核苷酸3’端之间的键是除磷酸二酯键之外的键，并且其中的5’端的磷酸核苷酸可以被许多化学基团取代，优选的合成键合包括烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基硫代膦酸酯，磷酰胺，亚磷酰胺，磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺，2-0-甲基，及羧甲基酯。本发明的一种优选实例中，寡核苷酸包含至少一个位于寡核苷酸结构中任意位置的磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，或亚磷酰胺键合或这些键合的组合。
“修饰的寡核苷酸”也指带有一个修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸，例如3’，5’-取代的寡核苷酸是一种被修饰的寡核苷酸，含有一个3’，5’均与化学基因结合的糖，其3’结合的不是羟基而5’结合的不是磷酸基。修饰的寡核苷酸还可以是加帽的。另外，分子中每个核苷的非桥式氧具有一个取代基的非氧化或部分氧化的寡核苷酸也被称为修饰的寡核苷酸。3’和/或5’端有赋予核酸酶抗性的大取代基的寡核苷酸也称为修饰的寡核苷酸，和/或其他一些不经人工介入而未在体内发现的各种结构修饰在此也称为修饰的寡核苷酸。
在正常生理条件下本发明的寡核苷酸可以在含有CMV的DNA或RNA的细胞内与CMV的DNA或RNA杂交。所述条件包括pH、温度和离子状态。
在某些方面，本发明提供了一些通过与病毒DNA、RNA部分杂交而对CMV具有抗病毒活性的寡核苷酸，以及提供了包括至少一种本发明的寡核苷酸，在一些实例中至少两种不同的本发明的寡核苷酸，和一种药学上可接受的载体的药物组合物。
该药物组合物被用于抑制，防止和/或减少HCMV在细胞内复制的方法中，在此方法中将治疗量的药物组合物给予待保护免受感染的细胞或待治疗其感染的细胞。该药物组合物中的寡核苷酸进入细胞后，在细胞中与CMV的DNA或RNA杂交，因此抑制了CMV复制。该方法的预防性可被用在可能受到CMV感染威胁的健康个体上。它同样可以用来防止在使用CMV的实验室中，因疏忽而使CMV污染细胞株。该药物组合物可以用于治疗HCMV的感染的方法中，其中对受感染的哺乳动物或细胞使用该组合物。
本发明还提供了一种制备突变的DNA复制缺陷的巨细胞病毒的外遗传(epigenetic)等同物的方法，在此方法中，与CMV的UL36，UL84，UL101x-102基因互补的寡核苷酸被施用给被CMV感染的细胞。当CMV感染发展到已与寡核苷酸杂交的基因或转录本编码的蛋白或功能是DNA复制所必需时，产生了突变CMV。这种方法使得在缺少突变细胞株时也可对CMV进行遗传学研究，而后者这种突变细胞株目前为止不能大量获得。附图简述通过以下描述及参照相应附图，可进一步理解关于本发明的前述及其它目的，及由此而带来的各种特征，及本发明本身。
图1是HCMV基因组的UL36-38区示意图，显示来自此区的转录物。
图2是HCMV基因组UL84区的示意图。
图3是HCMV基因组UL101x-UL102(引物酶相关因子)的示意图。
图4是HCMV基因组UL112-113区的示意图，显示本发明寡核苷酸的靶区域。
图5示出ELISA(酶联免疫吸附实验)结果，此实验中细胞经过如下处理，用与IE，UL36 I/X1，UL36c(UL36 I/X1C)UL36a(UL36 I/X1A)，NS(非特异寡核苷酸)互补的寡核苷酸预温育细胞，再用HCMV(MOI＝0.4)侵染，温育6天，然后对病毒UL44蛋白进行免疫染色。
图6示出ELISA(酶联免疫吸附实验)结果，此实验中细胞经过如下处理用与E/E1/2，IE，UL36 I/X1，UL37 I/X3，UL37 I/X1，UL37 I/X2和HCV1互补的寡核苷酸预培养细胞，再用HCMV(MOI＝0.05)侵染，温育5天，然后对病毒UL44蛋白进行免疫染色。
图7示出ELISA结果，其中细胞经过如下处理分别用与IE，UL36 I/X1，UL84a，UL101a或HCV1互补的寡核苷酸，或用pfa(膦基甲酸)预培养细胞，以HCMV(MOI＝0.05)侵染，温育6天，然后对病毒UL44蛋白免疫染色。
图8示出ELISA结果，其中细胞经过如下处理分别用与IE，UL101a，UL84a，UL70a，UL70b或HCV1互补的寡核苷酸，或用膦基甲酸pfa预培养细胞，以HCMV(MOI＝0.05)侵染，温育5天，然后对病毒UL44蛋白免疫染色。
图9示出ELISA结果，其中细胞经过如下处理分别用与IE，UL36 I/X1，UL36A(UL36 I/X1A)，UL36B(UL36 I/X1B，是一种不同于UL36 I/X1，I/X1A和I/X1C相对应的外显子/内含子交界)或NS互补的寡核苷酸，或用pfa预培养细胞，再以HCMV(MOI＝O.1)侵染，温育5天，再对病毒UL44蛋白免疫染色。
图10示出ELISA结果，其中细胞经过如下处理分别用与IE，UL101a，UL102a，UL102b，irsla或HCV1互补的寡核苷酸或用pfa预处理细胞，以HCMV浸染(MOI＝0.05)，温育6天，显色反应显示病毒UL44蛋白。
图11示出ELISA结果，其中细胞经过如下处理分别用与irs1b，UL84a，UL84b，UL44a，UL44b，oirla和orilb互补的寡核苷酸预培养细胞，以HCMV(MOI＝0.05)侵染，温育5天，然后反应显色显示UL44病毒蛋白质。
图12为光密度计扫描Southern印迹分析的结果，示出在病毒感染(MOI＝0.1)前用不同浓度的所述的寡核苷酸处理的细胞中的HCMV复制量(以oriLyt为探针)。
图13为光密度计扫描Southern印迹分析的结果，示出在病毒感染(MOI＝0.4)前以不同浓度的所述的寡核苷酸处理的细胞中的HCMV复制量。
图14为光密度计扫描Northern印迹分析的结果，示出在HCMV病毒感染(MOI＝0.1)前，以不同浓度的所述的寡核苷酸处理的细胞中的病毒RNA表达量，所用探针可与UL36转录子杂交。优选实施方案的详细描述HCMV基因组由双链线状DNA组成，长度约为240000个核苷酸可编码约200个基因。CMV基因在允许细胞内或在可被该病毒感染的细胞内的表达受级联放大调控，可分为三步立即早期(IE)、早期(E)、晚期(L)。病毒在完成吸附、穿膜、脱壳后，线状HCMV基因组环化然后通过产生环状产物这种机制在核内复制，其产生的连环体产物随后被裂解，并在病毒组装时被包装，在病毒吸附细胞、穿膜、脱壳的1-4小时内，IE的mRNA被合成。这些转录物的蛋白质产物参与早期转录的起始。与IE蛋白质类似，在病毒DNA合成之前，E蛋白由转录的mRNA编码。在被感染的细胞中，某些E蛋白在核酸代谢和DNA合成过程中起作用，DNA合成开始后，L mRNA的转录量达到最大，这些mRNA编码病毒衣壳组分、被膜蛋白和其它一些在病毒装备、结构完整性及成熟后释放过程中所需的蛋白质。
HCMV含有裂解期复制的起始点，称为oriLyt。已知在人工条件下，体外无病毒的共转染复制实验中，该起始点是指导DNA复制的反式元件。已证明的oriLyt-依赖型病毒的DNA复制过程必需的基因有UL54(DNA聚合酶)，UL44(聚合酶附加蛋白)，UL57(单链DNA结合蛋白)，UL105，UL70，UL101x-UL102(解旋酶-引物酶复合物的推定亚基)，UL36-38(调节蛋白，通用转录激活因子)，irsl(或称TRS1)(调节蛋白，基因表达激活因子)，IE1/IE2(调节蛋白)，及UL84(早期暂时型核相关蛋白，功能未知)和UL112-113(早期暂时型核相关蛋白，功能未知)。上述基因在以前关于HCMV DNA复制或基因表达调控中并未提及(Pari，et al.(1993)J.Virol.672575-2582；Pari et al.(1993)J.Virol.676979-6988)。
现在已发现利用针对HCMV基因组某些特殊区域的寡核苷酸治疗细胞的结果是抑制了HCMV DNA复制。特别是与UL36，UL84，UL101x-102及UL112-113基因的DNA或转录子互补的寡核苷酸可以阻止HCMV在被感染细胞中的DNA复制。这些受靶击的基因编码早期暂时型核相关蛋白，其中一些功能未知(UL84，UL112-113)。在共转染-复制实验的人工体系中，上述所有基因是那些已知为暂时互补于OriLyt-依赖型DNA复制所必须的那些基因，意想不到地发现UL36，UL84，UL101x-102基因对于HCMV DHA复制也是必须的。因此本发明包括以这些基因为靶序列的寡核苷酸。在某些特殊例子中，寡核苷酸靶击UL36的内含子-外显子交接区域，此区编码的蛋白在整个感染周期中存在，是一种立即早期蛋白。UL36-38的基因组图谱及本发明寡核苷酸靶击的转录子列于图1。这种类型(UL36 I/X1，UL36 I/X1A和UL 36 I/X1C)代表性寡核苷酸序列列于下表1及序列表SEQ ID NO1，SEQ ID NO2及SEQ IDNO3。
特异于HCMV基因组的其他区域的本发明的寡核苷酸包括与UL84，UL101x DNA或包括推测的转译起始点的转录子互补的寡核苷酸。UL84中该区可参见图2，与UL84互补的代表性寡核苷酸(UL84a和UL84b)的序列列于表1及序列表SEQ ID NOS4和5。图3示出UL101x-102基因座的推测的转译起始点区域。与UL101x转录物互补的代表性寡核苷酸(UL101xa)的序列列于表1及序列表SEQ ID NO6。上述寡核苷酸的效率是令人惊奇的，因为以前方法认为UL102的ORF(开放阅读框)对于复制是必须的，并且其编码的多肽是由UL102 ATG翻译而来的。在此已证实与101x ATG上游互补的寡核苷酸是有效的。而与推定的UL102 ATG互补的寡核苷酸是无效的。
靶击HCMV基因组的另一部分的本发明的寡核苷酸包括UL112-113复合物的剪接区，特别是，该区的内含子-外显子交界区(其示意图见图4)也是寡核苷酸的靶区，与该区互补的代表性寡核苷酸(UL112-113 I/X1，UL112-113 I/X2，UL112-113 I/X3)的序列列于下表1和序列表中的SEQ ID NOS7-9。
表1靶基因 寡核苷酸序列 SEQ ID NO5’-----3’UL36 I/X1 TGGGGCTTACCTTGCGAACA1UL36 I/X1AGACGTGGGGCTTACCTTGCG2UL36 I/X1CTCTTCAACGACGTGGGGCTT3UL84a GACGCGTGGCATGCTTGGTGT 4UL84b AGGTTGGGGTCGACGCGTGGC 5UL101xa GGCTGAGCGGTCATCCTCGGA 6UL112-113I/X1 CGGGACTCACCGTCGTTCTG7UL112-113I/X2 GGAGGAGAGCCTACAGACGG8UL112-113I/X3 AGTAACGCACCGTCGGTGCC9本发明的寡核苷酸由以下成分组成脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，2-O-甲基-核糖核苷酸，或以上的组合，其中的核苷酸之间以一核苷酸的5’端与另一核苷酸的3’端共价连接。这些寡核苷酸长度至少为6个核苷酸，优选的长度为15-50个核苷酸，以15-30个单体最为常见。这些寡核苷酸可以用本领域内认可的方法制备，例如可以用本领域认可的技术共价连接核苷酸，这些技术例如磷酰胺酯，H-膦酸酯化学过程或甲基磷酰胺化学过程(例如，参见Uhlmann et al.(1990)Chem.Rev.90543-584；Agrawal et al.1987 Tetrahedron.Lett.28(31)3539-3542)；Caruther etal.(1987)Meth.Enzymol.154287-313；美国专利5,149,798)，这些可以手工操作或自动化合成仪合成然后被加工(Agrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10152-158)。
本发明寡核苷酸可被多种方法修饰而不损害其与HCMV DNA或mRNA杂交的能力。例如寡核苷酸在一个核苷酸的5’端和另一个核苷酸的3’端之间的核苷酸间键合可以不是磷酸二酯键，其中5’磷酸核苷酸已被任许多个化学基团取代。例如，带有硫代磷酸酯键的寡核苷酸可以通过本领域众所周知的方法如甲氧基亚磷酰胺化(参见Agrawalet al.(1988)Proc Natl.Acad.Sci(USA)857079-7083)或H-膦酸酯化(参见Frochler(1986)Tethabedron Lett.275575-5578)而制备。Bergot etal所述合成方法(J.Chromatog(1992)55935-42)也可应用。其它一些化学修饰基团的例子包括烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯，烷基硫代膦酸酯，磷酰胺，亚磷酰胺，磷酸酯，2-O-甲基，氨基甲酸酯，乙酰胺，羧甲基酯，碳酸酯和磷酸三酯。其有上述这些键合的寡核苷酸可以按已知方法制备(参见Agrawal and Goodchild(Tetrahedron Lett(1987)283539-3542)；Agrawal et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1988)857079-7083)；Uhlmann et al.(Chem.Rev.(1990)90534-583；Agrawal et al.(Trends Biotechnol(1992)10152-158)。
其他修饰包括寡核苷酸分子内部或末端的修饰并且包括核苷酸分子间的磷酸酯键的添加物，例如胆甾型化合物或二胺化合物，并且其中在氨基与末端核糖，脱氧核糖和磷酸酯修饰之间的碳残基数可以不同，其可以裂解或交联到相对链上或与相关酶或与其他病毒基因组结合的蛋白相连。所述修饰的寡核苷酸的例子包括带有被修饰的碱基和/或糖如用阿拉伯糖代替核糖的寡核苷酸，或带有3’，5’均被化学基团结合(但其中3’端不是羟基，5’端不是磷酸酯基)的糖的3’，5’取代寡核苷酸。其他修饰的寡核苷酸可以是在3’和/或5’端用赋予核酸酶抗性的大取代基加帽，或每分子核苷酸有一非桥式氧取代。这些修饰可以在部分或所有的核苷酸间键合上。也可以在寡核苷酸的某一或两个末端，和/或在分子内(综述见Agrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10152-158)。
为评估本发明中具体寡核苷酸的抗病毒效果，进行了ELISA实验。简而言之，对HCMV侵染敏感的细胞(即允许细胞)用不同浓度的列于表2A和2B的寡核苷酸进行预处理。
表2A寡核苷酶针对于UL36 I/X1 第一个I/X交界区UL36 I/X1A IE内含子/外显子交界区UL36 I/X1B IE内含子/外显子交界区UL36 I/X1C IE内含子/外显子交界区UL37 I/X1 IE第一个内含子/外显子交界区UL37 I/X2 IE第二个内含子/外显子交界区UL37 I/X3 IE第三个内含子/外显子交界区UL44a E聚合酶持续合成因子UL44b E聚合酶持续合成因子UL70a E解旋酶-引物酶复合物UL70b E解旋酶-引物酶复合物UL84a E推测的转译起始区UL84b E推测的转译起始区UL101xa 引物酶相关因子(PAF)UL102aPAFUL102bPAFUL112-113 I/X1E内含子/外显子交界区UL112-113 I/X2E内含子/外显子交界区UL112-113 I/X3E内含子/外显子交界区irsla IE推测的转译起始区irslb IE推测的转译起始区orila 复制起始点orilb 复制起始点IE(ISIS) IE2转译起始区表2B寡核苷酸序列 SEQ ID NOUL36 I/X 1 TGGGGCTTACCTTGCGAACA1UL36 I/X 1A GACGTGGGGCTTACCTTGCG2UL36 I/X 1B CAACGACGTGGGGCTTACCT10UL36 I/X 1C TCTTCAACGACGTGGGGCTT3UL37 I/X 1 ACCCCTGCTTACTGGTGAGA11UL37 I/X 2 GTTGTTTTTACCTGAAACCC12UL37 I/X 3 CCGAACGGCGGTTTCTCCAC13UL44a CTTGCGATCCATCCCGGACAG 14UL44b CTCCGAGAGGCGCGTCTTGC15UL70a ACGAGCGTCATCGTCGCGCCGG 16UL70b CATCGTCGCGCCGGCACGATGC 17UL84a GACGCGTGGCATGCTTGGTGT 4UL84b AGGTTGGGGTCGACGCGTGGC 5UL101xaGGCTGAGCGGTCATCCTCGGA 6UL102a GCGAAACGACATGGCCAAATC 18UL102b GCGCGTGGGTGCCATACTCTT 19UL112-113 I/X1 CGGGACTCACCGTCGTTCTG7UL112-113 I/X2 GGAGGAGAGCCTACAGACGG8UL112-113 I/X3 AGTAACGCACCGTCGGTGCC9irs1a CCGTTGCGCTGGGCCATGGG20irs1b CATGGGCGCCGGACACCTGC21ori1a AAATCATCTCTGACGTAGCG22ori1b GCTCGCTACGCTCGCTACGTC 23IE(ISIS) GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG 24以0.05-0.4不同程度的感染复数用HCMV感染细胞，温育一段时间后，通过测定UL44的相对水平可以间接方式测定HCMV的复制。UL44是存在于感染细胞内的DNA复制必需的一种HCMV蛋白。当HCMV复制受抑制时，检测到UL44的水平较低。
图5-7及图9的结果表明，在上述实验中，较任何其它所测试的反义寡核苷酸而言，抗UL36的反义寡核苷酸对UL44基因产物的产生抑制水平最大。如上所述，抗这种基因的寡核苷酸是与未经剪接的UL36的RNA的内含子-外显子的交界区互补。此寡核苷酸的典型代表包括UL36 I/X1，其核苷酸序列列于SEQ ID NO1，UL36 I/X1A(SEQID NO2)，UL36 I/X1C(SEQ ID NO3)。
图6显示了类似实验的结果，在此不仅使用了UL36 I/X1寡核苷酸，还使用了针对UL36-38区其它基因座(即UL37)的寡核苷酸。针对这些其它基因座的寡核苷酸的作用其微。
图7(及图8和图11)同样显示了针对UL84转录子或其基因的寡核苷酸的抑制作用。UL84a具有的核苷酸序列列于序列表SEQ ID NO4，UL84b的核苷酸序列列于SEQ ID NO5。
图7、8和10的实验结果表明UL101a同样具有抑制活性。该寡核苷酸的序列列于序列表SEQ ID NO5，并针对UL101x基因。
为确定本发明的寡核苷酸是否可以抑制HCMV的DNA合成，将细胞经过寡核苷酸预处理后，用HCMV感染细胞，用32P-随机引物产生的oriLyt(HCMV复制起始点PvuI-KpnI片段)为探针探查，制备Southern印迹。该印迹的典型放射性自显影结果示于图12和图13，这些结果类似于ELISA的结果，说明用浓度低至0.08μM的与UL36 DNA或RNA互补的寡核苷酸处理的细胞，其HCMV的DNA复制可被减弱到可忽略量。针对IE2基因的寡核苷酸(SEQ ID NO24)在任何浓度，其抑制HCMV DNA复制的能力均弱于UL36寡核苷酸。进而，针对UL84和UL101x基因的本发明的寡核苷酸在某些浓度抑制HCMV DNA复制的能力强于针对IE2基因的寡核苷酸IE(Azad et al.(1993) Antimicrobial Agents and Chemother 371945-1954)。
为确定本发明的寡核苷酸对HCMV RNA转录的作用，做Northern印迹分析，细胞经寡核苷酸处理，再经HCMV(MOI＝0.1)感染(或不经感染，或不经处理而感染)，再提取总细胞RNA。利用可与UL36转录子杂交的探针探查印迹。如图14所示在寡核苷酸浓度为0.4μM时UL36转录子未被检测到，在寡核苷酸浓度为0.8μM时，急剧下降。而用IE处理的细胞在此二浓度时均可检测到转录子。
上述结果证实了本发明的寡核苷酸可以被用作HCMV特异产物的抑制物。
通过比较用寡核苷酸处理的和未用寡核苷酸处理的细胞中新合成的DNA中3H-胸苷的掺入速率，可以确定本发明的寡核苷酸对细胞无毒害作用。换一种方法，用修饰的MTT或中性红实验也可以评价在抗病毒实验条件下寡核苷酸的毒性(Azad et al.(1993)Antimicrob.Ag.and Chemother.371945-1954；Babich et al.(1991)Appl.Environ，Microbiol.572101-2103；Denzoit et al.(1986)J.Immunol.89271-277)。
通过对选定基因的选择性反义减量调控，本发明的寡核苷酸同样可以用作为确定基因功能并因此而确认关键基因(例如，DNA复制所必需的)的工具。因为HCMV有较长的繁殖周期，DNA复制发生于感染后(PI)的36小时，相对而言单纯疱疹病毒(HSV)的DNA复制则发生在PI6-8小时的早期内。与HSV相似，IE基因表达发生在感染后(PI)2小时。在IE基因表达及CMV特征性的DNA复制开始之间的长滞后期，使得选择在HCMV关键基因内突变的温度敏感突变株极为困难。另外，HCMV只是对正常二倍体人类成纤维细胞有感染能力这一事实，使产生能维持病毒生长和HCMV关键基因表达的共转染的细胞株变得不可能。
在反义途径中，通过应用本发明的反义寡核苷酸，可以破坏或减量调控某一特异病毒基因或基因转录子。例如，阻止IE基因产物的合成和表达消除了IE基因产物的作用，这可以通过给被CMV感染的细胞使用反义寡核苷酸来达到，此寡核苷酸与UL36，UL84或UL101x CMV基因互补，它们与这些基因或转录子杂交，从而产生在关键基因内有缺陷的CMV突变体的外遗传等价物。这种“反义突变体”与野生型行为相同，但其关键基因的功能被削弱或严重地受到负调控。从这方面看，本发明的寡核苷酸可作为一种遗传学工具来评估病毒因子及它们在被感染细胞中的作用，从而确定如何通过基因表达来调控HCMV DNA复制。
本发明的寡核苷酸同样可做为诊断探针。因为这些寡核苷酸可以抑制病毒复制，在诊断分析中可用来确定医疗临床和实验样品中是否存在HCMV。样品与未经处理或经寡核苷酸预处理的细胞一同温育，在经过处理的细胞中HCMV的生长受到抑制而在未经处理的细胞中则相反，这便可以确认样品中存在HCMV。这一实验对于检测CMV污染及个体感染同样有用。
本发明进一步提供了具有针对HCMV感染有抗病毒活性的治疗组合物。该组合物包含至少一种本发明的寡核苷酸，及一种生理上可接受的载体。
在本文中所用的术语“生理上可接受的载体”包括各种溶剂，分散剂，包衣剂，抗病毒和抗真菌试剂，等渗和吸收延迟试剂，等等。在本领域这些用作为药物活性物质的介质和试剂是众所周知的。除了与活性成分不相容的传统介质和试剂，使用它时还需斟酌。辅助的活性成分也可被用在组合物中。
本发明的寡核苷酸同样可以用于治疗HCMV对人类的感染，该方法中，此药物组合物可以治疗有效量使用一次，也可以多次使用，每次用量低于治疗有效量。可以通过静脉注射、腹膜内注射，或由鼻腔、口腔、表皮或皮下引入机体，寡核苷酸治疗HCMV的有效剂量和给药方式可以通过惯用的实验确定。适合注射或其他用途的药物形式包括无菌液体溶剂或分散剂，和无菌粉末(用时制备成可注射的无菌溶剂或分散剂)。以上所有形式必须无菌，且必须在生产和贮存条件下保持稳定，可以抵制微生物污染(如细菌、真菌)，载体可以是溶剂或分散剂介质。可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂防止微生物污染，可注射药剂的吸收的延长可以通过使用吸收延迟试剂。
本文所引的专利和科技文献确立了本领域熟练人员可使用的知识，已颁证的美国专利、已授权的专利申请，以及在此所引其它出版物引入本文作参考。
以下实施例说明了制备和实施本发明的优选模式，但并不意味着限制本发明范围，因为使用其它方法可得到相似结果。实施例1、寡核苷酸的合成未修饰(磷酸二酯键连接)的寡聚脱氧核糖核苷酸，寡聚核糖核苷酸和DNA/RNA寡核苷酸嵌合体用一自动DNA合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)，使用U.S专利5,149,789中所说的H-膦酸化学法，或用Uhlmann等人所说的标准亚磷酰胺化学法(Chem.Rev.(1990)90534-583)合成。寡核苷酸硫代磷酸酯也同样用U.S专利5,149,789中所述的H-膦酸化方法来合成。具有至少一个非磷酸二酯键的核苷酸间键合的寡核苷酸包括在预选定的位置含有亚磷酰胺，甲基膦酸酯和/或一个2-O-甲基键合，其通过Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett.(1987)283539-3542)；Agrawal et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1988)857079-7083)；和/或Uhlmann等(Chem.Rev.(1990)90534-583)所描述的程序制备。具有至少一个以下键合的寡核苷酸通过Uhlmann等人所述的方法(Chem.Rev.(1990)90534-583)制备，所述键合包括二硫代磷酸酯，氨基甲酸酯，磷酸酯，2-O-甲基，烷基膦酸酯，烷基硫代膦酸酯，磷酰胺，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺，和羧甲基酯。2、测定对HCMV复制的抑制作用的ELISA(酶联免疫吸附实验)法通过ELISA检测与HCMV的RNA互补的本发明的寡核苷酸(表1)和其它核酸的抗病毒活性。取自外植体的人类表皮成纤维细胞以细胞浓度为5×103/孔的条件接种到含96孔的平皿上，培养基为补加了10％(体积/体积)胎牛血清的Dulbeccos ModifiedEagles Medium(DMEM)(Mediatech，Washington D.C.)。接种后24小时，用Opti-MEM(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)冲洗细胞一次，然后将各种不同浓度的反义寡核苷酸加入到Opti-MEM中，细胞与寡核苷酸温育16个小时(过夜)。然后移走培养基，用Opit-MEM将细胞洗三次。接着用HCMV(AD169株)(AmericanType Culture Collection，Rockville，MD；ATCC VR-538)以MOI＝0.05-0.4感染细胞。这种HCMV株可冷冻保存。在细胞被冲洗前吸附病毒1个小时，培养基换为含有寡核苷酸的Opti-MEM。
感染后(PI)5-6天，用100％酒精固定细胞，再与一级抗体反应，此抗体特异于基因UL44的产物聚合酶辅助因子，之后细胞与二级抗体反应(二级抗体为HRP-结合的羊抗鼠IgG抗体)。其在A450的OD值可由一平板阅读器得出。3 Southern印迹分析HFF细胞以每皿2×105细胞的浓度接种到6cm的皿内，其处理过程同上，但不同的是加入浓度只有0.4μM的寡核苷酸，5天后直接用400μl 2％SDS，10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA从处理的6cm培养皿中的细胞提取细胞总DNA。胞溶产物被转移到加入了200μg/ml蛋白激酶K(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的1.5ml微量离心管中，离心管于50℃温育1小时，再向裂解液中加入40μl 3.0M乙酸钠，再用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提胞溶物一次。水相转移到新离心管内，然后用氯仿/异戊醇(24∶1)再抽提一次，之后转移水相至另一新管内，加入二倍体积无水乙醇，以14,000g离心沉淀DNA，再悬浮于50μl TE中(TE为10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)。用25单位的EcoRI(New England Biolabs，Beverly，MA)酶切10μl的DNA，反应体积为50μl，37℃反应4-16小时。用0.8％琼脂糖凝胶电泳；依据厂家说明用碱式转移方法将其转移到Zeta-探针尼龙膜上(Bio-Rad，Richmond，CA)。用32P-随机引物产生的oriLyt探针(oriLyt为HCMV的Pvul-Kpnl片段复制起始区)进行杂交，其比活性约为1×109cpm/μg。于杂交炉(RobbinsScientific，(Sunnyvale，CA))中，在68℃，在10ml杂交缓冲液中用5ng探针与滤膜杂交16小时，杂交缓冲液为1.5×SSPE，7％SDS(W/V)，10％PEG(重量/体积)。用2×SSC，0.1％SDS(重量∶体积)进行杂交后的洗涤，于室温洗2次每次15分钟。之后，于68℃用0.1×SSC，0.1％SDS(重量∶体积)洗两次，每次45分钟，最后将Sorthern印迹于X-OMAT AR(Kodak，Rochester，NY)X光胶片上曝光24小时，温度-80℃。4 Nothern印迹分析用500μl 2％SDS，200mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA在6cm平皿上直接裂解处理后的细胞，胞溶物被转移到一个1.5ml微量离心管中，加入150μl冰冷的沉淀缓冲液(42.9g乙酸钾，11.2ml乙酸，加水至100ml)，振荡离心管并置于冰上2分钟，室温离心5分钟。上清转移至新管中，用300μl氯仿/异戊醇(24∶1)抽提两次。用0.65ml的冰冷异丙醇沉淀并在14,000×g下离心RNA 5分钟，用100％甲酰胺悬浮沉淀的RNA。
取10μg(约10μl)RNA在含有6％甲醛的10％琼脂糖凝胶上电泳，然后转移至Zeta-探针尼龙膜上。用针对UL36转录子的RNA探针(ribobrobe)(Sall-BssHll672bp探针，位于UL36转录子上)与滤膜杂交，在65℃下杂交16小时。杂交缓冲液为1.5×SSPE，1％SDS，50％甲酰胺，0.5％脱脂奶粉及100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。杂交后用2×SSC，0.1％SDS(重量∶体积)于65℃洗两次，每次45分钟。最后将Southern印迹于-80℃在X-OMAT AR(Kodak)X光胶片上曝光24小时。5细胞毒性检测实验在抗病毒实验条件下，寡核苷酸的细胞毒性采用修饰的MTT或中性红检验进行评估(Azad et al.(1993)Antimcrob Ag.and Chemother.371945-1954；Babich et al.1991 Appl.Environ.Microbiol.572101-2103；Denzoit et al.1986J.Immunol 89271-277)。HFF细胞按上述过程处理，做96孔的ELISA免疫实验，包括寡核苷酸的预处理。同时进行的有不经过病毒感染，细胞只在无菌培养基上模拟接种生长。在温育末期(寡核苷酸处理后第4天)直接向每孔的培养基(100μl)中加入10μl MTT(5mg/ml，溶于PBS)，再将细胞温育2小时。从每孔中除去培养基，将不溶的蓝色formAzan产物溶于酸化异丙醇中。通过一个BioTex型EL312C微型平皿阅读器确定540nm处的光密度。三次实验的平均值以相对模拟处理细胞产生信号的百分数表示，将不含细胞的孔的最小背景从每次计算结果中减去。
寡核苷酸产生的细胞毒性也可通过比较在预处理的和未处理的细胞内掺入的3H-胸苷量来确定。预处理的细胞是指经过本发明的寡核苷酸预处理24小时。然后加入1μCi的3H-T(NEN/DuPont)脉冲细胞4小时(37℃)，用0.4M NaOH将细胞裂解，胞溶物放在玻璃纤维滤膜上，充分洗涤。干燥后的滤转移到含有3ml闪烁剂的闪烁瓶中，并被计数。同等或类似物本领域的熟练人员将意识到或可能洞察出，用一般性的实验，可以产生本文所述的特异物质和所述程序的的各种同等物。这些同等物可以被认为在本发明范围内，而且在以下权利要求的范围内。
序列表(1)一般信息(i)申请人格里高利·S·帕里(ii)发明名称具有抗巨细胞病毒活性的寡核苷酸(iii)序列数目24(iv)联系地址(A)收信人Lappin & Kusmer(B)街道200 State Street(C)城市波士顿(D)州马萨诸塞州(E)国家美国(F)邮编02109(v)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Kerner，Ann-Louise(B)注册号33,523(C)案号/文档号HYZ-020PCT(ix)通讯信息(A)电话617-330-1300(B)传真617-330-1311(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO1TGGGGCTTAC CTTGCGAACA 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO2GACGTGGGGC TTACCTTGCG 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO3TCTTCAACGA CGTGGGGCTT 20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO4GACGCGTGGC ATGCTTGGTG T 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO5AGGTTGGGGT CGACGCGTGG C 21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO6GGCTGAGCGG TCATCCTCGG A 21(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否
(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO7CGGGACTCAC CGTCGTTCTG 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAGGAGAGC CTACAGACGG 20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO9AGTAACGCAC CGTCGGTGCC 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO10CAACGACGTG GGGCTTACCT 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO11ACCCCTGCTT ACTGGTGAGA 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO12GTTGTTTTTA CCTGAAACCC 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGAACGGCG GTTTCTCCAC 20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO14CTTGCGATCC ATCCCGGACA G 21(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO15CTCCGAGAGG CGCGTCTTGC 20(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO16ACGAGCGTCA TCGTCGCGCC GG 22(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA
(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO17CATCGTCGCG CCGGCACGAT GC 22(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO18GCGAAACGAC ATGGCCAAAT C 21(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO19GCGCGTGGGT GCCATACTCT T 21(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO20CCGTTGCGCT GGGCCATGGG 20(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO21CATGGGCGCC GGACACCTGC 20(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO22AAATCATCTC TGACGTAGCG20(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO23GCTCGCTACG CTCGCTACGT C21(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO24GCGTTTGCTC TTCTTCTTGC G 2权利要求
1.长度为15-50个核苷酸的合成寡核苷酸，它能够与来自巨细胞病毒基因UL36，UL84，UL101x-102或UL112-113的RNA或DNA至少部分特异杂交。
2.权利要求1中所述的寡核苷酸，它是经过修饰的。
3.权利要求2所述的修饰的寡核苷酸，含有至少一个选自于如下一组的核苷酸间键合硫代磷酸酯，2-O-甲基，烷基膦酸酯，或以上的组合。
4.权利要求1所述的寡核苷酸，长度为15-30个核苷酸。
5.权利要求1所述的寡核苷酸，含有至少一个脱氧核糖核苷酸。
6.权利要求1所述的寡核苷酸，含有至少一个核糖核苷酸。
7.权利要求6所述的寡核苷酸，含有至少一个核糖核苷酸。
8.权利要求1所述的寡核苷酸，针对于UL36的外显子/内含子交界处。
9.权利要求8所述的寡核苷酸，具有序列表的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的核酸序列。
10.权利要求1所述的寡核苷酸，针对于UL84的推测的转译起始区。
11.权利要求10所述的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所述的核酸序列。
12.权利要求1所述的寡核苷酸，针对于UL101x的推测的转译起始区。
13.权利要求12所述的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID NO6所述的核酸序列。
14.权利要求1所述的寡核苷酸，针对UL112-113外显子/内含子交界处。
15.权利要求14所述的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID NO7，SEQ ID NO8或SEQ ID NO9所述的核酸序列。
16.具有抗人类巨细胞病毒活性的合成的寡核苷酸，所述的抗性通过与巨细胞病毒基因UL36，UL84，UL101x-102或UL112-113的转录子的一部分杂交而产生。
17.含有权利要求1所述的寡核苷酸及一种药物学可接受载体的药物组合物。
18.治疗或防止人类巨细胞病毒感染细胞的方法，该方法包括给细胞使用治疗剂量的权利要求17所述的药物组合物。
19.制备突变的DNA复制缺陷的巨细胞病毒的外遗传等同物的方法，包括给被巨细胞病毒感染的细胞使用与巨细胞病毒基因UL36，UL84或UL101x-102互补的寡核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一类长为15-50个核苷酸的合成寡核苷酸，它可至少部分与来自巨细胞病毒基因UL36、UL84、UL101x-102或者UL112-113的RNA或DNA特异杂交。同时公开了包括本发明的寡核苷酸的药物组合物以及应用该寡核苷酸抑制巨细胞病毒感染的方法。
文档编号C07H21/00GK1154702SQ95194344
公开日1997年7月16日 申请日期1995年5月19日 优先权日1995年5月19日
发明者格里高利·S·帕里 申请人:海布里登公司