专利名称：猪巨细胞病毒抗体间接阻断elisa检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种动物传染病检测用试剂盒及其检测方法，尤其是猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
猪巨细胞病毒(Porcine cytom egalovirus, PCMV)是一种引起猪包涵体鼻炎(porcine inclusion-body rhinitis)或猪巨细胞包涵体病(porcine cytomegalicinclusion disease)的病毒。猪巨细胞病毒又称为猪疱疫病毒2型,属于疱疫病毒科，3疱疫病毒亚科，巨细胞病毒属，该病毒粒子直径为150 200nm,具有电子致密核心,其外围是由衣壳蛋白构成的二十面体核衣壳，基因组为双链DNA。PCMV培养较困难，只有3 5周龄的猪肺巨噬细胞高度敏感，接种后3 14d出现巨细胞，形成核内包涵体和偶尔有小的胞浆内涵体。感染细胞增大到正常细胞的6倍左右时，线粒体、内质网和高尔基体肿胀，可见大的嗜碱性核内包涵体。PCMV感染的潜伏期大约为10天到20天，常感染I 3周龄的仔猪，病猪表现出轻度鼻炎，严重时可见仔猪颤抖、呼吸困难或死亡，易感妊娠母猪有病毒血症时表现倦怠、拒食，产出死胎或弱仔，存活者矮小、苍白，且增重缓慢，该病的仔猪死亡率高达50%以上。死亡猪皮下有水肿液析出，跗关节水肿，淋巴结肿大、坏死；肺部有明显的充血和肉质化病变，间质性明显增宽；气管内有脓性分泌物，毛细血管周围有环状出血；脾脏感染导致标志性的裂口病变，并卷曲变形。肝脏有明显肿大梗死，有坏死灶；心肌无力，呈现单侧心衰；胃部严重的卡它性炎症，肠道变薄并在毛细血管周边有明显的出血，肾脏有明显不规则的弥漫性出血，有的肾脏变形，肾盂水肿充血。自1955年Done首次报道该病以来，欧洲、日本、美国、澳大利亚先后报道了该病的存在，目前该病广泛存在于世界各地，中国各地区也有流行。日本学者曾克隆和表达了 PCMV主要衣壳蛋白，结果发现人工感染PCMV的猪血清不与细菌表达的主要衣壳蛋白发生特异性反应，表明PCMV主要衣壳蛋白可能与感染PCMV后的体液免疫应答无关，而疱疹病毒囊膜糖蛋白B(gB)在病毒感染和诱导体液免疫方面起着重要作用。因此基于对猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B(gB)的研究对猪巨细胞病毒的检测方法建立意义重大。目前，国内外对于PCMV检测方法建立的研究较少。Assaf和Tjima等分别以全病毒作为包被抗原，建立了 PCMV抗体的免疫荧光抗议技术和酶联免疫吸附试验等血清学检测方法，但其所建立方法有一定局限性，很难大面积应用推广。而目前国内外所建立的PCMVPCR诊断方法由于检测成本过高，在生产上无法大规模应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒及其检测方法，及猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B(gB)基因优势抗原表位区所表达蛋白(在本发明申请中以下简称gB蛋白)作为抗原(在本发明申请中以下简称为重组抗原)包被酶标反应板的制备方法。本发明技术方案一种猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒，包括抗体检测板，酶结合物工作液，样品稀释液，显色液A，显色液B，终止液；阻断抗体，洗涤液；所述的阻断抗体为使用纯化后的猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白免疫家兔后，从家兔体内获得的多克隆抗体；所述酶结合物工作液为商品化的辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体，进行I 10000稀释的稀释液，酶标二抗直接加入酶标二抗稀释液中，酶标二抗稀释液为KH2PO4O. 2g, Na2HPO4 12H20 2. 9g, NaCl 29g, KCl 0. 2g, PEG6000 40g,加 ddH20 定容至1000ml，加入0. 01% 0. 05%硫柳汞，调pH至7. 4 ;所述样品稀释液为KH2PO40. 2g，Na2HPO4 12H20 2. 9g, NaCl 29g，KCl 0. 2g,PEG600040g，加 ddH20 定容至 1000ml，加入 0. 01% 0. 05%叠氮钠，调 pH 至 7. 4 ;所述显色液A 为:0. 2mol/L Na2HPO4 51. 4ml, 0. lmol/L 柠檬酸 48. 6ml，用 HCl 调pH 值至 5. 0 5. 4，加 30% H2O2 67 U I ；所述显色液B为TMB 50mg,加无水乙醇5ml,搅拌溶解后加0. lmol/L朽1檬酸5ml,
0.lmol/L EDTA 0. 5ml，加 ddH20 定容至 100ml ；所述终止液为2mol/L H2SO4溶液；所述抗体检测板为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原包被的可拆卸96孔酶标反应板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，阻断抗体为兔抗猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白多克隆抗体。所述的检测试剂盒，所述阻断抗体的制备使用纯化后的PCMV gB优势抗原表位区蛋白与弗氏佐剂制成油乳剂，对体重在2kg左右的健康公兔进行免疫，使其产生抗体；第一次免疫取ImL纯化产物，与ImL完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；14天后进行第二次免疫，取2mL纯化产物与2mL不完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；7天后进行第三次免疫，取3mL纯化产物与3mL不完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；7天后进行第四次免疫，取0. 5mL纯化产物注射入耳缘静脉免疫家兔；一周后无菌采取心血，分离出的血清即为阻断抗体。所述的检测试剂盒，所述猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原的制备方法为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原的制备选择猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B(gB)基因0RF(GenBank FJ595497. I)中一段优势抗原表位区的270个碱基序列，进行密码子优化以后，在invitrogen公司合成优化后的基因序列，而后将其克隆到pET32a⑴表达载体，并分别转化到受体菌DH5 a和Rosetta(DE3)中，将两株重组菌分别命名为大肠埃希氏菌DH5 a -pET-gB株和大肠埃希氏菌Rosetta-pET-gB株，将Rosetta-pET-gB经IPTG诱导表达，经裂解、纯化后获得。
所述的检测试剂盒,所述抗体检测板的制备方法为使用pH = 9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的gB优势抗原表位区蛋白作为抗原按照I : 320的体积比例稀释后，每个样孔加入100 u L抗原，置于4°C 10 20h，进行包被，使用样品稀释液覆
盖后抽空封装，置4°C保存。本发明还提供一种引用上述检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤I)将IOX洗涤缓冲液加入ddH20稀释成IX洗涤工作液，将阻断抗体用样品稀释液进行1600倍稀释，将待检样品进行I : 5稀释；2)在抗原包被板上设定阻断抗体对照孔，加入阻断抗体，每孔100 Ul ;3)将待检样品加入检测样孔中，每孔100 yl，封装于封口袋中37°C孵育I. 5h ；4)将各样孔中的液体倒掉后用IX洗涤工作液洗涤，每孔300ia，洗涤4次，每次2min ；5)将稀释后的阻断抗体加入检测样孔，每孔IOOiU,封装于封口袋中37°C孵育lh，重复步骤4)；6)加入酶标二抗工作液，每孔IOOii I，封装于封口袋中37°C孵育40mim，重复步骤4)；7)每孔按顺序加入显色液A 50ii 1，再向每孔中加入显色液B 50^1，室温显色IOmin ；8)每孔按顺序加入终止液(2M H2SO4) 50 U I终止反应，450nm单波长测定OD值，计算抑制率；9)检测样品的判断标准为
权利要求
1.一种猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于包括抗体检测板，酶结合物工作液，样品稀释液，显色液A，显色液B，终止液；阻断抗体，洗涤液；所述的阻断抗体为使用纯化后的猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白免疫家兔后，从家兔体内获得的多克隆抗体；所述酶结合物工作液为商品化的辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体，进行I : 10000稀释的稀释液，酶标二抗直接加入酶标二抗稀释液中，酶标二抗稀释液为KH2P040. 2g,Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, NaCl 29g, KCl 0. 2g, PEG6000 40g,加 ddH20 定容至 1000ml,加入 0.01% 0. 05%硫柳汞，调pH至7· 4 ;所述样品稀释液为=KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 · Iffi2O 2. 9g，NaCl 29g，KCl O. 2g，PEG600040g，加 ddH20 定容至 1000ml，加入 0· 01% 0· 05%叠氮钠，调 pH 至 7. 4 ;所述显色液 A 为0. 2mol/L Na2HPO4 51. 4ml, O. lmol/L 柠檬酸 48. 6ml，用 HCl 调 pH 值至 5. O 5. 4，加 30% H2O2 67 μ I ；所述显色液B为TMB 50mg,加无水乙醇5ml,搅拌溶解后加O. lmol/L朽1檬酸5ml,O.lmol/L EDTA O. 5ml，加 ddH20 定容至 100ml ；所述终止液为2mol/L H2SO4溶液；所述抗体检测板为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原包被的可拆卸96孔酶标反应板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，阻断抗体为兔抗猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白多克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于所述阻断抗体的制备使用纯化后的PCMV gB优势抗原表位区蛋白与弗氏佐剂制成油乳剂，对体重在2kg左右的健康公兔进行免疫，使其产生抗体；第一次免疫取ImL纯化产物，与ImL完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；14天后进行第二次免疫，取2mL纯化产物与2mL不完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；7天后进行第三次免疫，取3mL纯化产物与3mL不完全弗氏佐剂混合制成油乳剂，皮下多点免疫家兔；7天后进行第四次免疫，取O. 5mL纯化产物注射入耳缘静脉免疫家兔；一周后无菌采取心血，分离出的血清即为阻断抗体。
3.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于所述猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原的制备方法为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原的制备选择猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B(gB)基因0RF(GenBank FJ595497. I)中一段优势抗原表位区的270个碱基序列，进行密码子优化以后，在invitrogen公司合成优化后的基因序列，而后将其克隆到pET32a(+)表达载体，并分别转化到受体菌DH5a和Rosetta (DE3)中，将两株重组菌分别命名为大肠埃希氏菌DH5 a -pET-gB株和大肠埃希氏菌Rosetta-pET-gB株,将Rosetta-pET-gB经IPTG诱导表达，经裂解、纯化后获得。
4.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征在于所述抗体检测板的制备方法为使用pH = 9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的gB优势抗原表位区蛋白作为抗原按照I : 320的体积比例稀释后，每个样孔加入100 μ L抗原，置于4°C 10 20h，进行包被，使用样品稀释液覆盖后抽空封装，置4°C保存。
5.根据权利要求I所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤I)将10X洗涤缓冲液加入CldH2O稀释成IX洗涤工作液，将阻断抗体用样品稀释液进行1600倍稀释，将待检样品进行I : 5稀释；.2)在抗原包被板上设定阻断抗体对照孔，加入阻断抗体，每孔IOOyI;.3)将待检样品加入检测样孔中，每孔100μ1，封装于封口袋中37°C孵育I. 5h ；.4)将各样孔中的液体倒掉后用IX洗涤工作液洗涤，每孔300μ 1，洗涤4次，每次2min ；.5)将稀释后的阻断抗体加入检测样孔，每孔 οομ1，封装于封口袋中37°C孵育lh，重复步骤4)；.6)加入酶标二抗工作液,每孔100μ I，封装于封口袋中37°C孵育40mim，重复步骤4)；.7)每孔按顺序加入显色液A50μ 1，再向每孔中加入显色液B 50μ1，室温显色IOmin ；.8)每孔按顺序加入终止液(2ΜH2SO4) 50 μ I终止反应，450nm单波长测定OD值，计算抑制率；.9)检测样品的判断标准为率(=p且證 ODg-^OgflIxlOOo70L 阻断抗体OD值」当样品抑制率彡24. 5%时为PCMV抗体阳性，当样品抑制率< 19. 8%时为PCMV抗体阴性，抑制率在两者之间的样品需要重复检测一次。
全文摘要
本发明公开了一种猪巨细胞病毒抗体间接阻断ELISA检测试剂盒。试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阻断抗体，样品稀释液，洗涤液，显色液A，显色液B，终止液。该试剂盒的检测板为猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白重组抗原包被的可拆卸96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，阻断抗体为兔抗猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区蛋白多克隆抗体。本发明有益的积极效果是特异性强、灵敏度高、操作简单，适合于临床大规模推广应用，具有广阔的市场前景。
文档编号G01N33/569GK102621305SQ201210042330
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者刘骁, 徐志文, 朱玲, 郭万柱 申请人:四川农业大学