专利名称：用于血管疾病诊断的配位化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断血管疾病的新配位化合物，它们的制备方法，以及含有这些化合物的诊断试剂。
动脉硬化是慢性、渐进性血管疾病，以前，它只能在晚期阶段才能被临床诊断出来。动脉硬化造成的血管变化在今天通常是用动脉造影来确定，即通过导管将对照剂送到所关心的血管处，然后用X射线观察血管区域是否狭窄。这种方法的缺点是血管系统中只有部分区域可以被观察到。因为动脉造影是侵入式方法，所以由于它的使用可能会引起并发症，例如，疼痛，动脉穿孔，心律不齐，心脏病发作或中风，不幸的话甚至会造成病人死亡。
以超声及MR-X射线断层照相技术应用为基础的其它方法也被用于动脉硬化的诊断。
所有目前使用的方法都有一个很大的缺陷，那就是动脉硬化血管的变化是通过观察收缩的血流或动脉壁的明显变化才探测到的，因而也只有到动脉粥样化形成的晚期才能够检查出来。
动脉硬化的早期检查，例如对饮食，钙拮抗药，降脂质和高血压药物的治疗效果的控制，血管成形术后的再狭窄的控制和冠状心脏病的诊断以及血栓形成的血管沉积的检测，都是极为重要的。
已有文献描述过采用非侵入技术进行动脉硬化诊断。结合到动脉硬化管壁区域的放射性标识抗体或标记了的低密度脂蛋白(LDL)也有文献介绍(Lees等人，1993，J.Nucl.Med.，24，154-156；Kaliman等人，1985，Circulation，72，300；Virgolini等人，1991，Eur.J.Nucl.Med.，18，944-947)。但这些方法有致命的缺点，例如，有机体上抗体的抗原作用和长持续期(几天)需要对患者血中LDL进行分离，纯化和标识。这些大分子还在血中表现出长半衰期，它们与在整个身体内的高本底放射性一起使动脉硬化损伤的定位不可能或者也比较困难。
Shih等人(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，87，1436-1440)已经合成了LDL-蛋白片段(apo-B-100)的部分序列，它们虽然仍然结合于动脉硬化斑块上，但已表现出在血中为总体较短的半衰期和较好的信噪比。由于它们对斑块的亲和力小和/或斑块中apo-B-肽的结合部位的密度低，因此，不可能成功地进行体内动脉硬化诊断。
本发明的目的是提供新的化合物和药剂，它们适用于非侵入式诊断方法，特别适用于早期的还没有狭窄的血管疾病的诊断。
内皮素是生理活性肽，它在有机体中起着激素作用和神经调节功能(MacCumber等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，7285-7289；Yanagisawa等人，1989，Trends Pharmacol.Sci.，10，374-378；LeMonier die Gouville等人，1989，Life Sci.，45，1499-1513；Yanagisawa等人，1988，Nature，332，411-415)。到目前为止，已经识别出人类四种不同的同种型(Inoue等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，86，2863-2867)。内皮素1是具有下列21种氨基酸序列的多肽Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp(Yanagisawa等人，1988，Nature，332，411-415)。
大内皮素(Big Endotheline)，一种内皮素非活性前体，形成于血管内皮。十七肽通过内皮素转化酶(Endotheline-Converting-Enzyme)(ECE)被分离出来之后，产生内皮素，它结合在平滑血管肌肉系统的特定受体上，进而导致平滑肌细胞的Ca++-促进的收缩(Yanagisawa等人，Nature，332，411-415；Takuwa等人，1991，Contrib.Nephrol.，90，99-104)。
由动脉粥样化形成引起的早期不可逆变化之一是由生长因子(例如，PDGF)造成的血管壁平滑肌细胞增生(Desmouliere和Gabbiani，1992，Cerebrovasc.Dis.，2，63-71)。通过人的动脉粥样化冠状动脉与125I-内皮素1一起体外培养，结果表明125I-内皮素1在中膜区以及血管滋养管(Vasavasora)区结合增加(Dashwood等人，1991，J.Cardiovasc.Pharmacol.，17，458-462)。通过对兔子使用125I-内皮素1，这些兔子的腹主动脉早些时候已通过气囊导管去掉内皮，在主动脉的去内皮区表现出125I-内皮素1摄入量增加，这表明在损伤的血管区对内皮素1的结合部位有更大的密度(Kurata等人，1992，J.Nucl.Med.，33，845)。从这些研究可以概括出增生的平滑肌细胞还进一步表达内皮素受体。
内皮素1对平滑血管肌肉系统有很强的血管收缩作用(A.M.Doherty，1992，Medical Chemistry，35，1493-1508)。因此，只能采用相对低浓度的内皮素1静脉内注射到有机体中。较高浓度只能以内皮素的部分序列，内皮素衍生物，内皮素类似物或内皮素拮抗剂使用，尽管它们结合于内皮素受体，但它们不会引起平滑肌细胞明显收缩。
由于内皮素会很快通过肾排除，因此，其它器官或组织对内皮素摄入引起的本底辐射干扰是极低的。
德国专利申请P 43 01 871.8已经描述了含有结合于内皮素受体上的内皮素，内皮素的部分序列，内皮素衍生物，内皮素拮抗剂或内皮素类似物的化合物。
在研究其它化合物时，我们发现了具有下列通式I的物质(K)z-(L)y-(A1)aa-(A2)bb-(A3)cc-(A4)dd-(A5)ee-(A6)ff-(A7)gg-(A8)hh-(A9)jj-(A10)kk-(A11)ll-Ile-Ile-Trp (I)其中aa，bb，cc，dd，ee，ff，gg，hh，jj，kk和ll彼此独立地代表整数0，1或2，y和z彼此独立地代表整数0或1，K表示通式IIA或IIB的形成螯合物的残基，
其中T是氢原子或在金属原子上的键或适当的硫保护基团，如碱金属离子，C1-6-酰基残基，苯甲酰基残基，羟基乙酰基残基，乙酰氨基甲基残基，对甲氧基苄基残基，乙氧乙基残基，苄基残基，邻-或对-羟基苄基残基，邻-或对-乙酰氧基苄基残基，对硝基苄基残基，4-吡啶甲基残基，2-吡啶甲基-N-氧化物 残基，9-蒽基甲基残基，9-芴基残基，二茂铁基甲基残基，二苯甲基残基，双(4-甲氧基苯基)甲基残基，二苯并环庚基残基，三苯甲基残基，二苯基-4-吡啶基甲基残基，苯基残基，2，4-二硝基苯基残基，叔丁基残基，1-金刚烷基残基，甲氧基甲基残基，异丁氧基甲基残基，2-四氢吡喃基残基，苄硫基甲基残基，苯硫甲基残基，三甲基乙酰氨基甲基残基，苯甲酰氨基甲基残基，乙酰基甲基残基，羧甲基残基，氰基甲基残基，2-硝基-1-苯乙基残基，2-(4’-吡啶基)乙基残基，2-氰基乙基残基，2，2-双(乙酯基)乙基残基，1-间硝基苯基-2-苯甲酰基乙基残基，2-苯基磺酰基乙基残基，1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-甲基丙-2-基残基，甲硅烷基残基，N-{[(对-联苯基)异丙氧基]羰基}-N-甲基-γ-氨基丁酸酯残基，N-(叔丁氧羰基)-N-甲基-γ-氨基丁酸酯残基，2，2，2-三氯乙氧基羰基残基，叔丁氧羰基残基，苄氧羰基残基，对甲氧基苄氧羰基残基，N-乙基残基，N-甲氧基甲基残基，S-乙基残基，叔-S-丁基残基，取代的S-苯基残基，磺酸酯残基，亚磺酰硫代碳酸酯残基或3-硝基-2-吡啶亚磺酰基残基，或者两个T残基与它们连接的S原子一起形成分子间或分子内二硫化物的桥，R4代表式IIC或IID残基，* *
其中*标示的碳原子与式IIB的亚氨基相连，和n’代表整数1或2，i为数字2-6，及TT为α-氨基酸残基，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，4-羟基脯氨酸，5-羟基赖氨酸，鸟氨酸，肌氨酸或牛磺酸和/或它们的同系β-氨基酸，它们以常规方式键于酰胺基团上，以及式IIE的形成螯合物的残基，
其中R6代表氢或C1-6烷基残基，和式IIF的形成螯合物的残基，
其中R7-R18残基彼此独立地代表氢原子，C1-10烷基链和/或L上的键，o，p和r分别代表数字1或2，T定义如上，和式IIG的形成螯合物的残基，
其中R19-R24彼此相同或不同，分别独立地代表氢原子，或C1-4烷基残基，m’代表整数2或3，和式IIH的形成螯合物的残基，
其中X1代表一根键，亚甲基或CHY4基团，Y1，Y2，Y3或Y4基团之一代表键于L的键，其余的表示氢或任选地代表氧原子，T定义如上，及A1，A2，A3和A4相同或不同，且相互独立地代表氢或C1-6烷基残基，和式IIJ的形成螯合物的残基，
其中R27代表氢原子或任选代表被一或两个羟基取代的C1-6烷基残基，R25和R26分别代表氢原子或一起代表氧原子，A是羟基或巯基，
Y是氢原子，羧基或磺酰基残基，及Z是碳原子或氮原子，和式IIK的形成螯合物的残基，(AA1)mm-(AA2)nn-(AA3)oo-(AA4)pp-(AA5)qq-(AA6)rr(IIK)其中mm，nn，oo，pp，qq和rr彼此独立地代表整数0，1或2，AA1-AA6彼此独立地代表α-氨基酸的残基，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，它们在硫上任选带有上述定义的T基团，但不是氢原子，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，4-羟基脯氨酸，5-羟基赖氨酸，鸟氨酸，肌氨酸或牛磺酸和/或它们的同系β-氨基酸，它们以常规方式键于酰胺基团上，而且，任选地每两个存在的半胱氨酸残基彼此相连形成一个胱氨酸残基，和式IIL的形成螯合物的残基，
其中Ra，Rb，Rc，Rd，Rf，Rg和Rh彼此相同或不同，分别代表氢原子和/或支链或非支链C1-C6烷基残基，Re表示羧基或非支链，支链，环状或多环C1-C60烷基，链烯基，多链烯基，炔基(alkinyl)，多炔基，芳基，烷芳基或芳烷基残基，它们可任选被羟基，氧基，氧代，羧基，氨基羰基，烷氧基羰基，氨基，醛基或有至多20个碳原子的烷氧基取代，和/或任选被一或多个选自O，N，S，P，As，Se系列的杂原子间隔和/或取代，T定义如上，L代表一根键或氢原子或非支链，支链，环状或多环C1-C60烷基，链烯基，多链烯基，炔基，多炔基，芳基，烷芳基或芳烷基残基，它们可任选被一个或多个羟基，巯基，烷硫基，氧基，氧代，羧基，氨基羰基，烷氧基羰基，氨基，醛基或有至多20个碳原子的烷氧基取代，和/或任选被一或多个选自O，N，S，P，As，Se系列的杂原子间隔和/或取代，或表示Z1-R-Z2残基，其中R代表直链，支链，饱和或不饱和C1-20烷基残基，它们可以任选被一或多个氧原子和/或硫原子和/或羰基，-NHCO-，-N(C1-6烷基)CO-，-NH-和-N(C1-6烷基)残基间隔，以及任选被羟基和/或环氧基团取代，Z1和Z2彼此独立地分别代表-O-，-S-，-(C＝O)O-，-NH(C＝S)NH-，-(C＝O)-和-NH(C＝S)-基团，或代表式α的残基，
其中s和t彼此独立地代表整数0，1，2或3，环B表示苯基或环己基残基，Z1和Z2定义如上，A1-A11彼此独立地代表L-α-或D-α-氨基酸残基，-NH-CH(Z)-CO-残基，其中Z指H-，CH3-，(CH3)2CH-，(CH3)2CH-CH2-，CH3-CH2-CH(CH3)-，CH3-S-(CH2)2-，HOOC-CH2-，HOOC-(CH2)2-，H2N-(CH2)3-，H2N-C(＝NH)-(CH2)3-，HO-CH2-，CH3-CH(OH)-，HS-CH2-，HS-(CH2)2-，H2N-CO-CH2-，H2N-CO-(CH2)2-，(HOOC)2CH-CH2-，
其中n为整数0，1或2，或残基
或牛磺酸残基，以及它们与原子序数为21-32，37-39，42-51和57-83的金属离子形成的配合物及其水溶性盐，令人惊奇地，该化合物可强有力地富集动脉硬化斑块，而且，由于这些物质被快速消除使其它组织和器官只有低本底辐射，因此，它们被优先用于动脉硬化的非侵入诊断。
本发明特别优选的通式I化合物是Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp和N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp。
本发明特别优选的配合物是Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物和N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物。
还发现，本发明通式I的放射性标记的金属配合物极为强有力地集中在血管动脉硬化损伤部位，因此达到足以显示给闪烁相机或核医学中常用的其它适当仪器的浓度。另外，还惊奇的发现本发明所用物质在体内很快达到该浓度，而且结合如此之稳定，甚至当结合到受体的过量物质被除去和消除之后也有高且充足的浓度用于诊断。而且，令人惊奇的是富集优先发生于通过各种方法改变的要诊断的动脉壁区域，即使内皮素本身在所有血管部位都有效。
本发明所用的物质还具有其它优点，与许多其它物质和试验物质形成鲜明对照，它们在其它组织和器官中并不额外和非特异性地集中，这对作为诊断剂的适应性具有决定作用。
图1和2表示本发明化合物在体内的富集情况。
图1显示了WHHL-兔(A)和新西兰对比兔(B)被静脉内注射74MBq Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物(参见实施例3c)0.5小时之后左侧的闪烁图。在WHHL-兔(A)的体内主动脉弓区，左颈动脉(a.carotis)和腹部主动脉区的富集活性相对于对照兔(B)是可以看见的。
图2显示了新西兰兔静脉内注射74MBq Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物(参见实施例2c)0.5小时之后的前面闪烁图(A)，四星期前借助Fogarty导管将该兔的右颈动脉剥露出来，以及静脉内注射5小时之后的解剖的胸主动脉、剥露的和未处理的颈动脉的自体放射照片(B1)和Sudan-III-染色图(B2)。B1和B2各解剖组织的顺序从左到右胸主动脉，剥露的右颈动脉和未处理的左颈动脉。动脉硬化严重的右颈动脉能够在体内探查到(A)。体外研究(B1和B2)证实了就剥露的右颈动脉与未处理的左颈动脉相比本发明化合物的较高和较多选择性积累之间的良好的相互关系。
本发明通式I化合物及其溶液极高程度地满足所引用的要求。它们既具有较高富集的病理组织区，又具有较好的对比性能，这是由于它们有较以前描述的血管疾病诊断剂更好的药物动力学。本发明新物质的高化学稳定性促进了它们的实际应用。
表1显示了本发明化合物在主动脉斑块和非斑块区的富集数(cpm/mm2)及富集因子(在主动脉组织斑块区和非斑块区的富集数之比)。通过耳静脉将74MBq(2mCi)本发明各化合物注射到WHHL-兔体内。腹膜(p.i.)注射5小时后将兔子杀死，并对取出的主动脉进行定量自体放射照相和Sudan-III-染色。如此测定的本发明各化合物在不同组织中的累积值列于表1。表1
形成配合物的残基K必须能以配位和/或共价键形式结合于各金属离子上。残基K也存在于本发明配合物中。
必须根据所要配合的金属离子及其电荷，氧化值和原子及离子半径来选择形成配合物的残基K，使得为实现本发明配合物而产生有效和足够的键。
优选的形成配合物的残基是4-羧乙基-苯基乙二醛-二-(N-甲硫基半卡巴腙)N-羟基琥珀酰亚胺酯，6-(4’-异氰硫基苄基)-3，3，9，9-四甲基-4，8-二氮杂十一烷-2，10-二酮-二肟，2-甲基-2-(4-异氰硫基苄基)-N，N’-丙烯-二-亚水杨基胺，2-甲基-2-(4-异氰硫基苄基)-N，N’-丙烯-二-[5-(磺基)亚水杨基胺，N，N’-双(2-巯基吡啶基)甲基]-2-甲基-2-(4-异氰硫基苄基)-1，3-丙二胺，S-苯甲酰硫代乙酰基甘氨酰甘氨酰甘氨酸，N，N’-双(苯甲酰基硫代乙酰基)-2，3-二氨基丙酸，N，N’-双(苯甲酰基硫代乙酰基)-3，4-二氨基丁酸，N，N’-双(苯甲酰基硫代乙酰基)-4，5-二氨基戊酸，N，N’-1，2-乙烯-二-基-双(2-巯基-1-羧基-乙胺)，Cys(Acm)GlyCys(Acm)GlyGlyArgGlyAspSer。
通式(I)化合物与金属离子形成的本发明配合物的制备是采用本领域普通技术人员已知的方法进行，其中，放射性金属离子以其高金属酸盐(permetallate)形式在还原剂和任意性可有可无的辅助配位体存在下，通过已知方法与通式(I)化合物反应。
优选的金属离子是高锝酸盐或高铼酸盐形式的99mTc或Re。
反应优选在室温下于水介质中进行。SH-保护基的去除是就地或根据本领域普通技术人员熟知的文献方法进行，例如，通过碱水解，还原性断裂等等(例如见”Protective Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene，John Wiley and Sons，1981)。
通式(I)化合物与金属离子形成的本发明配合物的制备也可以通过已知方法，用适当的放射性阳离子的适当盐或氧化物与通式(I)化合物反应而完成。(K)z-(L)y-(A1)aa-(A2)bb-(A3)cc-(A4)dd-(A5)ee-(A6)ff-(A7)gg-(A8)hh-(A9)jj-(A10)kk-(A11)ll-Ile-Ile-Trp (I).优选的放射性金属离子是例如Tc和Re的同位素。
具有通式IIA的螯合剂K是采用文献(参见EP 0 248 506)记载的已知方法制备的，即将二-，三-，四-，五-，或六肽的N-端氨基氯-乙酰基化，接着将所得N-氯乙酰基肽与硫代碳酸的碱金属盐转化而成。制备具有通式IIA的螯合剂K的另一种方法是按照文献(参见EP 0 248506)中的已知方法将相应的活化的(例如NHS-酯)和S-酰化的硫代乙酸衍生物或3-硫代丙酸衍生物与肽反应。相应的碳酸的活化反应是根据本领域普通技术人员熟知的方法进行，例如，根据碳化二亚胺方法(Fieser，Reagents for Organic Synthesis，10，142)，通过混合的或环状的酐(Org.Prep.Proc.Int.，1975，7，215)或通过活化酯(Adv.Org.Chem.Part B，472)来实现。
具有通式IIB的螯合剂K是采用文献(参见EP 0 248 506)记载的已知方法制备的，即将1，2-二氨基丙酸或1，3-二氨基丁酸的游离氨基氯-乙酰基化，接着将所得N，N’-二氯乙酰基-二氨基碳酸与硫代碳酸的碱金属盐转化而成。制备具有通式IIB的螯合剂K的另一种方法是按照文献(参见EP 0 248 506)中的已知方法将相应的活化的(例如NHS-酯)和S-酰化的硫代乙酸衍生物或3-硫代丙酸衍生物与1，2-二氨基丙酸或1，3-二氨基丁酸反应。相应的碳酸的活化反应是根据本领域普通技术人员熟知的方法进行，例如，根据碳化二亚胺方法(Fieser，Reagentsfor Organic Synthesis，10，142)，通过混合的或环状的酐(Org.Prep.Proc.Int.，1975，7，215)或通过活化酯(Adv.Org.Chem.Part B，472)来实现。
具有通式IIE的螯合剂K是采用文献(欧洲专利申请EP 0 306 168)中所述已知方法制备的，即将取代的1，2-二羰基化合物用硫代氨基脲转化而成。
具有通式IIF的螯合剂K基本上是通过将取代或未取代的1，2-二酮基-或1，3-二酮基化合物用取代的，未取代的，保护的或未保护的氨基噻吩还原胺化来制备，如EP 279 417所述。
具有通式IIG的螯合剂K基本上是采用文献欧洲专利申请EP 0 417 870和EP 0 502 594所述的已知方法制备的，即通过2-取代的1，3-丙二胺与2-氯-2-烷基-3-硝基链烷的转化，或通过2-取代的1，3-丙二胺与1，3-二羰基一肟转化成相应的亚胺，再根据已知方法将该亚胺还原成相应的胺。
具有通式IIH的螯合剂K是采用文献(参见U.S.-PS 4,897,255)所述已知方法制备的，即将1，2-或1，3-二氨基链烷酸(见EP 0248 506)的游离氨基氯乙酰基化，接着将所得N，N’-二氯乙酰基-二氨基碳酸与硫代碳酸的碱金属盐转化而成。制备具有通式IIH的螯合剂K的另一种方法是采用文献(参见U.S.-PS 4,897,255)所述已知方法将相应的活化的(例如NHS-酯)和S-保护的硫代碳酸衍生物与1，2-或1，3-二氨基链烷酸反应。相应的碳酸的活化反应是根据本领域普通技术人员熟知的方法进行，例如，根据碳化二亚胺方法(Fieser，Reagents for OrganicSynthesis，10，142)，通过混合的或环状的酐(Org.Prep.Proc.Int.，1975，7，215)或通过活化酯(Adv.Org.Chem.Part B，472)来实现。
具有通式IIJ的螯合剂K基本上是采用文献所述已知方法制备的，即通过任意性可有可无另外的羧基或磺酸残基的2-取代的1，3-丙二胺和邻-取代的苯甲醛转化，接着将所得Schiff碱还原到相应胺，任选地去除保护基或通过任意性可有可无另外的羧基或磺酸残基的取代的丙二酰卤和邻-取代的苄胺转化，如在欧洲专利申请EP 0 417 870，EP 0 502 594和EP 0 502 595中所描述。
具有通式IIK的螯合剂K的制备是通过固相肽合成实现的(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85(1963)，2149)。该化合物是根据文献(例如，ThePractice of Peptide Synthesis，M.Bodanszky and A.Bodanszky；SpringerVerlag(1984)and Fieser，Reagents for Organic Synthesis，10，142)所述的肽合成方法进行化学合成的。这里，N-保护的α-，β-或γ-氨基酸与活化的碳酸化合物(例如，酰氯，混合酐，活化酯)根据本领域普通技术人员熟知的方法在N-保护的树脂粘结的氨基酸上偶合，例如，通过伯或仲胺的加成/消除反应进行。根据文献(Solid Phase Peptide Synthesis，APractical Approach；E.Atherton and R.C.Sheppard；Oxford UniversityPress；Oxford，New York，Tokyo)所述的已知方法，消除氨基保护基之后，剩下的氨基官能基重新根据文献中所述的已知方法在第二个反应中用N-保护的α-，β-或γ-氨基酸衍生。氨基保护基的消除再次使用已知方法完成。作为N-保护的氨基酸，优选采用FMOC-保护的衍生物。在树脂上构成肽之后从树脂上分离制成的肽，而且，例如经过制备性HPLC纯化(参见上述Solid Phase Peptide Synthesis)。
金属硫堇(thionine)的半胱氨酸富集的氨基酸序列的制备是以相似的方式进行的(参见专利申请WO 91/17173)。
具有通式IIL的螯合剂K的制备是根据已知方法实现的。
优选的制备性变体的特征在于通式XX的环状酐
其中Ra，Rb，Rc和Rd定义如上，与下面通式化合物的反应，(A1)aa-(A2)bb-(A3)cc-(A4)dd-(A5)ee-(A6)ff-(A7)gg-(A8)hh-(A9)jj-(A10)kk-(A11)ll-Ile-Ile-Trp其中N-端氨基酸代表下列通式的残基，
本发明更进一步的主题是本发明通式I化合物以及它们与原子序数为21-32，37-39，42-51及57-83的金属离子形成的配合物的制备方法，其特征在于具有通式II的化合物(A1)aa-(A2)bb-(A3)cc-(A4)dd-(A5)ee-(A6)ff-(A7)gg-(A8)hh-(A9)jj-(A10)kk-(A11)ll-Ile-Ile-Trp (II)其中A1-A11，aa，bb，cc，dd，ee，ff，gg，hh，jj，kk和ll定义如上，任意地根据已知方法与具有通式III的化合物反应，
(K)z-(L)y-HIII其中K，L，z和y定义如上，并且根据已知方法任意地分别与高金属酸盐形式的放射性金属离子在还原剂和任选地可有可无的辅助配位体存在下反应，或与放射性阳离子的盐或氧化物反应。
本发明还提供了诊断试剂，其特征在于它们含有通式(I)化合物与原子序数为21-32，37-39，42-51及57-83的金属离子形成的配合物。通过适当选择金属离子可使该试剂适用于各种诊断方法。
在本发明试剂是为用于放射性诊断而设计的情况下，配合物盐的中心离子必须是放射性的，特别是原子序数为27，29，30-32，37-39，42-51，62，64，70，75和77的元素的离子。优选同位素99mTc，186Re和111In。
本发明的主题还包括制备本发明诊断试剂的方法。
本发明放射性药剂的制备是根据已知方法进行的，即将本发明通式I的配合试剂及其共轭物——任选添加药物技术中常用的添加剂——溶解或悬浮于水介质中，然后将该溶液或悬浮液任选冻干或灭菌。适当的添加剂有，例如，生理安全的缓冲剂(例如，缓血酸胺)，辅助配位体添加剂(例如，柠檬酸钠或酒石酸钠)，还原剂(例如，氯化锡(II))，或者，如果需要，电解质如氯化钠，或者，如果需要，一种或多种常用药物助剂(例如，乳糖，甲基纤维素，甘露糖醇)，和/或表面活性剂(例如，卵磷脂，Tween，Myrj)。所用的添加剂就其组成而言必须能制成本发明化合物。
在体内核医学应用中，本发明试剂的剂量范围为1×10-5-5×104nmol/kg体重，优选1×10-3-5×102nmol/kg体重。以平均体重为70kg为例，则每次使用诊断试剂的放射性活性为0.05-50mCi，优选5-30mCi。
使用通常是采用静脉内，动脉内或腹膜注射0.1-5ml本发明试剂溶液。优选采用静脉内注射。此类使用和剂量的详细情况在例如“Radiotracers for Medical Applications”，CRC-Press，Boca Raton，Florida中有所描述。本发明化合物以其与原子序数为27，29，30-32，37-39，42-51，62，64，70，75和77的元素的放射性同位素形成的配合物形式用于放射性诊断和放射性治疗。
本发明放射性药剂满足用于放射性诊断和放射性治疗的放射性药物的各种要求。因此，静脉注射后，它们显然适于目标组织的富集，并使相应组织的非侵入式诊断成为可能。如果需要，通过如上所述药物学技术中普通辅助剂使本发明放射性药剂为水溶性得以保证。
另外，本发明放射性药剂不仅在体外表现出高稳定性，在体内也表现出高稳定性，因而结合于该配合物上的放射性核素(radionucleide)不发生释放或交换现象，或只以临床上不相关的程度发生。
本发明药剂的制备也通过已知方法进行，即在添加还原剂——优选锡(II)盐如氯化物或酒石酸盐——和任选添加药物学技术中常用的添加剂条件下，将本发明配位剂溶解于水介质中，然后无菌过滤。适当的添加剂有例如生理安全的缓冲剂(例如，缓血酸胺)，少量电解质添加剂(例如，氯化钠)，稳定剂(例如，葡糖酸盐，磷酸盐或膦酸盐)。本发明药剂以溶液或冻干的形式存在，在临使用前将之加到例如从商用发生器中洗脱的Tc-99m-高锝酸盐溶液或高铼酸盐溶液中。
本发明是用Cold Kit制备放射性药剂。该Cold Kit含有溶液形式的，干燥形式的或冻干形式的本发明通式(I)化合物，还原剂，并任选一种或多种辅助配位体。该Cold Kit还包括一个进行反应调节的指令系统，所说反应指本发明通式(I)化合物与放射性金属离子的高金属酸盐转化形成通式(I)化合物和金属离子的本发明配合物。
实施装置Cold Kit也是本发明一个目的。Cold Kit由能够关闭的容器组成，它显示预定量的内皮素，内皮素衍生物，内皮素部分序列，内皮素类似物和内皮素拮抗剂结合于能够结合金属离子的肽，衍生物或螯合剂上，而且含有足够量的还原剂以便用99mTc标识化合物，并且用于放射性药剂的制备。
本发明还一个主题是血管病理变化的图解表示方法，其特征在于由通式(I)化合物与原子序数为21-32，37-39，42-51和57-83的金属离子形成的配合物用作对比剂。
在用于实施放射性诊断研究的方法中，放射性药物组合物的用量为每70kg患者体重0.1-30mCi，优选0.5-10mCi，并记录患者发出的放射性。
下面的实施例用以说明本发明。实施例1a)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成根据Barany和Marrifield，The PeptidesAnalysis，Biology，AcademicPress，New York，1980；Stewart和Young，Solid-Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984所述方法制备Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp。分子量计算值 1288.4，实测值 1288(FAB-MS)。b)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的99mTc配合物往在300μL磷酸盐缓冲液(Na2HPO4，0.5mol/L，pH8.5)中的0.5mgAsp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp中加入50μL 0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液和2.5μL 0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液。将由Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)加到反应混合物中，然后在室温培养10分钟。通过HPLC进行标记分析。c)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的99mTc配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况通过耳静脉将2mCi(1ml)类似于b)的标记过的Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp用于麻醉的WHHL-兔(Rompun/Ketavet 12)。WHHL-兔因在血液中损失或缺陷LDL受体而显示出高LDL水平，因此表现出自发的血管动脉硬化变化。在施药之后的5小时实验中各种曝光时间和位置的静态照片用γ相机(Elcint SP4HR)拍摄下来。施药5小时后将兔子杀死，然后进行主动脉自体放射照相和Sudan III染色。用10分钟体内腹膜(p.i.)可对WHHL-兔主动脉弓区域内的动脉硬化斑块进行绘图。接下来进行的自体放射照相标记出全部主动脉壁，以及动脉硬化斑块。正常和动脉硬化壁区之间的富集因子是6-9，这取决于斑块的形成(Sudan III染色)。实验结果汇总于表1。实施例2a)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成根据Barany和Marrifield，The PeptidesAnalysis，Biology，AcademicPress，New York，1980；Stewart和Young，Solid-Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984所述方法制备Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp。分子量计算值 1337.5，实测值 1337(FAB-MS)。b)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的99mTc配合物往在300μL磷酸盐缓冲液(Na2HPO4，0.5mol/L，pH8.5)中的0.5mgAsp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp中加入50μL 0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液和2.5μL 0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液。将由Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)加到反应混合物中，然后在室温培养10分钟。通过HPLC进行标记分析。c)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的99mTc配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的99mTc配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。实施例3a)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成根据Barany和Marrifield，The PeptidesAnalysis，Biology，AcademicPress，New York，1980；Stewart和Young，Solid-Phase Peptide Synthesis，第二版，Pjerce Chemical Co.，Rockford，IL，1984所述方法制备Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp。分子量计算值 1484.68，实测值 1484(FAB-MS)。b)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的99mTc配合物往在300μL磷酸盐缓冲液(Na2HPO4，0.5mol/L，pH8.5)中的0.5mgAsp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp中加入50μL0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液和2.5μL 0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液。将由Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)加到反应混合物中，然后在室温培养10分钟。通过HPLC进行标记分析。c)Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc- 99m配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc- 999m配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。实施例4a)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成在氩气氛下将109.5mg(0.1mmol)NH2-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp(根据E.Atherton，R.C.Sheppard，Solid phase peptide synthesis，Oxford university press，Oxford，New York，Tokyo所述制备的)溶解于3ml无水二甲基甲酰胺中，同时加入30.36mg(0.3mmol)三乙胺。在0℃加入13.21mg(0.1mmol)环硫二乙酸酐，然后将溶液在0℃搅拌2小时，在室温搅拌过夜。通过添加10ml无水乙醚使粗肽沉淀，然后经过硅胶RP-18进行色谱纯化(洗脱剂水/0.1％三氟乙酸，乙腈/0.1％三氟乙酸，线性梯度)。冻干后得到白色粉末。产量48.5mg(39.5％Th.)，白色粉末。分子量计算值 1227.4438，实测值 1227(FAB-MS)。b)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物将1mg实施例4a)所述的肽共轭物HOOC-CH2-S-CH2-CONH-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp溶解于500μL磷酸氢二钠缓冲液(0.01mol/L，pH8.5)，并加入50μL 0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液。添加从Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)后再加入5μL 0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液，并将反应混合物在室温培养10分钟。通过HPLC分析测定标记产率，结果大于95％。c)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。实施例5a)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成在氩气氛下将94.8mg(0.1mmol)NH2-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp(根据E.Atherton，R.C.Sheppard，Solid phase peptide synthesis，Oxford university press，Oxford，New York，Tokyo所述制备的)溶解于3ml无水二甲基甲酰胺中，同时加入30.36mg(0.3mmol)三乙胺。在0℃加入13.21mg(0.1mmol)环硫二乙酸酐，然后将溶液在0℃搅拌2小时，在室温搅拌过夜。通过添加10ml无水乙醚使粗肽沉淀，然后经过硅胶RP-18进行色谱纯化(洗脱剂水/0.1％三氟乙酸，乙腈/0.1％三氟乙酸，线性梯度)。冻干后得到白色粉末。产量39.3mg(36.4％Th.)，白色粉末。分子量计算值 1080.2738，实测值 1080(FAB-MS)。b)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物将1mg实施例5a)所述的肽共轭物HOOC-CH2-S-CH2-CONH-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp溶解于500μL磷酸氢二钠缓冲液(0.01mol/L，pH8.5)，并加入50μL 0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液。添加从Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)后再加入5μL 0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液，并将反应混合物在室温培养10分钟。通过HPLC分析测定标记产率，结果大于95％。c)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。实施例6a)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成在氩气氛下将89.9mg(0.1mmol)NH2-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp(根据E.Atherton，R.C.Sheppard，Solid phase peptide synthesis，Oxforduniversity press，Oxford，New York，Tokyo所述制备的)溶解于3ml无水二甲基甲酰胺中，同时加入30.36mg(0.3mmol)三乙胺。在0℃加入13.21mg(0.1mmol)环硫二乙酸酐，然后将溶液在0℃搅拌2小时，在室温搅拌过夜。通过添加10ml无水乙醚使粗肽沉淀，然后经过硅胶RP-18进行色谱纯化(洗脱剂水/0.1％三氟乙酸，乙腈/0.1％三氟乙酸，线性梯度)。冻干后得到白色粉末。产量26.9mg(26.1％Th.)，白色粉末。分子量计算值 1031.2038，实测值 1031(FAB-MS)。b)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物将1mg实施例6a)所述的肽共轭物HOOC-CH2-S-CH2-CONH-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp溶解于500μL磷酸氢二钠缓冲液(0.01mol/L，pH8.5)，并加入50μL 0.15浓度的摩尔柠檬酸三钠二水合物溶液。添加从Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)后再加入5μL0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液，并将反应混合物在室温培养10分钟。通过HPLC分析测定标记产率，结果大于95％。c)N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。实施例7a)N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成在氩气氛下将122.1mg(0.1mmol)NH2-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (根据E.Atherton，R.C.Sheppard，Solid phasepeptide synthesis，Oxford university press，Oxford，New York，Tokyo所述制备的)溶解于3ml无水二甲基甲酰胺中，同时加入40.48mg(0.4mmol)三乙胺。在0℃加入S-三苯甲基-巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯在3mL无水二甲基甲酰胺中的溶液[制备方法将36.79mg(0.11mmol)S-三苯甲基-巯基乙酸溶解于2mL无水二甲基甲酰胺，同时加入12.66mg(0.11mmol)N-羟基琥珀酰亚胺。加入22.70mg(0.11mmol)二环己基碳化二亚胺在1mL无水二甲基甲酰胺中的溶液，并培养30分钟。过滤后当场制备的S-三苯甲基-巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液可用于偶合。]然后在0℃搅拌2小时，在室温搅拌过夜。通过添加20ml无水乙醚，并在氩气和5mL三氟乙酸/5％水/22mg三丁基硅烷混合物中搅拌10分钟，使粗肽沉淀。将没有保护基的粗肽用25mL无水乙醚沉淀而分离，然后经过硅胶RP-18进行色谱纯化(洗脱剂水/0.1％三氟乙酸，乙腈/0.1％三氟乙酸，线性梯度)。冻干后得到白色粉末。产量56.3mg(43.4％Th.)，白色粉末。分子量计算值 1296.4551，实测值 1296(FAB-MS)。b)N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc -99m配合物将1mg实施例7a)所述的肽共轭物HS-CH2-CONH-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp溶解于500μL磷酸氢二钠缓冲液(0.01mol/L，pH8.5)，并加入50μL 0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液。添加从Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)后再加入5μL 0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液，并将反应混合物在室温培养10分钟。通过HPLC分析测定标记产率，结果大于95％。c)N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc -99m配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc -99m配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。实施例8a)N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的合成在氩气氛下将107.4mg(0.1mmol)NH2-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp(根据E.Atherton，R.C.Sheppard，Solid phase peptidesynthesis，Oxford university press，Oxford，New York，Tokyo所述制备的)溶解于3ml无水二甲基甲酰胺中，同时加入40.48mg(0.4mmol)三乙胺。在0℃加入S-三苯甲基-巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯在3mL无水二甲基甲酰胺中的溶液[制备方法将36.79mg(0.11mmol)S-三苯甲基-巯基乙酸溶解于2mL无水二甲基甲酰胺，同时加入12.66mg(0.11mmol)N-羟基琥珀酰亚胺。加入22.70mg(0.11mmol)二环己基碳化二亚胺在1mL无水二甲基甲酰胺中的溶液，并培养30分钟。过滤后当场制备的S-三苯甲基-巯基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液可用于偶合。]然后在0℃搅拌2小时，在室温搅拌过夜。通过添加20ml无水乙醚，并在氩气和5mL三氟乙酸/5％水/22mg三丁基硅烷混合物中搅拌10分钟，使粗肽沉淀。通过用25mL无水乙醚沉淀得到没有保护基的粗肽，然后经过硅胶RP-18进行色谱纯化(洗脱剂水/0.1％三氟乙酸，乙腈/0.1％三氟乙酸，线性梯度)。冻干后得到白色粉末。产量46.3mg(40.3％Th.)，白色粉末。分子量计算值 1049.2851，实测值 1049(FAB-MS)。b)N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc- 99m配合物将1mg实施例8a)所述的肽共轭物HS-CH2-CONH-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp溶解于500μL磷酸氢二钠缓冲液(0.01mol/L，pH8.5)，并加入50μL 0.15摩尔浓度的柠檬酸三钠二水合物溶液。添加从Mo-99/Tc-99m发生器出来的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)后再加入5μL0.2摩尔浓度的氯化锡(II)二水合物溶液，并将反应混合物在室温培养10分钟。通过HPLC分析测定标记产率，结果大于97％。c)N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc- 99m配合物在WHHL-兔体内和体外的富集情况N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc- 99m配合物在WHHL-兔体内和体外富集情况的测定按实施例1c)所述进行。其结果汇总于表1。
图1显示了WHHL-兔(A)和新西兰对比兔(B)被静脉内注射74MBq Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物(参见实施例3c)0.5小时之后左侧的闪烁图。与对照兔(B)对比可观察到WHHL-兔(A)的体内主动脉弓区，左颈动脉和腹部主动脉区的富集活性。
图2显示了新西兰兔静脉内注射74MBq Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物0.5小时之后的前面闪烁图(A)，四星期前借助Fogarty导管将该兔的右颈动脉剥露出来，以及静脉注射内5小时之后的露出的胸主动脉及剥露和未处理的颈动脉的自体放射照片(B1)和Sudan-III-染色图(B2)(参见实施例3c)。B1和B2各解剖组织的顺序从左到右胸主动脉，剥露的右颈动脉和未处理的左颈动脉。
动脉硬化严重的右颈动脉能够在体内探查到(A)。体外研究(B)证实就剥露的右颈动脉与未处理的左颈动脉相比放射性药物的较高和较多选择性积累之间的良好的相互关系。
权利要求
1.通式I化合物，(K)z-(L)y-(A1)aa-(A2)bb-(A3)cc-(A4)dd-(A5)ee-(A6)ff-(A7)gg-(A8)hh-(A9)jj-(A10)kk-(A11)11-Ile-Ile-Trp (I)其中aa，bb，cc，dd，ee，ff，gg，hh，jj，kk和ll彼此独立地代表整数0，1或2，y和z彼此独立地代表整数0或1，K表示通式IIA或IIB的形成螯合物的残基，
其中T是氢原子或在金属原子上的键或适当的硫保护基团，如碱金属离子，C1-6-酰基残基，苯甲酰基残基，羟基乙酰基残基，乙酰氨基甲基残基，对甲氧基苄基残基，乙氧乙基残基，苄基残基，邻-或对-羟基苄基残基，邻-或对-乙酰氧基苄基残基，对硝基苄基残基，4-吡啶甲基残基，2-吡啶甲基-N-氧化物残基，9-蒽基甲基残基，9-芴基残基，二茂铁基甲基残基，二苯甲基残基，双(4-甲氧基苯基)甲基残基，二苯并环庚基残基，三苯甲基残基，二苯基-4-吡啶基甲基残基，苯基残基，2，4-二硝基苯基残基，叔丁基残基，1-金刚烷基残基，甲氧基甲基残基，异丁氧基甲基残基，2-四氢吡喃基残基，苄硫基甲基残基，苯硫甲基残基，三甲基乙酰氨基甲基残基，苯甲酰氨基甲基残基，乙酰基甲基残基，羧甲基残基，氰基甲基残基，2-硝基-1-苯乙基残基，2-(4’-吡啶基)乙基残基，2-氰基乙基残基，2，2-双(乙酯基)乙基残基，1-间硝基苯基-2-苯甲酰基乙基残基，2-苯基磺酰基乙基残基，1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-甲基丙-2-基残基，甲硅烷基残基，N-{[(对-联苯基)异丙氧基]羰基}-N-甲基-γ-氨基丁酸酯残基，N-(叔丁氧羰基)-N-甲基-γ-氨基丁酸酯残基，2，2，2-三氯乙氧基羰基残基，叔丁氧羰基残基，苄氧羰基残基，对甲氧基苄氧羰基残基，N-乙基残基，N-甲氧基甲基残基，S-乙基残基，叔-S-丁基残基，取代的S-苯基残基，磺酸酯残基，亚磺酰硫代碳酸酯残基或3-硝基-2-吡啶亚磺酰基残基，或者两个T残基与它们连接的S原子一起形成分子间或分子内二硫化物的桥，R4代表式IIC或IID的残基，* *
其中*标示的碳原子与式IIB的亚氨基相连，和n’代表整数1或2，i为数字2-6，及TT为α-氨基酸残基，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，4-羟基脯氨酸，5-羟基赖氨酸，鸟氨酸，肌氨酸或牛磺酸和/或它们的同系β-氨基酸，它们以常规方式键于酰胺基团上，以及式IIE的形成螯合物的残基，
其中R6代表氢或C1-6烷基残基，和式IIF的形成螯合物的残基，
其中R7-R18残基此独立地代表氢原子，C1-10烷基链和/或L上的键，o，p和r分别代表整数1或2，T定义如上，和式IIG的形成螯合物的残基，
其中R19-R24彼此相同或不同，分别独立地代表氢原子，或C1-4烷基残基，m’代表整数2或3，和式IIH的形成螯合物的残基，
其中X1代表一根键，亚甲基或CHY4基团，Y1，Y2，Y3或Y4基团之一代表键于L的键，其余的表示氢或任选地代表氧原子，T定义如上，及A1，A2，A3和A4相同或不同，且彼此独立地代表氢或C1-6烷基残基，和式IIJ的形成螯合物的残基，
其中R27代表氢原子或任选代表被一或两个羟基取代的C1-6烷基残基，R25和R26分别代表氢原子或一起代表氧原子，A是羟基或巯基，Y是氢原子，羧基或磺酰基残基，及Z是碳原子或氮原子，和式IIK的形成螯合物的残基，(AA1)mm-(AA2)nn-(AA3)oo-(AA4)pp-(AA5)qq-(AA6)rr(IIK)其中mm，nn，oo，pp，qq和rr彼此独立地代表整数0，1或2，AA1-AA6彼此独立地代表α-氨基酸的残基，如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，它们在硫上任选带有上述定义的T基团，但不是氢原子，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，4-羟基脯氨酸，5-羟基赖氨酸，鸟氨酸，肌氨酸或牛磺酸和/或它们的同系β-氨基酸，它们以常规方式键于酰胺基团上，而且，任选地每两个存在的半胱氨酸残基彼此相连形成一个胱氨酸残基，和式IIL的形成螯合物的残基，
其中Ra，Rb，Rc，Rd，Rf，Rg和Rh彼此相同或不同，分别代表氢原子和/或支链或非支链C1-C6烷基残基，Re表示羧基或非支链，支链，环状或多环C1-C60烷基，链烯基，多链烯基，炔基(alkjnyl)，多炔基，芳基，烷芳基或芳烷基残基，它们可任选被羟基，氧基，氧代，羧基，氨基羰基，烷氧基羰基，氨基，醛基或有至多20个碳原子的烷氧基取代，和/或任选被一或多个选自O，N，S，P，As，Se系列的杂原子间隔和/或取代，T定义如上，L代表一根键或氢原子或非支链，支链，环状或多环C1-C60烷基，链烯基，多链烯基，炔基，多炔基，芳基，烷芳基或芳烷基残基，它们可任选被一个或多个羟基，巯基，烷硫基，氧基，氧代，羧基，氨基羰基，烷氧基羰基，氨基，醛基或有至多20个碳原子的烷氧基取代，和/或任选被一或多个选自O，N，S，P，As，Se系列的杂原子间隔和/或取代，或表示Z1-R-Z2残基，其中R代表直链，支链，饱和或不饱和C1-20烷基残基，它们可以任选被一或多个氧原子和/或硫原子和/或羰基，-NHCO-，-N(C1-6烷基)CO-，-NH-和-N(C1-6烷基)残基间隔，以及任选被羟基和/或环氧基团取代，Z1和Z2彼此独立地分别代表-O-，-S-，-(C＝O)O-，-NH(C＝S)NH-，-(C＝O)-和-NH(C＝S)-基团，或代表式α的残基，
其中s和t彼此独立地代表整数0，1，2或3，环B表示苯基或环己基残基，Z1和Z2定义如上，A1-A11彼此独立地代表L-α-或D-α-氨基酸残基，-NH-CH(Z)-CO-残基，其中Z指H-，CH3-，(CH3)2CH-，(CH3)2CH-CH2-，CH3-CH2-CH(CH3)-，CH3-S-(CH2)2-，HOOC-CH2-，HOOC-(CH2)2-，H2N-(CH2)3-，H2N-C(＝NH)-(CH2)3-，HO-CH2-，CH3-CH(OH)-，HS-CH2-，HS-(CH2)2-，H2N-CO-CH2-，H2N-CO-(CH2)2-，(HOOC)2CH-CH2-，
其中n为整数0，1或2，或残基 或牛磺酸残基，以及它们与原子序数为21-32，37-39，42-51和57-83的金属离子形成的配合物及其水溶性盐。
2.根据权利要求1的化合物，即Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-lle-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物，及N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp的Tc-99m-配合物。
3.根据权利要求1的化合物，即Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(4-羟基羧基-1-氧代-3-硫杂-丁-1-基)-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-Phe-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，及N-(巯基乙酰基)-Gly-Gly-Asp-(D-Trp)-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp。
4.制备权利要求1化合物的方法，其特征在于通式II化合物(A1)aa-(A2)bb-(A3)cc-(A4)dd-(A5)ee-(A6)ff-(A7)gg-(A8)hh-(A9)jj-(A10)kk-(A11)ll-Ile-Ile-Trp (II)其中A1-A11，aa，bb，cc，dd，ee，ff，gg，hh，jj，kk和ll如权利要求1所定义，根据已知方法与具有通式III的化合物反应，(K)z-(L)y-HIII其中K，L，z和y如权利要求1所定义，并且根据已知方法任意地分别与高金属酸盐形式的放射性金属离子在还原剂和任选地可有可无的辅助配位体存在下反应，或与放射性阳离子的盐或氧化物反应。
5.一种诊断试剂，其特征在于它含有权利要求1-3之一的化合物和任意含有适当的辅助剂和赋形剂。
全文摘要
本发明涉及用于血管疾病诊断的新配位化合物，它们的制备方法，以及含有这些化合物的诊断试剂。这些化合物高度集中在动脉硬化斑块上，因此可用于动脉硬化的非侵入式诊断。
文档编号C07K14/575GK1158621SQ95194122
公开日1997年9月3日 申请日期1995年6月21日 优先权日1994年7月13日
发明者L·狄克尔伯格, C·S·海格尔, W·塞米勒, U·斯皮克, P·亨克雷恩 申请人:柏林弗赖恩大学诊断研究学院有限公司