G蛋白偶联受体蛋白质及其产生方法和用途的制作方法

专利名称：G蛋白偶联受体蛋白质及其产生方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为聚合酶链反应(PCR)的DNA引物有用的新DNA；用所述DNA引物经PCR扩增各种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法；用所述DNA引物经PCR筛选各种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法；由所说筛选方法获得的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA；由经所说的筛选方法获得的DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质、其肽片段或区段和其修饰的肽衍生物；等等。
本发明也涉及新的G蛋白偶联受体蛋白质；编码新的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA；产生所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法；所说受体蛋白质和编码所说蛋白质之DNA的用途；等等。
本发明也涉及源于人扁桃体(amygdaloid nucleus)的新G蛋白偶联受体蛋白质；编码所说G蛋白偶联受体蛋白质的各种新DNA；产生所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法；所说受体蛋白质和编码所说蛋白质之DNA的用途；等等。
本发明也涉及源于小鼠胰腺β细胞系MIN6的新G蛋白偶联受体蛋白质；编码所说G蛋白偶联受体蛋白质的各种新DNA；产生所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法；所说受体蛋白质和编码所说蛋白质之DNA的用途；等等。
本发明还涉及源于人的新G蛋白偶联受体蛋白质(人prinoceptor)；编码所说G蛋白偶联受体蛋白质的各种新DNA；产生所说G蛋白偶联受体蛋白质G蛋白偶联受体蛋白质方法；所说受体蛋白质和编码所说蛋白质之DNA的用途；等等。
背景技术：
各种激素、神经递质等经位于细胞膜中的特异性受体控制或调节活体功能。许多这样的受体通过激活鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质(此后有时称作G蛋白质)(受体由此偶联)介导细胞内信号，并具有相同的(同源的)结构，即7个转膜(跨膜)区。因此，这些受体统称为G蛋白质偶联受体或7转膜(跨膜)受体。
G蛋白偶联受体蛋白质作为分子(例如如激素、神经递质和生理活性物质)靶具有很重要的作用，所述分子控制或调节活体功能。各种分子具有其自身的对其特异性的受体蛋白质，由此决定单个生理活性物质的特异性、包括特异性靶细胞和器官、特异性药理作用、特异性作用强度、作用时间等。因此，人们相信，可以克隆G蛋白偶联受体蛋白质基因或cDNA，其不仅有助于弄清G蛋白质偶联受体的结构、功能、药理作用等，而且有助于经研究作用在受体上的物质开发药物。迄今仅已克隆几个G蛋白质偶联受体基因或cDNA，但人们相信，还有许多尚未识别的未知G蛋白质偶联受体基因。
迄今已经知道的G蛋白偶联受体蛋白质的特征性特点是7簇疏水氨基酸残基位于一级结构中并在其各自的区穿过(跨越)细胞膜。已知这种结构在所有已知G蛋白偶联受体蛋白质中是普遍的，而且在受体中相应于蛋白质穿过膜的区(跨膜区或转膜区)的氨基酸序列和接近跨膜区的氨基酸序列常常是高度保守的。当未知蛋白质具有这种结构时，就有力地说明所说蛋白质属于G蛋白偶联受体蛋白质类别。此外，作为一个特征性特点，某些氨基酸残基排列是相同的(同源的)，也说明所说蛋白质是G蛋白偶联受体蛋白质。
Libert等(科学，244569-571；1989)报道了一种经合成DNA引物聚合酶链反应(此后有时称作PCR或PCR技术)克隆新受体基因的方法，所说DNA引物是基于从已知G蛋白偶联受体蛋白质之间的比较获得的共同氨基酸序列的信息合成的。Libert等使用一对相应于第三和第六跨膜区部分的合成DNA引物。然而，一般来说，用于PCR扩增的引物的设计随待扩增的DNA分子类别变化。此外，当以氨基酸序列水平上的类似性(同源性)为基础时，采用不同的密码子影响引物的结合(杂交)，从而引起扩增效率的降低。因此，尽管用所说DNA引物已获得各种新的受体蛋白质DNA，但是成功地扩增现有技术中所有受体蛋白质DNA是不可能的。
此外，Willsam C.Probst等(DNA和细胞生物学，Vol.11，No.1，1992，pp.1-20)报道了相同于74种G蛋白偶联受体蛋白质中第一到第七跨膜区的氨基酸序列。然而，在这篇报道中，没有指出用互补于编码那些氨基酸序列的DNA的DNA引物经PCR筛选新的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法。
采用G蛋白偶联受体蛋白质共同(同源)序列和编码它的DNA开发PCR技术的DNA引物是合乎需要的，所说DNA引物使得可以选择性地和有效地筛选编码更接近全长G蛋白偶联受体蛋白质的区的DNA。
开发相应于第三和第六跨膜区的合成DNA引物也是合乎需要的，与一系列由Libert，F.等报道的相应于第三到第六跨膜区序列的合成DNA引物比较，所说引物在以更有选择性和更有效的方式筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA中有用。
G蛋白偶联受体蛋白质在研究控制活的生物体功能的物质以及将它们开发成药物中是重要的。可以经采用G蛋白偶联受体蛋白质和经进行受体结合实验并用胞内信息递质系统为指标对激动剂/拮抗剂的评价实验进行新药物候选化合物的寻找和开发。特别是在可以弄清新G蛋白偶联受体蛋白质的存在时，可以说明具有作用于其上的物质的存在。
如果可以有效地筛选和分离编码新G蛋白偶联受体蛋白质的新DNA，则进行具有完整编码区的DNA的分离、其表达系统的构建和起作用的配体的筛选就是可能的。
丘脑-垂体系统是一种控制或调节生物体功能的通道，其依赖于激素和神经递质与G蛋白质偶联受体的相互作用。在丘脑-垂体系统中，从垂体分泌垂体激素(后叶素)受丘脑激素(hypophysiotropic释放因子)的调节，靶细胞和器官的功能受释放到血液中的垂体激素调节。经这一系统调节对活体重要的功能，例如保持内环境稳定和控制生殖系统和单个器官的发育和生长。丘脑激素的代表性的例子包括TRH、LH-RH、CRF、GRF、生长抑素、galanin等。垂体激素的代表性例子包括TSH、ACTH、FSH、LH、催乳激素、生长激素、催产素、后叶加压素等。具体地说，依赖于丘脑激素和从靶内分泌腺分泌的外周激素，垂体激素的分泌按照阳性反馈机制或阴性反馈抑制机制被调节。存在于垂体中的各种受体蛋白质对调节丘脑-垂体系统起重要的作用。
这些激素、因子和受体广泛分布于脑中而不是仅存在于丘脑-垂体系统中是公知的。这一事实说明称作“丘脑激素”的物质在中枢神经系统中作为神经递质或神经调节物起作用。人们也认为这些物质甚至类似地分布在外周组织中起着重要的功能性作用。胰腺通过不仅分泌消化液而且分泌高血糖素和胰岛素在碳水化合物代谢中发挥重要作用。胰岛素从β细胞分泌，其分泌主要被葡萄糖促进。然而，已知存在于β细胞中的各种受体和胰岛素的分泌受各种因子控制，除了葡萄糖外，所说因子例如肽激素(galanin、生长抑素、胃抑制多肽、高血糖素、淀粉不溶素等)、糖(甘露糖)、氨基酸和神经递质。
由此，在垂体中和在胰腺中存在多种激素和神经递质的受体蛋白质。所说的受体蛋白质在调节所说的功能中起着重要的调节作用。然而，就galanin和淀粉不溶素而言，还没有报道有关其受体蛋白质DNA的任何发现。是否存在任何未知的受体蛋白质或受体蛋白质亚型也是未知的。
就调节垂体和胰腺功能的物质来说，存在在垂体和胰腺的各种功能性细胞表面上对所说物质特异性的受体蛋白质。所说垂体和胰腺是多种功能性细胞的缔合，单个物质的作用被功能性细胞中的其靶受体蛋白质的分布限制。因此，在许多情况下，一种物质表现出功能的很大的变化。为了弄清这种复合系统，有必要弄清起作用的物质和特异性受体蛋白质之间的关系。也有必要有效地筛选能够调节垂体和胰腺的受体蛋白质激动剂和拮抗剂以从研究和开发药物的角度弄清受体蛋白质基因的结构，并进一步在合适的表达系统中表达它们。
通过利用G蛋白偶联受体蛋白质表现出在氨基酸序列水平上其部分结构的同源性这一事实，近来已进行了依赖聚合酶链反应(此后简称为“PCR”)寻找编码新的受体蛋白质的DNA的实验。
在中枢神经系统中，许多受体蛋白质(例如LH-RH受体蛋白质、神经降压素受体蛋白质、阿片样物质受体蛋白质、CRF受体蛋白质、CRF受体蛋白质、生长抑素受体蛋白质、glanin受体蛋白质、TRH受体蛋白质等)是G蛋白偶联受体蛋白质，并且已弄清这些受体的配体在中枢神经系统中发挥着各种作用。
在免疫系统中，已知α-或β-化学促进的受体蛋白质MIPIα受体蛋白质、IL-8受体蛋白质、C5a受体蛋白质等是这样一些G蛋白偶联受体蛋白质，作为对调节活体功能起作用的免疫调节物质应答的受体蛋白质起作用。例如，IL-6在以上提到的中枢神经系统和免疫系统两者中起作用。IL-6既是β-细胞分化因子，又是与神经细胞增殖和分化相关的生物活性因子。
这些激素、因子和受体蛋白质广泛分布于外周组织中中而不是仅存在于中枢神经系统和免疫系统中并且分别发挥着重要的作用是公知的。这些受体蛋白质的激动剂和拮抗剂现在正作为各种有用的药物被开发。
就调节中枢神经系统和免疫系统功能的物质而言，存在在各种中枢神经系统和免疫系统的各种功能性细胞表面上对所说物质特异性的受体蛋白质。所说中枢神经系统和免疫系统是多种功能性细胞的缔合，单个物质的作用被功能性细胞中的其靶受体蛋白质的分布限制。因此，在许多情况下，一种物质表现出功能的很大的变化。而且，有许多因子在生理现象中发挥作用的例子。为了弄清这种复合系统，有必要弄清起作用的物质和特异性受体蛋白质之间的关系。
如上所述，G蛋白偶联受体蛋白质存在于活体细胞和器官表面，作为分子(例如激素、神经递质和生理活性物质)靶具有非常重要的作用，所说分子控制或调节活体细胞或器官的功能。
发明概述本发明的一个方面是提供作为聚合酶链反应(PCR)的DNA引物有用的新DNA；用所述DNA引物经PCR扩增各种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法；用所述DNA引物经PCR筛选各种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法；由所说筛选方法获得的DNA；由经所说的筛选方法获得的DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质、其肽片段或区段和其修饰的肽衍生物。
本发明的另一个目的是提供产生所说受体蛋白质的方法；能够表达所说受体蛋白质的转化体；从所说转化体获得的细胞膜组份；判定所说受体蛋白质配体的方法；筛选能够抑制所说配体与所说受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法；用于所说筛选方法的试剂盒；包含有效量的抑制化合物的药物组合物；抗所说受体蛋白质的抗体；使用所说受体蛋白质或所说抗体的免疫测定方法以及编码DNA。
本发明的另一个目的是提供在垂体腺和胰腺β细胞中表达的新的G蛋白偶联受体蛋白质；包含编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA；能够表达所说受体蛋白质的转化体；从所说转化体获得的细胞膜组份；判定所说受体蛋白质配体的方法；筛选能够抑制所说配体与所说受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法；用于所说筛选方法的试剂盒；包含有效量的抑制化合物的药物组合物；抗所说受体蛋白质的抗体；使用所说受体蛋白质或所说抗体的免疫测定方法以及所说受体蛋白质和编码DNA的用途。
本发明的另一个目的是提供源于人扁桃体的新的G蛋白偶联受体蛋白质；包含编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA；能够表达所说受体蛋白质的转化体；从所说转化体获得的细胞膜组份；判定所说受体蛋白质配体的方法；筛选能够抑制所说配体与所说受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法；用于所说筛选方法的试剂盒；包含有效量的抑制化合物的药物组合物；抗所说受体蛋白质的抗体；使用所说受体蛋白质或所说抗体的免疫测定方法以及所说受体蛋白质和编码DNA的用途。
本发明的另一个目的是提供源于小鼠胰腺β细胞系MIN6的新的G蛋白偶联受体蛋白质；包含编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA；能够表达所说受体蛋白质的转化体；从所说转化体获得的细胞膜组份；判定所说受体蛋白质配体的方法；筛选能够抑制所说配体与所说受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法；用于所说筛选方法的试剂盒；包含有效量的抑制化合物的药物组合物；抗所说受体蛋白质的抗体；使用所说受体蛋白质或所说抗体的免疫测定方法以及所说受体蛋白质和编码DNA的用途。
基于与编码各已知G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区或第六跨膜区之碱基序列的类似性(同源性)，本发明发明人成功地合成了新的DNA引物。值得特别注意的是还没有报道基于注意到与编码各已知G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区或第六跨膜区之碱基序列的类似性而合成的引物对。
接着，基于与编码各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三或第六跨膜区之碱基序列的类似性(同源性)，本发明发明人成功地合成了其它新的DNA引物。通过采用这些DNA引物经PCR，他们也意想不到地有效扩增了编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(DNA片段)。
基于与编码各已知G蛋白偶联受体蛋白质第二或第七跨膜区之碱基序列的类似性(同源性)、基于与编码各已知G蛋白偶联受体蛋白质第一或第三跨膜区之碱基序列的类似性(同源性)、基于与编码各已知G蛋白偶联受体蛋白质第二或第六跨膜区之碱基序列的类似性(同源性)，他们已进一步地成功地合成了新的DNA引物。通过采用这些DNA引物经PCR，他们还意想不到地有效扩增了编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(DNA片段)。
此外，经采用扩增的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(DNA片段)，本发明发明人已成功地有效克隆了编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之全长DNA。由此他们已发现，编码新的G蛋白偶联受体蛋白质之新DNA可被分离、确定特征或经采用所说DNA引物进行各种DNA的扩增和分析来制备。
更特别地是，本发明发明人已选择与相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第一和第六跨膜区之蛋白质相同的各氨基酸序列，并设计了编码同于(同源于)第一跨膜区氨基酸序列之DNA引物(SEQ ID NO1)和互补于编码同于(同源于)接近第六跨膜区的区域的氨基酸序列的核苷酸序列之DNA引物(SEQ ID NO2)。与报道的DNA引物(例如，由Libert等报道的一套相应于第三和第六跨膜区的合成DNA引物(SEQ ID NO60和SEQ ID NO61))比较，这些DNA引物具有不同的核苷酸序列，这样一些引物是新的和独一无二的。
特别地，为了在PCR中进行有效的延伸反应，这些引物的3’-末端区含有在许多受体蛋白质中相同的(同源的)核苷酸序列。即使在其它区，也利用核苷酸序列水平(碱基序列水平)的类似性(同源性)建立混合碱基
(核苷酸)部分，其中它们的核苷酸序列(碱基序列)在许多受体蛋白质DNA中有尽可能多的核苷酸(碱基)配对。然后，本发明发明人扩增了源于人脑扁桃体amygdala、人垂体、和大鼠脑的cDNA，获得如

图17所示的扩增产物，并且从这些产物获得了具有图18、图19、图20、图21、图22、图23、图27、图29、图34、图37、图40、图43或图46所示的序列的所述G蛋白偶联受体蛋白质cDNA。其中具有图22、图23、图27、图29、图34、图37、图40、图43或图46所示的序列的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA是新的。
本发明发明人也已选择了同于(同源于)各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三和第六跨膜区的氨基酸序列，并设计了编码同于(同源于)第三跨膜区r氨基酸序列之DNA引物(SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6和SEQ ID NO7)和互补于编码同于(同源于)接近第六跨膜区的部分的氨基酸序列的核苷酸序列之DNA引物(SEQ ID NO4、SEQ IDNO8和SEQ ID NO9)。与报道的DNA引物(例如，由Libert等报道的一套相应于第三和第六跨膜区的合成DNA引物(SEQ ID NO60和SEQID NO61))比较，这些DNA引物具有不同的核苷酸序列，这样一些引物是新的和独一无二的。本发明发明人用所说的DNA引物扩增源于兔幽门平滑肌的cDNA，获得了具有图49或图52所示序列的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA。这些cDNA是新的。
本发明发明人也已选择了同于(同源于)各已知G蛋白偶联受体蛋白质第二和第七跨膜区之氨基酸序列，并设计了编码同于(同源于)第二跨膜区的氨基酸序列之DNA引物(SEQ ID NO10)和互补于编码同于(同源于)接近第七跨膜区的部分的氨基酸序列的碱基序列之DNA引物(SEQID NO11)。与报道的DNA引物(例如，由Libert等报道的一套相应于第三和第六跨膜区的合成DNA引物(SEQ ID NO60和SEQ IDNO61))比较，这些DNA引物具有不同的核苷酸序列，这样一些引物是新的和独一无二的。本发明发明人用所说的DNA引物扩增源于兔幽门平滑肌的cDNA，获得了具有图55、图56、图72或图73所示序列的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA。这些cDNA是新的。
此外，本发明发明人也选择了同于(同源于)各已知G蛋白偶联受体蛋白质第一和第三跨膜区之氨基酸序列，并设计了编码同于(同源于)第一跨膜区的氨基酸序列之DNA引物(SEQ ID NO12)和互补于编码同于(同源于)接近第三跨膜区的部分的氨基酸序列的碱基序列之DNA引物(SEQID NO13)。此外，本发明发明人也选择了同于(同源于)各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三和第六跨膜区之氨基酸序列，并设计了编码同于(同源于)第三跨膜区的氨基酸序列之DNA引物(SEQ ID NO10和SEQ IDNO18)和互补于编码同于(同源于)接近第六跨膜区的部分的氨基酸序列的碱基序列之DNA引物(SEQ ID NO15和SEQ ID NO19)。此外，本发明发明人也选择了同于(同源于)各已知G蛋白偶联受体蛋白质第二和第六跨膜区之氨基酸序列，并设计了编码同于(同源于)第二跨膜区的氨基酸序列之DNA引物(SEQ ID NO16)和互补于编码同于(同源于)接近第六跨膜区的部分的氨基酸序列的碱基序列之DNA引物(SEQ IDNO17)。与报道的DNA引物(例如，由Libert等报道的一套相应于第三和第六跨膜区的合成DNA引物(SEQ ID NO60和SEQ ID NO61))比较，这些DNA引物具有不同的核苷酸序列，这样一些引物是新的和独一无二的。
本发明的另一个目的是提供在垂体和胰腺β细胞中表达的G蛋白偶联受体蛋白质、包含编码所述蛋白质之DNA的DNA、产生所说蛋白质的方法和所说蛋白质和所说DNA的用途。
为了达到上述目的，本发明发明人进行了广泛的研究。结果本发明发明人成功地扩增了源于人垂体和小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA，用有效分离编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成DNA引物，促进了分析。由此，本发明发明人成功地分离了新的源于人和小鼠的编码G蛋白质偶联受体蛋白质之cDNA；测定了其部分结构。本发明发明人认为这些cDNA序列在人和小鼠中保持的非常好，它们为相同配体的受体蛋白质编码。基于上述知识，本发明发明人发现，这些DNA使获得具有所说受体蛋白质全长开放读框(ORF)之cDNA并由此产生受体蛋白质成为可能。本发明发明人还发现当用合适的方法表达所述编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA时，获得的上述受体蛋白质使得可以在受体偶联试验或胞外第二信使测定等中可获得的数据的指导下，从活体或者从天然或非天然化合物筛选所述受体蛋白质之配体，从而使得可以筛选抑制所述配体与所述受体蛋白质结合的化合物。
在一个实施方案中，本发明发明人进行了新的图22和23所示的源于人垂体之DNA片段的PCR扩增，并亚克隆它们以获得质粒载体(p19P2)。经部分序列分析弄清了所述cDNA编码一种新的受体蛋白质。用于扩增cDNA的合成DNA引物相应于存在于已知G蛋白偶联受体蛋白质中共同的7个疏水簇，即相应于跨膜区中第一和第六跨膜区。已经测定引物5’侧(第一跨膜区侧)之核苷酸序列(SEQ ID NO29)，并翻译成氨基酸序列(SEQ ID NO24)〔图22〕。结果在疏水性图上确定了第二和第三跨膜区〔图58〕。类似地，已经测定引物3’侧(第六跨膜区侧)之核苷酸序列(SEQ ID NO30)，并翻译成氨基酸序列(SEQ ID NO25)〔图22〕。结果在疏水性图上证实了第六和第七跨膜区的存在〔图59〕。扩增cDNA的大小约为700bp，它几乎可与所述已知G蛋白偶联受体蛋白质的第一跨膜区和第六跨膜区之间的碱基数比较。
G蛋白偶联受体蛋白质具有某种程度的氨基酸水平的共同性质，形成一个蛋白质家族。由此基于主题新受体蛋白质(由包含在p19P2中的cDNA编码的蛋白质)的氨基酸序列进行数据库检索。结果，与图60所示的已知G蛋白偶联受体蛋白质(由S12863编码的大鼠神经肽受体蛋白质)比较显示出高度的同源性。这一事实说明本发明的新受体蛋白质属于G蛋白偶联受体蛋白质家族。而且，已由本发明的DNA编码的氨基酸序列为模板，搜索数据库。其表现出与已知G蛋白偶联受体蛋白质、源于小鼠的配体未知RP-23(B40470)、源于人的配体未知K-阿片样物质受体蛋白质(P30098)和源于人的NK-2受体蛋白质(JQ1059)具有高度的同源性。然而，它们中没有完全一致的，说明已编码了新受体蛋白质。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“登记号”。
接着，通过采用本发明的新的编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA片段(p19P2)，从人垂体cDNA文库获得了具有本发明的受体蛋白质全长开放读框之cDNA。携带具有所述受体蛋白质全长开放读框之cDNA的质粒(phGR3)的核苷酸序列分析显示，这一受体蛋白质编码区的核苷酸序列是由SEQ ID NO31代表的，从其推断的氨基酸序列是由SEQ ID NO26〔图34〕代表的。基于氨基酸序列，绘制疏水图。结果示于图36中。从疏水图可以清楚看出，本发明的受体蛋白质具有7个疏水区。由此证实了由按照本发明获得的cDNA编码的受体蛋白质是7转膜(跨膜)G蛋白偶联受体蛋白质。在mRNA水平经RNA印迹技术检查由本发明的cDNA编码的受体基因mRNA的表达，已证实所说的受体基因已在人垂体中表达〔图35〕。
本发明发明人还成功地了进行源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA片段的PCR扩增和pG3-2和pG1-10的克隆。基于包含在这两个质粒载体中的cDNA的核苷酸序列，衍生了图27所示的核苷酸序列。该核苷酸序列说明所述cDNA编码一种新的受体蛋白质。将核苷酸序列翻译成氨基酸序列后，在疏水性图〔图28〕上就可证实第三、第四、第五和第六跨膜区的存在。扩增cDNA的大小约为400bp，它几乎可与所述已知G蛋白偶联受体蛋白质的第三跨膜区和第六跨膜区之间的碱基数比较。已将所述氨基酸序列与由G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(包含在从人垂体腺克隆的p19P2中)编码的氨基酸序列〔图22和23〕比较。结果同源性大于95％〔图61〕。从这一事实估计，相对由包含在p19P2中的cDNA编码的源于人的所述蛋白质来说，由包含在pG3-2中的cDNA编码的所述蛋白质是小鼠型的G蛋白偶联受体蛋白质。
本发明发明人还经PCR扩增了源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA片段，并接着亚克隆进质粒载体，获得了图62所示的克隆(p5s38)。从核苷酸序列(SEQ ID NO33)可清楚看出，所说的cDNA编码新的受体蛋白质。将核苷酸序列翻译成氨基酸序列(SEQ ID NO28)后，在疏水性图〔图64〕上就可证实第三、第四、第五和第六跨膜区的存在。扩增cDNA的大小约为400bp，它几乎可与所述已知G蛋白偶联受体蛋白质比较。已将所述氨基酸序列与由G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(包含在从人垂体腺克隆的p19P2中)编码的氨基酸序列〔图22和23〕和与由源于小鼠胰腺β细胞株的pG3-2和pG1-10编码的蛋白质氨基酸序列比较。结果它们的同源性大于95％〔图61〕。事实说明由源于人的垂体衍生的p19P2编码的蛋白质、由源于源于小鼠胰腺β细胞株的pG3-2和pG1-10编码的蛋白质和由源于源于小鼠胰腺β细胞株的p5S38编码的蛋白质属于受体家族，它们识别相同的配体。
本发明的另一个目的是提供新的源于人扁桃体的G蛋白偶联受体蛋白质、包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA、产生所说的G蛋白偶联受体蛋白质的方法和所说蛋白质和DNA的用途。
本发明发明人合成了有效分离编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA引物，用这些引物扩增了源于扁桃体的cDNA，并对其进行了分析。
结果，本发明发明人成功地从人扁桃体分离了编码新G蛋白偶联受体蛋白质的cDNA，并确定了其部分结构。与小鼠糖皮质激素诱导的受体(此后有些时候称作“GIR”)相比，分离的cDNA的核苷酸序列保持的非常好，并被认为编码相同配体的受体蛋白质(分子内分泌学51331-1338，1991)。人们认为，在小鼠中，GIR是由糖皮质激素诱导的受体，在T-细胞中表达，其在T-细胞免疫系统中作为免疫调节剂起作用。本发明发明人成功地从人扁桃体分离了这一人型GIR。因此，这说明分离的GIR甚至在人中枢神经系统中表达产生某些功能。从这些事实，人们认为，所说的受体蛋白质在人脑和免疫系统中被强烈表达并在那里发挥作用。这些特征性DNA使得人们可以获得具有所说受体全长开放读框之cDNA并产生受体蛋白质。此外，用合适的方法表达的所说受体蛋白质使得可以在受体蛋白质结合试验或胞外第二信使测定等中可获得的数据的指导下，从活体或者从天然或非天然化合物筛选所述受体蛋白质之配体，从而使得可以筛选抑制所述配体与所述受体蛋白质结合的化合物。
更特别的是，本发明发明人经PCR扩增了一种新的图22和23所示的源于人垂体之DNA，并克隆了它。经部分序列分析弄清了所述cDNA编码一种新的受体蛋白质。用于扩增cDNA的合成DNA引物相应于存在于已知G蛋白偶联受体蛋白质中共同的7个疏水簇，即相应于跨膜区中第一和第六跨膜区。已经测定引物5’侧(第一跨膜区侧)之核苷酸序列，并翻译成氨基酸序列。结果在疏水性图上确定了第二和第三跨膜区〔图31〕。类似地，已经测定引物3’侧(第六跨膜区侧)之核苷酸序列，并翻译成氨基酸序列。结果在疏水性图上证实了第五和第四跨膜区的存在〔图32〕。扩增cDNA的大小约为700bp，它几乎可与所述已知G蛋白偶联受体蛋白质的的碱基数比较。
本发明发明人还基于已分离的DNA的核苷酸序列为模板搜索了数据库，发现与源于小鼠的糖皮质激素诱导的受体蛋白质(广泛已知的G蛋白偶联受体蛋白质)之DNA的高度的同源性〔图33〕。这一结果有力地说明本发明的DNA编码人型GIR受体蛋白质。
本发明的另一个目的是提供源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的新的G蛋白偶联受体蛋白质；包含编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA；产生所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法以及所说蛋白质和DNA的用途。本发明发明人合成了有效分离编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA引物，用这些引物扩增了源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的的cDNA，并对其进行了分析。
结果，本发明发明人成功地分离了源于小鼠的编码新G蛋白偶联受体蛋白质的cDNA，并确定了其部分结构。分离的cDNA在核苷酸序列水平和氨基酸序列水平上同源于已知G蛋白偶联受体蛋白质，被认为编码新的在小鼠胰腺表达的受体蛋白质，也在那里起作用。这些特征性DNA使得人们可以获得具有所说受体全长开放读框之cDNA并产生受体蛋白质。可以用所说的源于小鼠的cDNA作为探针克隆源于人的cDNA。此外，用合适的方法表达的所说受体蛋白质使得可以在受体蛋白质结合试验或胞外第二信使测定等中可获得的数据的指导下，从活体或者从天然或非天然化合物筛选所述受体蛋白质之配体，从而使得可以筛选抑制所述配体与所述受体蛋白质结合的化合物。
更特别的是，本发明发明人还经PCR扩增了图37所示的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA，并克隆它。从其部分序列分析可清楚看出，所说的新的受体蛋白质是被编码的。核苷酸序列已翻译成氨基酸序列，结果在疏水性图上〔图38〕证实了第三、第四、第五和第六跨膜区的存在。扩增cDNA的大小约为400bp，它几乎可与所述已知G蛋白偶联受体蛋白质的比较。
本发明发明人还基于已分离的DNA的核苷酸序列为模板搜索了数据库，发现与已知的G蛋白偶联受体蛋白质的同源性分别为与鸡ATP受体(P34996)有30％的同源性；与预热促生长素抑制素受体3亚型(A46226)有25％的同源性；与人促生长素抑制素4亚型(JN0605)有27％的同源性；与小牛神经肽Y受体(S28278)有28％的同源性〔图39〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“登记号”。
在mRNA水平经RNA印迹技术检查由本发明的包含在p3H2-17中的cDNA片段编码的受体基因的表达，已证实所说的受体基因已在小鼠胸腺和脾脏中强烈表达。也已证实所说的受体基因已在小鼠大脑和胰腺中表达(图65) 。
接着利用包含在p3H2-17中的片段的核苷酸序列信息，经5’RACE(cDNA末端的5’快速扩增)技术(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.858998-9002(1988)；Belyavsky A.等，核酸研究，172919-2932(1989)；Edwards J.B.D.M.等，核酸研究，195227-5232(1991))和3’RACE (cDNA末端的3’快速扩增)技术(Frohman M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858998-9002(1988)；Belyavsky A.等，核酸研究，172919-2932(1989))已从小鼠胸腺和脾脏poly(A)+mRNA获得本发明的编码源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质全长开放读框之cDNA。
携带编码本发明的受体蛋白质全长开放读框之cDNA的质粒(pMAH2-17)已进行测序分析。结果所说受体蛋白质编码区的核苷酸序列是由SEQ ID NO41代表的，从其推断的氨基酸序列是SEQ ID NO39〔图69〕代表的。基于氨基酸序列绘制疏水性图。结果示于图70。
从疏水性图可明显看出，本发明的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的的受体蛋白质具有7个疏水区。因此，已证实，按照本发明的由包含在pMAH2-17中的cDNA编码的受体蛋白质是一个7转膜G蛋白偶联受体蛋白质。
基于由包含在pMAH2-17中的cDNA编码的所说全长氨基酸序列搜索了数据库，发现与已知的G蛋白偶联受体蛋白质的同源性分别为与小鼠P2Upurinoceptor(P35383)有44.0％的同源性；与鸡P2Ypurinoceptor(P34996)有38.1％的同源性〔图71〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“登记号”。因为由pMAH2-17编码的受体蛋白质高度同源于prinoceptor，所以人们认为在prinoceptor家族中极有可能存在亚型。因此本发明发明人进行了非洲蟾蜍属卵母细胞中受体基因的电生理学分析，发现作为对ATP刺激的反应的由携带主题基因的非洲蟾蜍属卵母细胞中引发的向内的电流(inwardcurrent)〔图75〕。结果确定了由pMAH2-17编码的受体是prinoceptor家族中的一个亚型。已讨论了并预期purinoceptor(Pharmac.Ther.，Vol.64，pp.445-475(1994))中有许多亚型。
所有数据都说明本发明的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的的受体蛋白质(SEQ ID NO38和SEQ ID NO39，或由pMAH2-17编码的蛋白质)是与以下蛋白质有明显区别的新purinoceptor亚型鸡P2Y1purinoceptor(FEBS LETTERS，Vol.324(2)，219-225(1993))、小鼠P2Y2或P2Upurinoceptor(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.90，pp 5113-5117(1993))、大鼠P2U或P2Y2purinoceptor(Am.J.Respir.细胞分子生物学，Vol.12，pp27-32(1995))、人P2U或P2Y2purinoceptor(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，pp.3275-3279(1994))、和大鼠P2XPprinoceptor(自然，Vol.371.6，pp516-519(1994))。
这也有力地说明与pMAH2-17编码的受体有关的激动剂和/或拮抗剂在治疗性或预防性治疗与嘌呤配体化合物相关的疾病或并发症上会是有用的。预期pMAH2-17编码的受体的激动剂除了在治疗性或预防性治疗高血压、糖尿病或胆囊纤维症中有用外，作为免疫调节剂或抗肿瘤剂也是有用的，预期pMAH2-17编码的受体的拮抗剂作为低血压剂、止痛剂或者治疗性或预防性治疗尿失禁药剂是有用的。
本发明的另一个目的是提供源于人的新的prinoceptor型G蛋白偶联受体蛋白质；包含编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA；产生所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法以及所说蛋白质和DNA的用途。基于小鼠purinoceptor的核苷酸序列，本发明发明人合成了有效分离编码prinoceptor型G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA引物，用这些引物扩增了源于人的cDNA，并对其进行了分析。
结果，本发明发明人成功地分离了源于人的编码新G蛋白偶联受体蛋白质cDNA，并确定了其全长结构〔图77〕。分离的cDNA在核苷酸序列水平和氨基酸序列水平上同源于小鼠G蛋白偶联受体(purinoceptor)(87％同源性；图79)，被认为编码新的purinoceptor蛋白质。此外，用合适的方法表达的所说受体蛋白质使得可以在受体蛋白质结合试验或胞外第二信使测定等中可获得的数据的指导下，从活体或者从天然或非天然化合物筛选所述受体蛋白质之配体，从而使得可以筛选抑制所述配体与所述受体蛋白质结合的化合物。
这也有力地说明与pMAH2-17编码的人受体有关的激动剂和/或拮抗剂在治疗性或预防性治疗与嘌呤配体化合物相关的疾病或并发症上会是有用的。预期所说的人受体的激动剂除了在治疗性或预防性治疗高血压、糖尿病或胆囊纤维症中有用外，作为免疫调节剂或抗肿瘤剂也是有用的，预期所说的人受体的拮抗剂作为低血压剂、止痛剂或者治疗性或预防性治疗尿失禁药剂是有用的。
因此本发明的一个方面是1.一种DNA，它包含由选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO19的SEQ IDNO所代表的核苷酸序列；2.按照以上1的DNA，其包含由选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO9的SEQ ID NO所代表的核苷酸序列；3.按照以上1的DNA，其包含由选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO2的SEQ ID NO所代表的核苷酸序列；4.按照以上1的DNA，其中的DNA是为了扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的聚合酶链反应的引物；
5.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括(i).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
6.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括(ii).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
7.一种编码G蛋白偶联受体蛋白质或其片段之DNA，该DNA是由以上5或6的方法获得的。
8.一种由按照以上7的DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质，其肽区段或片段或者其盐。
本发明的另一个特定的方面是9.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第一至第六跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；10.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第一至第七跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物。
11.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第三至第六跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；12.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第三至第七跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物。
13.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第二至第六跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；14.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第二至第七跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物。
15.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，相应于G蛋白偶联受体蛋白质第一至第三跨膜区或其其它区的区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；
(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
16.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物。
17.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物。
18.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物。
19.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物。
20.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括(i).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物能够与编码G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA的-链(负链)的3’-侧核苷酸序列连接使得+链(正链)可以以5’-3’方向延伸，所说DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ IDNO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ IDNO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该引物能够与编码G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA的+链(正链)的3’-侧核苷酸序列连接使得-链(负链)可以以5’-3’方向延伸，所说DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ IDNO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ IDNO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物能够与编码G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA的-链(负链)的3’-侧核苷酸序列连接使得+链(正链)可以以5’-3’方向延伸，所说DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该引物能够与编码G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA的+链(正链)的3’-侧核苷酸序列连接使得-链(负链)可以以5’-3’方向延伸，所说DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物；21.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第一至第六跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第一至第六跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；22.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第一至第七跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第一至第七跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；23.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第三至第六跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第三至第六跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；24.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第三至第七跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第三至第七跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物；25.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第二至第六跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第二至第六跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；26.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第二至第七跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第二至第七跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；27.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第一至第三跨膜区或其其它区)之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质(例如，G蛋白偶联受体蛋白质的第一至第三跨膜区或其其它区)之模板DNA；(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物；28.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物；29.一种筛选DNA文库以检测编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物；30.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物；31.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；32.一种按照以上6、和21-31任一之筛选DNA文库的方法，其中所说的DNA文库来源于人组织和人细胞。所述人组织的例子包括肾上腺、脐带、脑、舌、肝、淋巴结、肺、胸腺、胎盘、腹膜、视网膜、脾、心、平滑肌、肠、脉管、骨、肾、皮肤、胎儿、乳腺、卵巢、睾丸、垂体、胰腺、下颌腺、脊柱、前列腺、胃、甲状腺、气管、骨胳肌、子宫、脂肪组织、膀胱、角膜、嗅球、骨髓、羊膜等。所述人细胞的例子包括神经学细胞、上皮细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、胶质细胞、成纤维细胞、角化细胞、成骨细胞、蛛形细胞、黑素细胞、各种癌细胞、各种肉瘤细胞、各种源于以上提到的人组织的细胞。
本发明的另一方面是具有选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO19所示的寡核苷酸序列的简并脱氧核苷酸。
本发明的另一方面是33.一种G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQID NO24和/或SEQ ID NO25代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO24或SEQ ID NO25代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；34.一种按照以上33的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；35.一种G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQID NO27代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；36.一种G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQID NO28代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO28代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；37.一种G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQID NO34和/或SEQ ID NO35代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO34或SEQ ID NO35代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；38.一种G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQID NO38代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；39.一种按照以上38的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；40.一种G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自由SEQID NO56代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列之实质上的等价物的氨基酸序列；41.一种按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的肽区段或片段、其修饰的衍生物或其盐；42.一种DNA，该DNA包含编码以上33的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；43.一种DNA，该DNA包含编码以上34的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；44.一种DNA，该DNA包含编码以上35的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；45.一种DNA，该DNA包含编码以上36的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；46.一种DNA，该DNA包含编码以上37的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；47.一种DNA，该DNA包含编码以上38的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；48.一种DNA，该DNA包含编码以上39的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；49.一种DNA，该DNA包含编码以上40的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列；50.一种以上42的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO29和/或30代表的核苷酸序列；51.一种以上43的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO31代表的核苷酸序列；
52.一种以上44的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO32代表的核苷酸序列；53.一种以上45的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO33代表的核苷酸序列；54.一种以上46的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO36和/或SEQ IDNO37代表的核苷酸序列；55.一种以上47的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO40代表的核苷酸序列；56.一种以上48的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO41代表的核苷酸序列；57.一种以上49的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO57代表的核苷酸序列；58.一种载体，该载体包含按照以上42到57任一之DNA；59.一种转化体(包括转染体)，其携带以上58的载体；60.一种产生按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐的方法，该方法包括培养以上59的转化体，以便在所说转化体的膜上表达所说的G蛋白偶联受体蛋白质；61.一种判定按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将(i)至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份与(ii)至少一种待试化合物接触；62.一种筛选能够抑制按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质与配体结合的化合物的方法，该方法包括将以下两者进行比较(i)至少这样一例，其中所说的配体与至少一种选自按照按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触；(ii)至少这样一例，其中所说的配体和待试化合物一起与至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触；
63.一种试剂盒，该试剂盒用于筛选能够抑制按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质与配体结合的一种或多种化合物，它包含至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份；和64.一种抗体，该抗体抗至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份。
本发明另一方面是65.一种按照以上33的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含(i)选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、SEQ ID NO24的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO24的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO24的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列，或/和(ii)选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO25代表的氨基酸序列、SEQ ID NO25的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO25的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO25的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；66.一种按照以上34的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列、SEQ IDNO26的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO26的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO26的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；67.一种按照以上35的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列、SEQ IDNO27的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO27的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个P-基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO27的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；68.一种按照以上36的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO28代表的氨基酸序列、SEQ IDNO28的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO28的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO28的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；69.一种按照以上37的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含(i)选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO34代表的氨基酸序列、SEQ ID NO34的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO34的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO34的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列，或/和(ii)选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO35代表的氨基酸序列、SEQ ID NO35的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO35的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ ID NO35的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；70.一种按照以上38的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列、SEQ IDNO38的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO38的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO38的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；71.一种按照以上39的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列、SEQ IDNO39的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO39的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO39的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；72.一种按照以上40的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列、SEQ IDNO56的氨基酸序列中缺失掉一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO56的氨基酸序列中添加了一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)的氨基酸序列、SEQ IDNO56的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；73.一种判定按照以上61的配体的方法，其中所说的配体选自下组血管紧张肽、铃蟾肽、canavinoid、缩胆囊肽、谷酰胺、血清素、褪黑激素、神经肽Y、阿片样物质、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管作用肠肽和关联肽)、生长抑素、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、adrenomedullin、白三烯(leukotriene)、胰抑制素、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)、内皮素、肠抑胃素(enterogastrin)、组胺、神经降压素、TRH、胰腺多肽和galanin；74.一种筛选能够抑制配体与按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，该方法包括在至少以下两种情况下测定结合到所说G蛋白偶联受体蛋白质上的标记配体的量，并比较测定的标记配体的量(i)其中所说的标记配体与至少一种选自按照按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触；和(ii)其中所说的标记配体和待试化合物一起与至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触；75.一种筛选能够抑制配体与按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，该方法包括在至少以下两种情况下测定结合到包含所说G蛋白偶联受体蛋白质之细胞上的标记配体的量，并比较测定的标记配体的量(i)其中所说的标记配体与所说的细胞接触；和(ii)其中所说的标记配体和待试化合物一起与所说的细胞接触；76.一种筛选能够抑制配体与按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，该方法包括在至少以下两种情况下测定结合到包含所说G蛋白偶联受体蛋白质之细胞的膜组份上的标记配体的量，并比较测定的标记配体的量(i)其中所说的标记配体与所说的膜组份接触；和(ii)其中所说的标记配体和待试化合物一起与所说的膜组份接触；77.一种筛选能够抑制配体与按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，该方法包括在至少以下两种情况下测定结合到所说G蛋白偶联受体蛋白质上的标记配体的量，并比较测定的标记配体的量(i)其中所说的标记配体与至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质接触，所说的G蛋白偶联受体蛋白质是在按照以上59的转化体的培养期间在转化体的膜上表达的；和(ii)其中所说的标记配体和待试化合物一起与至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质接触，所说的G蛋白偶联受体蛋白质是在按照以上59的转化体的培养期间在转化体的膜上表达的；78.一种筛选能够抑制配体与按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，该方法包括在至少以下两种情况下测定G蛋白偶联受体蛋白质-介导的细胞-刺激活性，并比较测定的细胞-刺激活性(i)其中所说的能够活化按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的化合物与包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触；和
(ii)其中所说的能够活化所说G蛋白质的化合物和待试化合物一起与包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触；79.一种筛选能够抑制配体与按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，该方法包括在至少以下两种情况下测定G蛋白偶联受体蛋白质-介导的细胞-刺激活性，并比较测定的细胞-刺激活性(i)其中所说的能够活化按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的化合物与包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触，所说的G蛋白偶联受体蛋白质是在按照以上59的转化体的培养期间在转化体的膜上表达的；和(ii)其中所说的能够活化所说G蛋白质的化合物和待试化合物一起与包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触，所说的G蛋白偶联受体蛋白质是在按照以上59的转化体的培养期间在转化体的膜上表达的；80.一种按照以上78或79的方法，其中所说的能够活化按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的化合物选自下组血管紧张肽、铃蟾肽、canavinoid、缩胆囊肽、谷酰胺、血清素、褪黑激素、神经肽Y、阿片样物质、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管作用肠肽和关联肽)、生长抑素、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、adrenomedullin、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰腺多肽和galanin；81.一种经以上62和74-80的方法判定的化合物或其盐；82.一种药物组合物，该组合物包含有效量的按照以上81的化合物或其盐；83.一种按照以上63的筛选试剂盒，该试剂盒含有包含按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的细胞；84.一种按照以上63的筛选试剂盒，该试剂盒含有源于包含按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的细胞的膜组份；
85.一种按照以上63的筛选试剂盒，该试剂盒含有本文以上59或以下109所述的细胞；86.一种按照以上63的筛选试剂盒，该试剂盒含有源于本文以上59或以下109所述的细胞的膜组份；87.一种经以上63和83-86的方法判定的化合物或其盐；88.一种药物组合物，该组合物包含有效量的按照以上87的化合物或其盐；89.一种测定至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份的方法，该方法包括将按照以上64的抗体与选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触。
本发明的另一方面是90.一种按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的配体，该配体是经以下步骤判定的将(i)至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份与(ii)至少一种待试化合物接触；91.一种能够抑制按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质和配体结合的化合物，该化合物是经将以下两者比较判定的(i)至少这样一例，其中所说的配体与至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触，(ii)至少这样一例，其中所说的配体和待试化合物一起与至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份接触；92.一种重组G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或者它们的修饰的或片段化的衍生物，所说的蛋白质或其盐是由按照以上42到57任一之DNA表达获得的；
93.一种经聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板，(2)至少一种DNA引物，该引物选自包含SEQ ID NO1或SEQ IDNO2的DNA引物；94.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应，选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的DNA引物；本发明的另一方面是95.一种单克隆抗体，该抗体抗至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份；96.一种纯化的多克隆抗体制剂，所说的抗体抗至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份；97.一种检测G蛋白偶联受体蛋白质的免疫测定方法，该方法包括(i)与按照以上64的抗体一起温育待试样品，使得形成抗原-抗体复合物；和(ii)测定步骤(i)中形成的抗原-抗体复合物；98.一种检测抗G蛋白偶联受体蛋白质的抗体的免疫测定方法，该方法包括(i)与至少一种以下所说的组份一起温育待试样品，使得形成抗原-抗体复合物，所说的组份选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物；和(ii)测定步骤(i)中形成的抗原-抗体复合物；
本发明的另一方面是99.一种反义DNA或RNA，其包含互补于按照以上42到57任一之DNA的至少一部分，所说的DNA或RNA可以杂交到按照以上42到57的所说DNA上；100.一种按照以上99的DNA或RNA，其中所说的DNA或RNA包含按照以上42到57任一之G蛋白偶联受体蛋白质DNA的5’末端发夹环、5’末端6碱基对重复、5’末端非翻译区、蛋白质翻译起始位点或密码子、3’非翻译区、3’末端回文结构区或3’末端发夹环；101.一种按照以上99的反义DNA或RNA，其在药学上可接受的载体中；102.一种按照以上99的反义DNA或RNA，其包含2到50的核苷酸序列；103.一种调节G蛋白偶联受体蛋白质活性的方法，该方法包括使包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞与按照以上99的反义DNA或RNA接触；104.一种产生抗按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的抗体的方法，该方法包括给个体施用至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份；105.一种产生杂交瘤的方法，所说的杂交瘤产生抗按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质的抗体，该方法包括(i)用至少一种选自按照以上33到40任一之G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、按照以上41的肽片段或区段或其盐和它们的混合物的组份免疫个体；(ii)从免疫个体无限增殖产生抗体之细胞；(iii)选择产生与所说G蛋白偶联受体蛋白质反应性的无限增殖细胞；和(iv)培养所说的无限增殖细胞；106.一种从DNA文库中筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(或核苷酸序列)的PCR筛选试剂盒，该试剂盒包含
(i)(1)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii)(1)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
107.一种包含按照以上7之DNA的载体；108.一种表达系统，该系统包含源于按照以上7和42-57任一之G蛋白偶联受体蛋白质DNA的DNA开放读框(ORF)，其中所说的ORF是可操作连接到与所需宿主细胞相容的控制序列上的；109.一种转化体(包括转染体)，其携带以上107的载体或以上108的表达系统；110.一种产生G蛋白偶联受体蛋白质或其盐的方法，该方法包括培养以上109的转化体，以在转化体的膜上表达所说的G蛋白偶联受体蛋白质；111.一种表达G蛋白偶联受体蛋白质多肽的方法，该方法包括；
(a)产生以上59或109的转化体；和(b)在允许表达所说G蛋白偶联受体蛋白质多肽的条件下培养所说的转化体；112.一种制备按照以上59或109的转化体的方法，该方法包括(a)提供能够转化的宿主细胞；(b)提供按照以上58或107的载体或者按照以上108的表达系统；和(c)在允许由所说载体或所说表达系统转化所说宿主细胞的条件下将(a)的宿主细胞与(b)的载体或表达系统一起培养。
113.一种按照以上82或88的药物组合物，该组合物包含与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合的有效量的按照以上81或87的化合物或其药学上可接受的盐；114.一种按照以上82或88的药物组合物，该组合物用于抑制按照本发明的G蛋白偶联受体蛋白质与配体的结合；115.一种抑制按照本发明的G蛋白偶联受体蛋白质与介质中配体结合的方法，该方法包括使有效量的按照以上81或87的化合物或其盐与所说的介质接触；116.一种调节G蛋白偶联受体蛋白质活性的方法，该方法包括使表达G蛋白偶联受体蛋白质的细胞与有效量的按照以上81或87的化合物或其盐接触；117按照以上90的配体，其是由可检测的报道物标记的；118.一种按照以上64的抗体，其中所说的抗体是由可检测的报道物标记的；119.一种用于控制G蛋白偶联受体蛋白质表达的药物组合物，该组合物包含有效量的按照以上99的反义DNA；和120.一种由按照以上59或109的转化体产生的培养产物。
本发明的另一方面是121.一种按照以上1的DNA，其中所说的DNA是具有8-60个碱基残基的寡核苷酸；122.一种按照以上1的DNA，其中所说的DNA是合成的；123.一种编码G蛋白偶联受体蛋白质或其片段的DNA(或核苷酸序列)，其是经按照以上5-32任一之方法获得的；124.一种按照以上123的DNA(或核苷酸序列)，其中所说的G蛋白偶联受体蛋白质选自下组血管紧张肽受体、铃蟾肽受体、canavinoid受体、缩胆囊肽受体、谷酰胺受体、血清素受体、褪黑激素受体、神经肽Y受体、 阿片样物质受体、嘌呤受体、后叶加压素受体、催产素受体、VIP(血管作用肠肽和关联肽)受体、生长抑素受体、多巴胺受体、胃动素受体、淀粉不溶素受体、缓激肽受体、CGRP(降钙素基因相关肽)受体、adrenomedullin受体、白三烯受体、胰抑制素受体、前列腺素受体、血栓烷受体、腺苷受体、肾上腺素受体、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)受体、内皮素受体、肠抑胃素受体、组胺受体、神经降压素受体、TRH受体、胰腺多肽受体和galanin受体；和125.一种由按照以上59或109的转化体产生的培养产物。
本文所使用的术语“实质上的等价物”指蛋白质活性(例如配体结合活性性质)和物理特性实质上相同的氨基酸序列。氨基酸的取代、缺失或插入不引起多肽物理或活性特性的根本改变，在这种情况下，包含取代、缺失或插入的多肽被认为是无取代、缺失或插入的多肽实质上的等价物。序列内氨基酸的实质上等价的取代基可以选自该氨基酸所属类别中的其它成员。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸’苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。阳性荷电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。阴性荷电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
附图简要说明图1描绘了具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(HS-1)序列与各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图2描绘了互补于具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物(HS-2)的序列与各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图3描绘了具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(3A)序列或具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(3B)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图4描绘了具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(3C)序列或具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(3D)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图5描绘了互补于具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物序列的序列(6A)或互补于具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物序列的核苷酸序列(6B)相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图6描绘了互补于具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物序列(6C)的序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图7描绘了具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(T2A)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图8描绘了互补于具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物(T7A)的序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图9描绘了具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(T2A)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图10描绘了互补于具有由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物(TM3-B2)的序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图11描绘了具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(TM3-C2)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图12描绘了互补于具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物(TM6-E2)的序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图13描绘了具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(TM2F18)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图14描绘了互补于具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物(TM6R21)的序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图15描绘了具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的5’侧合成DNA引物(S3A)序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。
图16描绘了互补于具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的3’侧合成DNA引物(S6A)的序列相对于各种其它编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA和基因核苷酸序列的一致性(同源性)。图17是各cDNA产物的1.2％琼脂糖凝胶电泳轮廓图，所述cDNA产物是用具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的合成DNA引物和具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的合成DNA引物经PCR扩增从人脑扁桃体(1、2、7)、人垂体(3、4、8)和大鼠脑(5、6、9)获得的，其中1-6道显示了在如实施例中公开的苛刻条件下进行PCR时的结果，7-9道显示了在温和的条件下进行PCR时的结果，M指由用限制酶EcoT14I切割λ-噬菌体获得的大小标记。
图18显示了经用T7引物测序克隆A58确定的核苷酸序列，其中克隆A58是通过在温和的条件下经PCR扩增源于人扁桃体的cDNA并亚克隆进pCTTMII获得的。
图19示出了用SP6引物测序克隆A58确定的核苷酸序列。
图20显示了经用-21M13引物测序克隆57-A-2确定的核苷酸序列，其中克隆57-A-2是通过在苛刻的条件下经PCR扩增源于人扁桃体的cDNA并亚克隆进pCTTMII获得的。
图21显示了经用T7引物测序克隆B54确定的核苷酸序列，其中克隆B54是通过在温和的条件下经PCR扩增源于大鼠全脑的cDNA并亚克隆进pCTTMII获得的。
图22说明包含在cDNA克隆p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段(其是用源于人垂体的cDNA经PCR分离的)的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，其中所使用的测序引物是-21M13，下划线部分相应于合成引物。
图23说明包含在cDNA克隆p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段(其是用源于人垂体的cDNA经PCR分离的)的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，其中所使用的测序引物是M13RV-N(Takara，日本)，下划线部分相应于合成引物。
图24是由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的部分疏水性作图轮廓图，它是基于图22所示的氨基酸序列制成的。
图25是由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的部分疏水性作图轮廓图，它是基于图23所示的氨基酸序列制成的。
图26示出了如图22和23所示相对于已知G蛋白偶联受体蛋白质S12863的由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的氨基酸序列(p19P2)，其中阴影中的(reverse)氨基酸残基是一致的，p19P2序列的1-99位氨基酸残基相应于图22中的1-99位氨基酸残基，其156-230位氨基酸残基相应于图23中的1-68位氨基酸残基。
图27是源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说的片段是基于各自包含在cDNA克隆pG3-2和pG1-10中的源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段衍生的，是用源于MIN6的cDNA经PCR分离的，其中下划线部分相应于合成引物。
图28源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质的部分疏水性作图轮廓图，它是基于图27所示的部分氨基酸序列制成的。
图29是新受体蛋白质cDNA克隆p63A2的部分核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从人扁桃体获得的，其中下划线部分相应于合成引物。
图30是新受体蛋白质cDNA克隆p63A2的部分核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从人扁桃体获得的，其中下划线部分相应于合成引物。
图31是基于图29所示的氨基酸序列制成的疏水性作图轮廓图，说明存在如1-3指明的疏水区。
图32是基于图30所示的氨基酸序列制成的疏水性作图轮廓图，说明存在如4-6指明的疏水区。
图33是相对于G蛋白偶联受体蛋白质(p30731)(被源于小鼠T细胞的糖皮质激素表达和诱导)部分氨基酸序列的由包含在p63A2中的新受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质大小部分氨基酸序列(p63A2)，其中阴影中的氨基酸残基是一致的。
图34是包含在cDNA克隆phGR3中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的全核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所示核苷酸序列是以p19P2中的DNA插入物为探针经噬菌体杂交从源于人的cDNA文库分离的。
图35是由源于人垂体的cDNA克隆phGR3编码的受体基因的人垂体mRNA的RNA印迹轮廓图。
图36是由包含在phGR3源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的蛋白质的疏水性作图轮廓图，它是基于图34所示的氨基酸序列制成的。
图37是新受体蛋白质cDNA克隆p3H2-17的部分核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说克隆是经PCR扩增从小鼠胰腺β细胞株MIN6获得的，其中下划线部分相应于用于PCR扩增的合成引物。
图38是基于图37所示的氨基酸序列制成的疏水性作图轮廓图，说明存在如3-6指明的疏水区。
图39是相对于鸡ATP受体蛋白质(P34996)、人生长抑素受体亚型3蛋白质(A46226)、人生长抑素受体亚型4蛋白质(JN0605)和牛神经肽Y受体蛋白质(S28787)各个的部分氨基酸序列的被包含在p3H2-17中的新受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列，其中阴影中的氨基酸残基是一致的。
图40是新受体蛋白质cDNA克隆p3H2-34的部分核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说克隆是经PCR扩增从小鼠胰腺β细胞株MIN6获得的，其中下划线部分相应于用于PCR扩增的合成引物。
图41是基于图40所示的氨基酸序列制成的疏水性作图轮廓图，其中纵座标轴表示疏水性指数，横坐标轴表示氨基酸的数量，数字3-6表示疏水区。
图42是相对于人生长抑素受体亚型4蛋白质(JN0605)人生长抑素受体亚型2蛋白质(B41795)和源于大鼠的配体未知受体蛋白质(A39297)各个的部分氨基酸序列的被包含在p3H2-17中的新受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列，其中阴影中的氨基酸残基是一致的。
图43是包含在新受体蛋白质cDNA克隆pMD4中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从兔胃幽门部分平滑肌获得的，其中下划线部分相应于用于PCR扩增的合成DNA引物。
图44是基于图35所示的氨基酸序列制成的蛋白质疏水性作图轮廓图，所说蛋白质是由包含在pMD4中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的，其中数字1-3表示疏水区。
图45是相对于已知G蛋白偶联受体蛋白质大鼠配体未知受体蛋白质(A35639)的由如图43所示的包含在pMD4中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的部分氨基酸序列(pMD4)，其中阴影中的氨基酸残基是一致的，pMD4D 1-88位氨基酸残基相应于图43中的1-88位氨基酸残基。
图46示出了源于小鼠的galanin受体蛋白质cDNA克隆pMGR20的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列已用作为探针的p3H2-34中源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的插入物克隆。
图47是基于图46所示的氨基酸序列制成的疏水性作图轮廓图，其中纵座标轴表示疏水性指数，横坐标轴表示氨基酸的数量，数字1-7表示疏水区。
图48是相对于源于人的galanin受体蛋白质的氨基酸序列(HUMAGALAMI)的由pMGR20编码的源于小鼠的galanin受体蛋白质的氨基酸序列(MOUSEGALRECE)，其中阴影中的氨基酸残基是一致的。
图49是包含在新受体蛋白质cDNA克隆pMJ10中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从图胃幽门部分平滑肌获得的，其中下划线部分相应于用于PCR扩增的合成DNA引物。
图50是基于图49所示的氨基酸序列制成的蛋白质疏水性作图轮廓图，所说蛋白质是由包含在pMJ10中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的，其中数字4-6表示疏水区。
图51是相对于人配体未知受体蛋白质(B42009)、人N-甲酰基肽受体蛋白质(JC2014)、兔N-甲酰基肽受体蛋白质(A46520)、小鼠C5a过敏毒素受体蛋白质(A46525)和牛神经肽Y受体蛋白质(S28787)的由如图49所示的包含在pMJ10中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的部分氨基酸序列(pMJ10)，其中阴影中的氨基酸残基是一致的，pMD4的1-125位氨基酸残基相应于图49中的1-125位氨基酸残基。
图52示出了源于包含在pMH28中的兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从兔胃幽门部分平滑肌获得的，其中下划线部分相应于源于PCR扩增的合成引物。
图53是基于图52所示的氨基酸序列制成的蛋白质疏水性作图轮廓图，其中所说的蛋白质是pMH28中的兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的，其中的数字4-6说明存在疏水区。
图54是相对于已知G蛋白偶联受体蛋白质小鼠IL-8受体蛋白质(P35343)、人生长抑素受体蛋白质1(A41795)和人生长抑素受体蛋白质4(A47457)的图52所示的包含在pMH28中的兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的部分氨基酸序列(pMH28)，其中阴影中的氨基酸残基是一致的，并且pMH28的1-119位氨基酸残基相应于图52中的1-119位氨基酸残基。
图55是包含在新受体蛋白质cDNA克隆pMN7中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从图胃幽门部分平滑肌获得的，其中下划线的5’末端核苷酸序列部分相应于用于PCR扩增的合成DNA引物。
图56是包含在新受体蛋白质cDNA克隆pMN7中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说核苷酸序列是经PCR扩增从图胃幽门部分平滑肌获得的，其中下划线的3’末端核苷酸序列部分相应于用于PCR扩增的合成DNA引物。
图57是基于图55和56所示的氨基酸序列制成的蛋白质疏水性作图轮廓图，所说蛋白质是由包含在pMN7中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的，其中数字TM2到TM6说明存在疏水区。
图58是基于图22所示的氨基酸序列制成的部分蛋白质疏水性作图轮廓图，所说蛋白质是由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的。
图59是基于图23所示的氨基酸序列制成的部分蛋白质疏水性作图轮廓图，所说蛋白质是由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的。
图60是相对于已知G蛋白偶联受体蛋白质S12863的蛋白质部分氨基酸序列(p19P2)，所示蛋白质是由图22和23所示的包含在p19P2中源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的。其中阴影中的氨基酸残基是一致的，p19P2序列的1-99位氨基酸残基相应于图22中的1-99位氨基酸残基，其156-230位氨基酸残基相应于图23中的1-68位氨基酸残基。
图61是相对于如图22和23所示的由p19P2编码的蛋白质部分氨基酸序列(p19P2)的如图27所示的源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列(pG3-2/pG1-10)。其中阴影中的氨基酸残基是一致的，p19P2序列的1-99位氨基酸残基相应于图22中的1-99位氨基酸残基，其156-223位氨基酸残基相应于图23中的1-68位氨基酸残基，pG3-2/pG1-10的1-223位氨基酸残基相应于图27中的1-223为氨基酸残基。
图62是包含在cDNA克隆p5S38中的源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列是用源于MIN6的cDNA经PCR分离的，其中的下划线部分相应于合成引物。
图63是相对于如图22和23所示的由p19P2编码的蛋白质部分氨基酸序列(p19P2)以及如图27所示的由源于包含在pg3-2和pG1-10中cDNA片段核苷酸序列编码的G蛋白偶联受体蛋白质部分氨基酸序列的如图62所示的源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列(p5S38)。其中阴影中的氨基酸残基是一致的，p5S38序列的1-144位氨基酸残基相应于图62中的1-144位氨基酸残基，p19P2的1-99位氨基酸残基相应于图22中的1-99位氨基酸残基，其156-223位氨基酸残基相应于图23中的1-68位氨基酸残基，pG3-2/pG1-10的1-223位氨基酸残基相应于图27中的1-223为氨基酸残基。
图64是基于图62中所示的氨基酸序列制成的由包含在p5S38中的源于MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的部分疏水性作图轮廓图。
图65示出了小鼠细胞系MIN6、Neuro-2a细胞和小鼠脑、胸腺、脾和胰腺poly(A)+RNA的由包含在源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的新受体蛋白质cDNA克隆p3H2-17中的cDNA编码的受体基因的RNA印迹分析轮廓，其中各箭头和数字指大小标记位置(数量单位kb)。
图66示出了采用小鼠胸腺和脾poly(A)+RNA经包含在p3H2-17中的受体基因的5’RACE PCR获得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳轮廓。
1道指大小标记6(Wako Pure Chemical，日本)。
2道指内标，其是用具有SEQ ID NO20的引物和具有SEQ ID NO22的引物与聚合酶经PCR扩增获得的源于胸腺的PCR产物。
3道指阴性对照，其是在添加锚之前经胸腺cDNA的Ex Taq聚合酶PCR扩增获得的PCR产物。
4道指阴性对照，其是在添加锚之前经胸腺cDNA的Taq聚合酶PCR扩增获得的PCR产物。
5道指用Pfu聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
6道指用Vent聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
7道指用Ex聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
8道指用Taq聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
9道指大小标记5(Wako Pure Chemical，日本)。
10道指内标，其是用具有SEQ ID NO20的引物和具有SEQ ID NO22的引物与聚合酶经PCR扩增获得的源于脾的PCR产物。
11道指阴性对照，其是在添加锚之前经脾cDNA的Ex Taq聚合酶PCR扩增获得的PCR产物。
12道指阴性对照，其是在添加锚之前经脾cDNA的Taq聚合酶PCR扩增获得的PCR产物。
13道指用Pfu聚合酶经脾poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
14道指用Vent聚合酶经脾poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
15道指用Ex聚合酶经脾poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
16道指用Taq聚合酶经脾poly(A)+RNA的5’RACE获得的PCR产物。
17道指大小标记5(Wako Pure Chemical，日本)。
黑色的三角形指回收的带。
图67示出了采用小鼠胸腺和脾poly(A)+RNA经包含在p3H2-17中的受体基因的3’RACE PCR获得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳轮廓。
1道指大小标记5(Wako Pure Chemical，日本)。
2道指用Taq聚合酶经脾poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
3道指用Ex聚合酶经脾poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
4道指用Vent聚合酶经脾poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
5道指用Pfu聚合酶经脾poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
6道指用Taq聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
7道指用Ex聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
8道指用Vent聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
9道指用Pfu聚合酶经胸腺poly(A)+RNA的3’RACE获得的PCR产物。
10道指大小标记6(Wako Pure Chemical，日本)。
黑色的三角形指回收的带。
图68描绘了经5’RACE和3’RACE获得的包含在p3H2-17中的受体蛋白质cDNA片段RACE产物的模式。开放区域代表已分离和包含在p3H2-17中的区。小箭头(1)、(2)、(3)和(4)表明实施例19中设计的引物的位置和方向。大箭头显示了预测的p3H2-17具有的受体蛋白质的全长开放读框。在两端的数字N26、N64、N75、C2、C13和C15指获得的RACE产物的克隆编号。在这些RACE产物中，N26、N64和N75插入PCRTMII载体，C2、C13和C15插入pUC18的SmaI位点。实心箭头指已由测序明确的PCR错误位置。
图69是包含在cDNA克隆pMAH2-17中的小鼠G蛋白偶联受体蛋白质的开放读框和其邻近区的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列，所说克隆是经基于包含在p3H2-17中的cDNA片段的核苷酸序列由RACE技术从小鼠脾和胸腺poly(A)+RNA获得的。
图70是由基于图69所示的氨基酸序列制成的由包含在pMAH2-17中的受体蛋白质cDNA编码的蛋白质的疏水性作图轮廓图。
图71是相对于已知G蛋白偶联受体蛋白质小鼠P2UPurinoceptor(P2U MOUSE)和鸡P2YPurinoceptor(P2YR CHICK)的包含在如图69所示的pMAH2-17中的源于小鼠的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的氨基酸序列(75+13CODING)，其中阴影中的氨基酸残基是一致的。
图72是包含在新受体蛋白质cDNA克隆pMN128中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列(从1到540位核苷酸)和其编码的氨基酸序列，所说片段是经PCR扩增从兔胃幽门部分平滑肌获得的。其中下划线的5’部分相应于用于PCR扩增的合成DNA引物。
图73是包含在新受体蛋白质cDNA克隆pMN128中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列(从541到843位核苷酸)和其编码的氨基酸序列，所说片段是经PCR扩增从兔胃幽门部分平滑肌获得的。其中下划线的3’部分相应于用于PCR扩增的合成DNA引物。
图74是由基于图72和73所示的氨基酸序列制成的由包含在pMN128中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码的蛋白质的疏水性作图轮廓图。说明存在疏水区。
图75显示由注射pMAH2-17-编码受体的非洲蟾蜍属卵母细胞中的ATP刺激激发的向内的电流。
图76是相对于包含在p3H2-17中的源于小鼠的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段核苷酸序列的包含在p3H2-17中的源于人的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列。其中阴影中的碱基残基是一致的。
图77是包含在p3H2-17中的源于人的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的开放读框和其邻近区的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列。
图78是由包含在p3H2-17中的源于小鼠的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的蛋白质的疏水性作图轮廓图。
图79是相对于由pH3-17编码的小鼠Purinoceptor的由phAH2-17编码的人型Purinoceptor的氨基酸序列，其中阴影中的氨基酸残基是一致的。优选实施方案的详细描述按照本发明，包含由选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO19的SEQ ID NO所示的各核苷酸序列之DNA序列已被合成和确定特征。所说DNA是用于扩增编码部分或全部G蛋白偶联受体蛋白质多肽序列之DNA的聚合酶链反应的有效引物。用所说的引物DNA，可以有利地进行编码部分或全部G蛋白偶联受体蛋白质多肽序列之DNA的PCR扩增。接着可以用所说引物DNA经聚合酶链反应技术成功地从DNA文库筛选编码部分或全部G蛋白偶联受体蛋白质多肽序列之DNA。结果是，包含在DNA文库中的编码部分或全部G蛋白偶联受体蛋白质多肽序列之模板DNA可以被选择性地扩增，各种编码部分或全部G蛋白偶联受体蛋白质多肽序列之DNA序列可以被分离和确定特征。而且，G蛋白偶联受体蛋白质、源于所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽区段或片段、其修饰衍生物或类似物和其盐可以被识别、预测、推断、产生、表达、分离和确定特征。
在PCR扩增编码部分或全部G蛋白偶联受体蛋白质多肽序列之DNA序列中有用的引物DNA是一种简并脱氧核苷酸，其具有由选自SEQ IDNO1到SEQ ID NO19的SEQ ID NO指定的核苷酸序列。
由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-CGTGGSCMTSSTGGGCAACN1YCCTG-3’其中S是G或C，M是A或C，N1＝A，G，C，或T，并且Y是T或C(图1HS-1)。
由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-GTN1GWRRGGCAN1CCAGCAGAKGGCAAA-3’其中N1＝A，G，C，或T，W是A或T，R是A或G，并且K是G或T，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TTTGCCMTCTGCTGGNTGCCCYYWCNAC-3’其中N＝A，C，G，或T，M是A或C，Y是T或C，并且W是A或T(图2)。
由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5-CTCGCSGCYMTN2RGYATGGAYCGN2TAT-3其中S是G或C，Y是C或T，M是A或C，R是A或G，以及N2＝I(图43D)。
由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5-CATGTRGWAGGGAAN2CCAGSAMAN2RARRAA-3’其中R是A或G，W是T或A，S是G或C，M是A或C，并且N2＝I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TTYYTYN1TKTSCTGGN1TTCCCTWCYACATG-3’其中Y是C或T，N1＝A，G，C，或T，K是G或T，S是G或C，W是A或T(图66C)。
由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-CTGACYGYTCTN2RSN2RYTGACMGVTAC-3’其中Y是C或T，R是A或G，S是G或C，M是A或C，并且V是A，C或G，同时N2是I(图33A)。
由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5-CTGACYGYTCTN2RSN2RYTGACMGVTAT-3’其中Y是C或T，R是A或G，S是G或C，M是A或C，V是A，C或G，N2是I(图33B)。
由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列
5’-CTCGCSGCYMTN2RGYATGGAYCGN2TAC-3’其中S是G或C，Y是C或T，M是A或C，R是A或G，N2是I(图43C)。
由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-GATGTGRTARGGSRN2CCAACAGAN2GRYAAA-3’其中R是A或G，S是G或C，Y是C或T，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TTTRYCN1TCTGTTGGN1YSCCYTAYCACATC-3’其中R是A或G，Y是C或T，S是G或C，N1是A，T，G或C(图56A)。
由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-GATGTGRTARGGSRN2CCAACAGAN2GRYGAA-3’其中R是A或G，S是G或C，Y是C或T，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TTCRYCN1TCTGTTGGN1YSCCYTAYCACATC-3’其中R是A或G，Y是C或T，S是G或C，N1是A，T，G或C(图56B)。
由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-GYCACCAACN2WSTTCATCCTSWN2GCTG-3’其中S是G或C，Y是C或T，W是A或T，H是A，C或T，N2是I(图7T2A)。
由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列(图8T7A)是具有下式的碱基序列5’-ASN2SAN2RAAGSARTAGAN2GAN2RGGRTT-3’其中R是A或G，S是G或C，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-AAYCCYN2TCN2TCTAYTSCTTYN2TSN2ST-3’其中Y是C或T，N2是I，S是G或C(图8)。
由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-TGN2TSSTKMTN2GSN2GTKGTN2GGN2AA-3’其中S是G或C，K是G或T，M是A或C，N2是I(图9TM1-A2)。
由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列(图10TM3-B2)是具有下式的碱基序列5’-AYCKGTAYCKGTCCAN2KGWN2ATKGC-3’其中Y是C或T，K是G或T，W是A或T，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-GCMATN2WCMN2TGGACMGRTACMGRT-3’其中M是A或C，W是A或T，R是A或G，N2是I(图10)。
由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-CATKKCCSTGGASAGN2TAYN2TRGC-3’其中K是G或T，S是G或C，Y是C或T，R是A或G，N2是I(图11TM3-C2)。
由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列(图12TM6-E2)是具有下式碱基序列5’-GWWGGGSAKCCAGCASAN2GGCRAA-3’其中W是A或T，S是G或C，K是G或T，R是A或G，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TTYGCCN2TSTGCTGGMTSCCCWWC-3’其中Y是C或T，S是G或C，M是A或C，W是A或T，N2是I(图12)。
由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-ARYYTN2GCN2N2TN2GCN1GAY-3’其中R是A或G，Y是C或T，N1是A，T，G或C，N2是I(图13TM2F18)。
由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列(图14TM6R21)是具有下式的碱基序列5’-N2GGN2AN2CCARCAN1AN1N1RN1RAA-3’其中R是A或G，N1是A，T，G或C，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TTYN1YN1N1TN1TGYTGGN2TN2CCN2-3’其中Y是C或T，N1是A，T，G或C，N2是I(图14)。
由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列是具有下式的碱基序列5’-GCCTSN2TN2RN2SATGWSTGTGGAN2MGN2T-3’其中S是G或C，R是A或G，W是A或T，M是A或C，N2是I(图15S3A)。
由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列(图16S6A)是具有下式的碱基序列5’-GAWSN2TGMYN2AN2RTGGWAGGGN2AN2CCA-3’，其中W是A或T，S是G或C，M是A或C，Y是C或T，R是A或G，N2是I，它互补于具有下式的核苷酸序列5’-TGGN2TN2CCCTWCCAYN2TN2RKCAN2SWTC-3’其中W是A或T，Y是C或T，R是A或G，K是G或T，S是G或C(图16)。
在一特定的实施方案中，在以上提到的SEQ ID NO中的符号(R，Y，M，K，S，W，H，V和N)表明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换句话说，SEQ ID NO1到SEQ ID NO19是简并核苷酸引物。
由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列(图1HS-1)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜(转膜)区氨基酸序列DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人的TRH受体蛋白质(HTRHR)，源于人的RANTES受体蛋白质(L10918，HUMRANTES)，源于人Burkitt淋巴瘤的具有未知配体的受体蛋白质(X68149，HSBLR1A)，源于人的生长抑素受体蛋白质(L14856，HUMSOMATO)，源于大鼠的μ-阿片样物质受体蛋白质(U02083，RNU02083)，源于大鼠的κ-阿片样物质受体蛋白质(U00442，U00442)，源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482，HUMNMBR)，源于人的毒蕈硷乙酰胆硷受体蛋白质(X15266，HSHM4)，源于大鼠的血清素α1B受体蛋白质(L08609，RATAADRE01)，源于人的生长抑素3受体蛋白质(M96738，HUMSSTR3X)，源于人的C5a受体蛋白质(HUMCSAAR)，源于人的具有未知配体的受体蛋白质(HUMRDC1A)，源于人的具有未知配体的受体蛋白质(M84605，HUMOPIODRE)，源于大鼠的的血清素α2B受体蛋白质(M91466，RATA2BAR)等[图1]。
由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列(HS-1)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于小鼠的的具有未知配体的受体蛋白质，(M80481，MUSGIR)，源于人的的铃蟾肽受体蛋白质，(L08893，HUMBOMB3S)，源于人的腺苷A2受体蛋白质(S46950，S46950)，源于小鼠的具有未知配体的受体蛋白质(D21061，MUSGPCR)，源于小鼠的TRH受体蛋白质(S43387，S43387)，源于大鼠的神经调节肽K受体蛋白质(J05189，RATNEURA)，源于大鼠的腺苷Al受体蛋白质(M69045，RATA1ARA)，源于人的神经激肽受体蛋白质(M57414，HUMNEKAR)，源于大鼠的腺苷A3受体蛋白质(M94152，RATADENREC)，源于人的生长抑素1受体蛋白质(M81829，HUMSTRI1A)，源于人的神经激肽3受体蛋白质(S86390，S86371S4)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(X61496，RNCGPCR)，源于人的生长抑素 4受体蛋白质(L07061，HUMSSTR4Z)，源于大鼠的GnRH受体蛋白质(M31670，RATGNRHA)等[图2]。
由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列(图33A)或由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列(图33B)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于小鼠的κ-阿片样物质受体蛋白质(L11064)，源于小鼠的δ-阿片样物质受体蛋白质(L11065)，源于大鼠的μ-阿片样物质受体蛋白质(D16349)，源于小鼠的缓激肽B2受体蛋白质(X69676)，源于大鼠的缓激肽B2受体蛋白质(M59967)，源于小鼠的铃蟾肽受体蛋白质(M35328)，源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482)，源于人的胃泌素释放肽受体蛋白质(M73481)，源于人的铃蟾肽受体蛋白质亚型3(L08893)，源于小鼠的物质K受体蛋白质(X62933)，源于小鼠的物质P受体蛋白质(X62934)，源于大鼠的神经激肽3受体蛋白质(J05189)，源于大鼠的内皮素受体蛋白质(M60786)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(L04672)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(X61496)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(X59249)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(L09249)，源于小鼠的具有未知配体的受体蛋白质(P30731)，源于人的具有未知配体的受体蛋白质(M31210)，源于人的具有未知配体的受体蛋白质(U03642)等[图3]。
由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列(图43C)或由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列(图43D)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于小鼠的血管紧张肽II受体蛋白质(L32840)，源于大鼠的血管紧张肽Ib受体蛋白质(X64052)，源于大鼠的血管紧张肽受体蛋白质亚型(M90065)，源于人的血管紧张肽Ia受体蛋白质(M91464)，源于大鼠的缩胆囊素 受体蛋白质(M88096)，源于大鼠的缩胆囊素B受体蛋白质(M99418)，源于人的缩胆囊素B受体蛋白质(L04473)，源于小鼠的低低亲和性白介素8受体蛋白质(M73969)，源于人的高亲和性白介素8受体蛋白质(X65858)，源于小鼠的C5a过敏毒素受体蛋白质(S46665)，源于人的N-甲酰基肽受体蛋白质(M60626)等〔图4〕。
由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列(图T2A)或由SEQ ID NO是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如人galanin受体(HUMGALAREC)，大鼠-α-1B-肾上腺素能受体(RATADR1B)，人β-L-肾上腺素能受体(HUMADRB1)，兔IL-8受体(RABIL8RSB)，人阿片样物质受体(HUMOPIODRE)，牛物质K受体(BTSKR)，人生长抑素受体2(HUMSRI2A)，人生长抑素受体3(HUMSSTR3Y)，人胃泌素受体(HUMGARE)，人缩胆囊素受体(HUMCCKAR)，人多巴胺受体-D5(HUMD1B)，人血清素受体SHT1E(HUMSHT1E)，人多巴胺受体D4(HUMD4C)，小鼠血清素2(MMSERO)，大鼠α-1A-肾上腺素能受体(RATADRA1A)，(557565)大鼠histamine H2受体同时如同[图7]。
由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列(互补于图5 6A)或由SEQ IDNO9代表的核苷酸序列(互补于图5 6B)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列(图5)的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于小鼠的κ-阿片样物质受体蛋白质(L11064)，源于小鼠的δ-阿片样物质受体蛋白质(L11065)，源于大鼠的μ-阿片样物质受体蛋白质(D16349)，源于小鼠的缓激肽B2受体蛋白质(X69676)，源于大鼠的缓激肽B2受体蛋白质(M59967)，源于小鼠的铃蟾肽受体蛋白质(M35328)，源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482)，源于人的胃泌素释放肽受体蛋白质(M73481)，源于人的铃蟾肽受体蛋白质亚型3(L08893)，源于小鼠的物质K受体蛋白质(X62933)，源于小鼠的物质P受体蛋白质(X62934)，源于大鼠的神经激肽3受体蛋白质(J05189)，源于大鼠的内皮素受体蛋白质(M60786)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(L04672)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(X61496)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(X59249)，源于大鼠的具有未知配体的受体蛋白质(L09249)，源于小鼠的具有未知配体的受体蛋白质(P30731)，源于人的具有未知配体的受体蛋白质(M31210)，源于人的具有未知配体的受体蛋白质(U03642)等[图5]。
由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列(互补于图6 6C)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列(图6)的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于小鼠的血管紧张肽II受体蛋白质(L32840)，源于大鼠的血管紧张肽Ib受体蛋白质(X64052)，源于大鼠的血管紧张肽受体蛋白质亚型(M90065)，源于人的血管紧张肽Ia受体蛋白质(M91464)，源于大鼠的缩胆囊素受体蛋白质(M88096)，源于大鼠的缩胆囊素B受体蛋白质(M99418)，源于人的缩胆囊素8受体蛋白质(L04473)，源于小鼠的低亲和性白介素8受体蛋白质(M73969)，源于人的高亲和性白介素8受体蛋白质(X65858)，源于小鼠的C5a过敏毒素受体蛋白质(S46665)，源于人的N-甲酰基肽受体蛋白质(M60626)等[图6]。
由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列(图8T7A)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第七跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列(图8)的核苷酸序列，所述蛋白质例如人galanin受体(HUMGALAREC)，大鼠Al腺苷受体(RAT1DREC)，猪血管紧张肽受体(PIGA2R)，大鼠血清素受体(RATSHTRTC)，人多巴胺受体(S58541)，人胃泌素释放肽受体(HUMGRPR)，小鼠GRP/铃蟾肽受体(MUSGRPBOM)，大鼠脉管1型血管紧张肽受体(RRVT1AIIR)，人毒蕈硷乙酰胆硷受体(HSHM4)，人β-1肾上腺素能受体(HUMDRB1)，人胃泌素受体(HUMGARE)，大鼠缩胆囊素受体(RATCCKAR)，大鼠具有未知配体的受体(S59748)，人生长抑素受体(HUMSST28A)，大鼠具有未知配体的受体(RNGPROCR)，小鼠生长抑素受体-I(MUSSRI1A)，人α-Al-肾上腺素能受体(HUMA1AADR)，小鼠δ-阿片样物质受体(S66181)，人生长抑素受体3(HUMSSTR3Y)等[图8]。
由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列(图9TM1-A2)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第1跨膜区(转膜区)氨基酸序列之DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于小鼠的缓激肽B2受体(MUSBB2R)，源于牛的物质K受体(BTSKR)，源于牛的内皮素ETB受体(BOVEETBR)，源于人的神经肽Y受体(MMSUBKREC)，源于人的前列腺素E2受体(HUMPGE2R)，源于人的前列环素受体(HUMPIR)，源于人的κ-阿片样物质受体(HSU11053)，源于大鼠的melanocortin 3受体(RRMC3RA)，源于人的melanocortin受体(HUMMR)，源于小鼠的铃蟾肽 GRP受体(MUSGRPBOM)，源于大鼠的缩胆囊素B受体(RATCHOLREC)，源于大鼠的缩胆囊素受体(RATCCKAR)等[图9]。
由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列(图10TM3-B2)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列(图10)的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人的缩胆囊素受体(HUMCCKR)，源于人的缩胆囊素B受体(HUMCCKBGR)，源于小鼠的melanocortin 5受体(MMGMCSR)，源于人的后叶加压素受体(HUMV2R)，源于大鼠的神经调节肽K受体(RATNEURA)，源于狗的胃泌素受体(DOGGSTRN)，源于大鼠的血清素受体(RATSHTSA)，源于小鼠的α2-血清素受体(MUSALP2ADA)，源于人的腺苷A1受体(HUMADORA1X)，源于人的阿片样物质(假定)受体(HUMOPIODRE)，源于小鼠的铃蟾肽/GRP受体(MUSGRPBOM)，源于大鼠的缩胆囊素受体(RATCCKAR)，源于人的TRH受体(HSTRHREC)等[图10]。
由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列(图11TM3-C2)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人的神经激肽3受体(HUMNK3R)，源于人的催产素受体(HSMRNAOXY)，源于天竺鼠的缩胆囊素受体(S68242)，源于狗的具有具有未知配体的缩胆囊素受体(CFGPCR4)，源于小鼠的物质P受体(MMSUBPREC)，源于人的具有未知配体的受体(HUMOPIODRE)，源于人的galanin受体(HUMGALAREC)，源于人的血清素受体(HSS31G)，源于人的β3肾上腺素受体(HUMARB3A)，源于人的前列环素受体(HUMHPR)，源于大鼠的缩胆囊素A受体(RATCCKAR)等[图11]。
由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列(图12TM6-E2)是互补于高度同源于编码已知G蛋白偶联受体第六跨膜区内氨基酸序列之DNA序列的核苷酸序列(图12)的核苷酸序列，所述受体例如源于人的神经激肽受体(HUMNEKAR)，源于人的物质P受体(HUMSUBPRA)，源于大鼠的物质K受体(RATSKR)，源于小鼠的铃蟾肽GRP受体(MUSGRPBOM)，源于人的阿片样物质(假定)受体(HUMOPIODRE)，源于人的腺苷A2受体(HUMA2XXX)，源于人的β2-血清素受体(HUMADRBR)，源于犬的具有未知配体的受体RDC5(CFGPCR8)，源于人的内皮素受体(HUMETSR)，源于小鼠的神经肽Y1受体(MMNPY1CDS)，源于人的催产素受体(HSMRNAOXY)，源于大鼠的缩胆囊素受体(RATCCKAR)等[图12]。
由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列(图13TM2F18)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人的TSH受体(HUMTSHX)，源于人的神经激肽受体(HUMNEKAR)，源于人的FMLP受体(HUMFMLP)，源于人的IL8受体B(HUMINTLEU8)，源于人的α-Al肾上腺素能受体(HUMA1AADR)，源于人的IL8受体A(HUMIL8RA)，源于人的多巴胺D2受体(HSDD2)，源于人的血管紧张肽I型受体(HUMANTIR)，源于人的生长抑素受体(HUSOMAT)，源于人的TRH受体(HSTRHREC)，源于人的δ-阿片样物质受体(HSU07882)等[图13]。
由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列(图14TM6R21)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列(图14)的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人的β-肾上腺素能受体(HSBAR)，源于人的神经激肽受体(HUMNEKAR)，源于人的内皮素-1受体(HUMETN1R)，源于人的组胺H2受体(HUMHISH2R)，源于人的α-Al肾上腺素能受体(HUMA1AADR)，源于人的IL8受体(HUMIL8RA)，源于人的神经调节肽B受体(HUMNMBR)，源于人的神经激肽1受体(HUMNKIRX)，源于人的物质P受体(HUMSUBPRA)，源于人的5-HT1D血清素受体(HUMSHT1DA)，源于人的甲酰基肽受体(HUMPFPR2A)，源于人的多巴胺D2受体(HSDD2)，源于人的神经肽Y受体(HUMNEUYREC)，源于人的腺苷A2受体(HUMA2XXX)，源于人的缓激肽受体BK-2(HUMBK2A)，源于人的FMLP-相关受体II(HUMFMLPX)，源于人的生长抑素受体亚型3(HUMSSTR3X)，源于人的缩胆囊素受体(HUMCCKR)，源于人的神经降压素受体(HSNEURA)等[图14]。
由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列(图15S3A)是高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人的galanin受体(HUMGALAREC)，源于人的CCK-B受体(S70057)，源于人的ETA受体(S67127)，源于人的ETB受体(S44866)，源于人的C5A受体(HUMC5AAR)，源于人的血管紧张肽II受体(HUMANTIR)，源于人的缓激肽受体(HUMBK2R)，源于人的神经降压素受体(HSNEURA)，源于人的GRP受体(HUMGRPR)，源于人的生长抑素5受体(HUMFSRS)，源于人的IL-8受体(HUMIL8RA)，源于人的神经激肽2(神经激肽A))受体(HUMNEKAR)等[图15]。
由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列(图16S6A)是互补于高度同源于编码相应于或接近各已知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA的核苷酸序列(图16)的核苷酸序列，所述蛋白质例如源于人galanin受体(HUMGLAREC)，源于人的CCK-B受体(S70057)，源于人的ETA受体(S67127)，源于人的ETB受体(S44866)，源于人的C5A受体(HUMCSAAR)，源于人的血管紧张肽II受体(HUMANTIR)，源于人的缓激肽受体(HUMBK2R)，源于人的神经降压素受体(HSNEURA)，源于人的GRP受体(HUMGRPR)，源于人的生长抑素5受体(HUMFSRS)，源于人的IL-8受体(HUMIL8RA)，源于人的神经激肽2(神经激肽A))受体(HUMNEKAR等[图16]。
在括号中的以上的缩写是标识符(参考号)，用DNASIS基因/蛋白质序列数据库(CD019、Hitachi软件工程、日本)检索GenBank EMBL数据库时指定，通常称为“入藏号”或者“登记名”。而HTRHR是在日本未决专利出版物286986/1993(EPA 638645)中公开的序列。
可以用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法经DNA合成制备本发明的DNA(或核苷酸序列)。本发明的DNA(或核苷酸序列)可以是具有8-60个碱基，优选的是具有12-50个碱基，更优选的是15-40个碱基，最优选的是18-30个碱基的寡核苷酸序列。
在本发明的DNA中，具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO12所示核苷酸序列之DNA是这样一种核苷酸序列，其通常存在于编码相应于或接近以上提到的已知G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区氨基酸序列之DNA序列中。因此，它可以与编码相应于或接近已知或未知G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(包括基因组DNA，cDNA)互补结合(即，是可杂交的)，而且，它也可以与编码其它跨膜区的核苷酸序列互补结合(即，是可杂交的)。
具有SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO14或SEQ ID NO18所示核苷酸序列之DNA是这样一种核苷酸序列，其通常存在于编码相应于或接近以上提到的已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA序列中。因此，它可以与编码相应于或接近已知或未知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区的部分之RNA或DNA(包括基因组DNA，cDNA)互补结合，而且，它也可以与编码其它跨膜区的核苷酸序列互补结合。
具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO16所示核苷酸序列之DNA是这样一种核苷酸序列，其通常存在于编码相应于或接近以上提到的已知G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区氨基酸序列之DNA序列中。因此，它可以与编码相应于或接近已知或未知G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区的部分之RNA或DNA(包括基因组DNA，cDNA)互补结合，而且，它也可以与编码其它跨膜区的核苷酸序列互补结合。
具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17或SEQ ID NO19所示核苷酸序列之DNA是这样一种核苷酸序列，其通常存在于编码相应于或接近以上提到的已知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA序列中。因此，它可以与编码相应于或接近已知或未知G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区的部分之RNA或DNA(包括基因组DNA，cDNA)互补结合，而且，它也可以与编码其它跨膜区的核苷酸序列互补结合。
具有SEQ ID NO11所示核苷酸序列之DNA是这样一种核苷酸序列，其通常存在于编码相应于或接近以上提到的已知G蛋白偶联受体蛋白质第七跨膜区氨基酸序列之DNA序列中。因此，它可以与编码相应于或接近已知或未知G蛋白偶联受体蛋白质第七跨膜区的部分之RNA或DNA(包括基因组DNA，cDNA)互补结合，而且，它也可以与编码其它跨膜区的核苷酸序列互补结合。
具有SEQ ID NO13所示核苷酸序列之DNA是这样一种核苷酸序列，其通常存在于编码相应于或接近以上提到的已知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA序列中。因此，它可以与编码相应于或接近已知或未知G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区的部分之RNA或DNA(包括基因组DNA，cDNA)互补结合，而且，它也可以与编码其它跨膜区的核苷酸序列互补结合。
因此，本发明的DNA(或核苷酸序列)可以用作聚合酶链反应(此后有时称作PCR)的DNA引物，例如(i).经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)小量的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(或DNA片段)，所说DNA(或DNA片段)用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii).经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)小量的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(或DNA片段)，所说DNA(或DNA片段)用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和
(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
由此，扩增编码所说受体蛋白质之DNA(或DNA片段)是可能的。
当用至少一种DNA引物(该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物)进行PCR时，所说DNA引物与在编码G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区或其它跨膜区之模板RNA或DNA(或其片段)的+链(正链)3’侧的核苷酸序列结合(杂交)，在其上一链(负链)以5’→3’方向延伸。
当用至少一种选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物的DNA引物进行PCR时，所说DNA引物与在编码G蛋白偶联受体蛋白质第七跨膜区或其它跨膜区之模板RNA或DNA(或其片段)的+链(正链)3’侧的核苷酸序列结合(杂交)，在其上-链(负链)以5’→3’方向延伸。
当用至少一种选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物的DNA引物进行PCR时，所说DNA引物与在编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区或其它跨膜区之模板RNA或DNA(或其片段)的+链(正链)3’侧的核苷酸序列结合(杂交)，在其上-链(负链)以5’→3’方向延伸。
当用至少一种选自具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物的DNA引物进行PCR时，所说DNA引物与在编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区或其它跨膜区之模板RNA或DNA(或其片段)的+链(正链)3’侧的核苷酸序列结合(杂交)，在其上-链(负链)以5’→3’方向延伸。
当用至少一种DNA引物(该DNA引物选自具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物)进行PCR时，所说DNA引物与在编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区或其它跨膜区之模板RNA或DNA(或其片段)的+链(正链)3’侧的核苷酸序列结合(杂交)，在其上-链(负链)以5’→3’方向延伸。
因此，当本发明的具有SEQ ID NO1到SEQ ID NO19任一代表的核苷酸序列之DNA引物相互组合使用时，编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(或DNA片段)可以被成功地扩增。
本发明的一个实施方案是提供(A)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第一到第六跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；(B)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第一到第七跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，
(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；(C)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第二到第六跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；(D)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第二到第七跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；(E)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第三到第六跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；(F)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第三到第七跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；(G)一种扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(例如，从所说G蛋白偶联受体蛋白质的第一到第三跨膜(转膜)区或其它区段)的方法，其特征在于经混合下列物质进行聚合酶链反应
(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA用作模板，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
在按照以上提到的(A)的扩增中，DNA引物更优选的组合的一个例子包括具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物与具有由SEQID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物的组合等。
在按照以上提到的(D)的扩增中，DNA引物更优选的组合的一个例子包括具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物与具有由SEQID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物的组合等。
在按照以上提到的(E)的扩增中，DNA引物更优选的组合的一个例子包括(i)具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物或具有由SEQID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物与具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物或具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物的组合等。
(ii)具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物或具有由SEQID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物与具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物的组合等。
在按照以上提到的(G)的扩增中，DNA引物更优选的组合的一个例子包括具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物与具有由SEQID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物的组合等。
可以按已知的PCR技术进行扩增。例如，可以用Saikl，R.K.等，科学(Science)，239487-491(1988)描述的方法进行。可以依据靶DNA和其它因素适当地选择PCR扩增中的温度、时间、缓冲液、反应循环数、2’-脱氧-7-脱氮-2-脱氧鸟苷三磷酸或肌苷的添加等。当RNA用作模板时，可以用例如Saikl，R.K.等，科学(Science)，239487-491(1988)描述的方法进行PCR扩增。
而且，本发明的具有由SEQ ID NO1或SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA可以与在编码相应于或接近G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区氨基酸序列之DNA的-链3’侧的核苷酸序列选择性地和互补性地结合(杂交)；本发明的具有由SEQ ID NO10或SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA可以与在编码相应于或接近G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区氨基酸序列之DNA的-链3’侧的核苷酸序列选择性地和互补性地结合(杂交)；本发明的具有由SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO14或SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA可以与在编码相应于或接近G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA的-链3’侧的核苷酸序列选择性地和互补性地结合(杂交)；本发明的具有由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17或SEQ IDNO19代表的核苷酸序列的DNA可以与在编码相应于或接近G蛋白偶联受体蛋白质第六跨膜区氨基酸序列之DNA的+链3’侧的核苷酸序列选择性地和互补性地结合(杂交)；本发明的具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA可以与在编码相应于或接近G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA的+链3’侧的核苷酸序列选择性地和互补性地结合(杂交)；本发明的具有由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA可以与在编码相应于或接近G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区氨基酸序列之DNA的+链3’侧的核苷酸序列选择性地和互补性地结合(杂交)，因此，所说DNA用作从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质部分或全部肽序列之DNA(或DNA片段)的探针也是特别有用的。
由于本发明的DNA可以用作探针，经采用其作为反应剂的从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质部分或全部肽序列之DNA(或DNA片段)的这些筛选可以按本领域技术人员已知道的DNA克隆方法或类似的方法进行。特别是，当本发明的DNA用作PCR引物时，扩增和筛选筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(或DNA片段)两者可在一个步骤中进行。
由此，当本发明的DNA适当组合和用作PCRDNA引物时，所说的DNA引物与编码G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜(跨膜)区、第二转膜区、第三转膜区、第六转膜区、第七转膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)结合，扩增例如下列物质(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(2)编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(3)编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(4)编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(5)编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(6)编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(7)编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第三跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)，(8)编码G蛋白偶联受体蛋白质其它跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)。
通过采用本发明的DNA引物，可以成功地获得从DNA文库选择性扩增下列物质(1)编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)；(2)编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)；(3)编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)；(4)编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)；(5)编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)或编码其其它跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)；(6)编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)；(7)编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第三跨膜区氨基酸序列之RNA或DNA(或其片段)。
与常规的引物不同，本发明的DNA引物中下列组合能够选择性扩增G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第六跨膜区或其它区的广泛的区域(1)具有由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物；与(2)至少一种选自下组的DNA引物组合具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ IDNO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物。
与常规的引物不同，本发明的DNA引物中下列组合能够选择性扩增G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第七跨膜区或其它区的广泛的区域(1)具有由SEQ ID NO1或SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；与(2)具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物组合。
与常规的引物不同，本发明的DNA引物中下列组合能够选择性扩增G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第六跨膜区或其它区的广泛的区域(1)具有由SEQ ID NO10或SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物；与(2)至少一种选自下组的DNA引物组合具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ IDNO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物。
与常规的引物不同，本发明的DNA引物中下列组合能够选择性扩增G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第七跨膜区或其它区的广泛的区域(1)具有由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物；与(2)具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物组合。
与常规的引物不同，本发明的DNA引物中下列组合能够选择性扩增G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区或其它区的广泛的区域(1)至少一种选自下组的DNA引物具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ IDNO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；与(2)具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物组合。
因此，现在可以更清楚地考虑G蛋白偶联受体蛋白质的蛋白质疏水图以及G蛋白偶联受体蛋白质和其它类似受体蛋白质之间氨基酸水平或核酸水平上的同源性。
在本发明的DNA引物中，(1)至少一种选自下组的DNA引物具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；与(2)至少一种选自下组的DNA引物具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物组合，不仅与常规的DNA引物一样能够同时扩增G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区的广泛的区域，而且能够更有选择地和更有效地扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，尽管这种扩增经常规DNA引物未曾达到过。
此外，在本发明的DNA引物中，(1)至少一种选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物的DNA引物；与(2)具有由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物组合，与常规的DNA引物一样能够同时扩增G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第三跨膜区的广泛的区域。
然后，可以将下列扩增的DNA(或其片段)作为探针，按照本领域技术人员已知道的方法或类似的方法从DNA文库筛选完全编码G蛋白偶联受体蛋白质之全长DNA(a)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第六跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)；(b)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第七跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)；(c)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第六跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)；(d)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)；(e)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第六跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)；(f)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第七跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)；(g)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第三跨膜区的氨基酸序列之DNA(或其片段)或(h)扩增的编码G蛋白偶联受体蛋白质其它区的氨基酸序列之DNA(或其片段)。用于本发明的DNA文库包括任何基因组DNA文库、cDNA库和RNA库。本文使用的“DNA文库”指包含所有那些文库的DNA文库。
本发明还提供了从包含编码受体蛋白质之DNA(或其片段)的DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之靶DNA(或其片段)的方法，该方法包括用本发明的DNA作为PCR的DNA引物。
本发明的一个优选的实施方案是从DNA文库克隆完全编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之全长DNA的方法，该方法包括下列步骤(i)用本发明的DNA为PCR DNA引物；(ii)在所说DNA引物与DNA文库的混合物存在下进行PCR，以扩增和选择(即筛选)下列DNA片段编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列的DNA片段、编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列的DNA片段、编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列的DNA片段、编码G蛋白偶联受体蛋白质第三跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列的DNA片段、编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第六跨膜区氨基酸序列的DNA片段、编码G蛋白偶联受体蛋白质第二跨膜区到第七跨膜区氨基酸序列的DNA片段、编码G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区到第三跨膜区氨基酸序列的DNA片段或编码G蛋白偶联受体蛋白质其它区的DNA片段；和(iii)用以上步骤(ii)获得的DNA片段为探针按照本领域技术人员已知道的方法或类似的方法从DNA文库克隆所说的全长DNA。
本发明的一个优选的实施方案是从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物，和
(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物。
本发明更优选的实施方案包括1.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜区到第六转膜区的区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜区到第六转膜区的区或其其它区)之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；2.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜区到第七转膜区的区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜区到第七转膜区的区或其其它区)之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；3.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第二转膜区到第六转膜区的区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第二转膜区到第六转膜区的区或其其它区)之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；4.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第二转膜区到第七转膜区的区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第二转膜区到第七转膜区或其其它区)之DNA
(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；5.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第三转膜区到第六转膜区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第三转膜区到第六转膜区或其其它区)之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；6.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第三转膜区到第七转膜区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第三转膜区到第七转膜区或其其它区)之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、具有由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物；7.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜区到第三转膜区或其其它区)的DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列和类似物(例如，包括G蛋白偶联受体蛋白质第一转膜区到第三转膜区或其其它区)之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；本发明特别优选的实施方案包括8.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA(1)所说的DNA文库，
(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物；9.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物；10.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物，和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物；11.从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA的方法，该方法包括在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，以选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列之DNA(1)所说的DNA文库，(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物，和
(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物。
可以分析(通常是经限制性酶分析)和/或测序克隆的DNA。
在使用本发明的DNA的扩增中和用PCR技术的筛选中，编码G蛋白偶联受体蛋白质之靶RNA或DNA(或其片段)可以包括编码已知(或现有技术的)G蛋白偶联受体蛋白质之RNA、DNA或其片段，以及编码未知(或新的)G蛋白偶联受体蛋白质之RNA、DNA或其片段。
这些靶RNA或DNA(或其片段)可以包括新的核苷酸序列和已知的核苷酸序列。
这种核苷酸序列的例子是编码G蛋白偶联受体蛋白质之RNA或DNA(或其片段)，所说源于脊椎动物(如小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴、人等)、昆虫或其它无脊椎动物(如果蝇、蚕、甘蓝夜蛾等)、植物(水稻、小麦、烟草等)的所有细胞和组织(垂体、脑、胰腺、肺、肾上腺等)以及来源于它们的细胞系等。
特定的核苷酸序列的例子是编码G蛋白偶联受体蛋白质的RNA或DNA(或片段)，所说的蛋白质例如血管紧张肽、铃蟾肽、canavinoid、缩胆囊肽、谷酰胺、血清素、褪黑激素、神经肽Y、阿片样物质、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管作用肠肽和关联肽)、生长抑素、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、adrenomedullin、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰腺多肽和galanin、其家族的成员等。
在采用本发明的DNA的PCR扩增中，用作模板的所说DNA(或其片段)可以包括任何DNA，只要其源于上述组织和细胞。更具体地说，所说的模板DNA(或DNA片段)包括基因组DNA、基因组DNA文库、源于所说组织和细胞的cDNA和源于所说组织和细胞的cDNA文库。源于所说组织和细胞的cDNA文库特别合适。用于所说DNA文库的载体可以包括任何噬菌体、质粒、粘粒、噬粒等。用从所说组织和细胞制备的mRNA经反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)直接扩增模板DNA(或DNA片段)也是可能的。用作模板的DNA可以是完全编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA或其DNA片段(或区段)。
优选地，经筛选本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法(其中采按照用本发明的DNA)获得的阿DNA片段是包含在所使用的DNA文库中的编码G蛋白偶联受体蛋白质之RNA或DNA(或其片段)。更具体地说，它是编码G蛋白偶联受体蛋白质之RNA或DNA或RNA片段或DNA片段(此后，常常仅缩写为“DNA”)，所说的蛋白质例如下列受体血管紧张肽受体、铃蟾肽受体、canavinoid受体、缩胆囊肽受体、谷酰胺受体、血清素受体、褪黑激素受体、神经肽Y受体、阿片样物质受体、嘌呤受体、后叶加压素受体、催产素受体、VIP(血管作用肠肽和关联肽)受体、生长抑素受体、多巴胺受体、胃动素受体、淀粉不溶素受体、缓激肽受体、CGRP(降钙素基因相关肽)受体、adrenomedullin受体、白三烯受体、胰抑制素受体、前列腺素受体、血栓烷受体、腺苷受体、肾上腺素受体、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)受体、内皮素受体、肠抑胃素受体、组胺受体、神经降压素受体、TRH受体、胰腺多肽受体和galanin受体、它们的家族成员受体等。
当由本发明的筛选方法获得的DNA是部分编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA片段时，用所说的DNA片段作为探针按照已知的克隆技术从合适的DNA文库分离完全编码所说的DNA片段之DNA是可能的。
克隆完全编码DNA片段之DNA的方法可以包括采用具有部分编码G蛋白偶联受体蛋白质的部分核苷酸序列之合成DNA引物的PCR扩增和经用具有所说DNA片段部分或全部区的DNA或合成DNA杂交的靶DNA选择。可以用例如《分子克隆》(Molecular Cloning)(第二版，J.Sanbrook等，Cold Spring Harbor Lab.出版社，1989)中描述的方法进行杂交。当使用市售文库时，可以按照其中所附的方案进行。
可以使用完全编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA(全长G蛋白偶联受体蛋白质DNA)，依据其目的，可以使用其本身或者在用限制性酶消化后或(如果需要)用接头连接后使用。5’-末端上的ATG为翻译起始密码子，3’-末端上的TAA、TGA或TAG为翻译终止密码子。也可以用合适的合成DNA衔接子添加这些翻译起始密码子和翻译终止密码子。此外，以所说的DNA为探针经RNA印迹确定所说的受体蛋白质表达组织/细胞是可能的。经与合适的启动子连接后，将具有所说受体蛋白质全编码区的DNA引入到动物细胞中表达靶受体蛋白质也是可能的。
按照本发明的G蛋白偶联受体蛋白质是由编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质，所说的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA是经本发明的筛选方法获得的。更具体地说，按照本发明的G蛋白偶联受体蛋白质包括例如以下一些G蛋白偶联受体蛋白质血管紧张肽受体蛋白质、铃蟾肽受体蛋白质、canavinoid受体蛋白质、缩胆囊肽受体蛋白质、谷酰胺受体蛋白质、血清素受体蛋白质、褪黑激素受体蛋白质、神经肽Y受体蛋白质、阿片样物质受体蛋白质、嘌呤受体蛋白质、后叶加压素受体蛋白质、催产素受体蛋白质、VIP(血管作用肠肽和关联肽)受体蛋白质、生长抑素受体蛋白质、多巴胺受体蛋白质、胃动素受体蛋白质、淀粉不溶素受体蛋白质、缓激肽受体蛋白质、CGRP(降钙素基因相关肽)受体蛋白质、adrenomedullin受体蛋白质、白三烯受体蛋白质、胰抑制素受体蛋白质、前列腺素受体蛋白质、血栓烷受体蛋白质、腺苷受体蛋白质、肾上腺素受体蛋白质、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)受体蛋白质、内皮素受体蛋白质、肠抑胃素受体蛋白质、组胺受体蛋白质、神经降压素受体蛋白质、TRH受体蛋白质、胰腺多肽受体和galanin受体、其家族的成员等。
按照本发明，新的G蛋白偶联受体蛋白质、源于所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽区段或片段、其修饰衍生物或类似物和其盐可以被识别、克隆、产生、分离和确定特征。
这些G蛋白偶联受体蛋白质是源于温血动物(例如，天竺鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴、人、兔、猫、狗、马等)的任何细胞和组织(例如垂体、胰腺、脑、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心等)的那些蛋白质和包含选自下组的氨基酸序列的任何蛋白质由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、由SEQ IDNO25代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列、由SEQID NO27代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO28代表的氨基酸序列、由SEQID NO34代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO35代表的氨基酸序列、由SEQID NO38代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列、由SEQID NO56代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO34、SEQ IDNO35、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39和/或SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的实质上的等价物。
在本发明的一个实施方案中，G蛋白偶联受体蛋白质是源于温血动物(例如，天竺鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴、人、兔、猫、狗、马等)的任何细胞和组织(例如垂体、胰腺、脑、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心等)的那些蛋白质和包含选自下组的氨基酸序列的任何蛋白质由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO25代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列、由SEQ IDNO28代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ IDNO26、SEQ ID NO27或SEQ ID NO28代表的氨基酸序列的实质上的等价物。这些G蛋白偶联受体蛋白质可以包括具有选自下组的氨基酸序列的蛋白质由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO25代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO28代表的氨基酸序列；其中其氨基酸序列约90％到99.9％同源于下组氨基酸序列的蛋白质由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO25代表的氨基酸序列、由SEQ IDNO26代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列、由SEQID NO28代表的氨基酸序列，并且其蛋白质的活性实质上等价于具有下列氨基酸序列的蛋白质由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、由SEQ IDNO25代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO26代表的氨基酸序列、由SEQID NO27代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO28代表的氨基酸序列等。实质上等价的活性可以包括配体结合活性、信号信息传递等。术语“实质上等价于”或“实质上等价的”指配体结合活性等是等价的。因此，允许存在级别(例如配体结合亲和力级别和配体结合活性级别)和数量因子(如受体蛋白质分子量)的不同。
在本发明另一个实施方案中，G蛋白偶联受体蛋白质包括源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质，该G蛋白偶联受体蛋白质包含由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列和/或SEQ ID NO25代表的氨基酸序列；源于小鼠胰腺的G蛋白偶联受体蛋白质，该受体蛋白质包含由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列；源于小鼠胰腺的G蛋白偶联受体蛋白质，该受体蛋白质包含由SEQ ID NO28代表的氨基酸序列等。源于人垂体的包含选自由SEQ IDNO24代表的氨基酸序列和SEQ ID NO25代表的氨基酸序列的氨基酸序列之G蛋白偶联受体蛋白质的例子是源于人垂体的由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质等。这些G蛋白偶联受体蛋白质可以包括其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)从SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQID NO26、SEQ ID NO27或SEQ ID NO28的氨基酸序列缺失的蛋白质；其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)添加到SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27或SEQ ID NO28的氨基酸序列上的蛋白质；其中SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ IDNO27或SEQ ID NO28的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个氨基酸残基取代的蛋白质等。
在本发明的另一个实施方案中，G蛋白偶联受体蛋白质包括源于温血动物(例如，天竺鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴、人、兔、猫、狗、马等)的任何细胞和组织(例扁桃体、垂体、胰腺、脑、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肺、消化道、血管、心、胸腺、脾、白血球等)的那些蛋白质和包含选自下组的氨基酸序列的任何蛋白质由SEQ ID NO34代表的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO35代表的氨基酸序列。这些G蛋白偶联受体蛋白质可以包括具有选自下组的氨基酸序列的蛋白质由SEQ IDNO34代表的氨基酸序列或/和由SEQ ID NO35代表的氨基酸序列；其中其氨基酸序列约90％到99.9％同源于下组氨基酸序列的蛋白质由SEQ IDNO34代表的氨基酸序列或/和由SEQ ID NO35代表的氨基酸序列，并且其蛋白质的活性实质上等价于具有下列氨基酸序列的蛋白质由SEQ IDNO34代表的氨基酸序列和/或由SEQ ID NO35代表的氨基酸序列等。实质上等价的活性可以包括配体结合活性、信号信息传递等。术语“实质上等价于”或“实质上等价的”指配体结合活性等是等价的。因此，允许存在级别(例如配体结合亲和力级别和配体结合活性级别)和数量因子(如受体蛋白质分子量)的不同。G蛋白偶联受体蛋白质的例子是源于人扁桃体的包含选自由SEQ ID NO34代表的氨基酸序列和/或SEQ ID NO35代表的氨基酸序列的氨基酸序列之氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质等。这些G蛋白偶联受体蛋白质可以包括其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)从SEQ IDNO34或SEQ ID NO35的氨基酸序列缺失的蛋白质；其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)添加到SEQ ID NO34或SEQ ID NO35的氨基酸序列上的蛋白质；其中SEQ ID NO34或SEQ ID NO35的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个氨基酸残基取代的蛋白质等。
在本发明的另一个实施方案中， G蛋白偶联受体蛋白质包括源于温血动物(例如，天竺鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴、人、兔、猫、狗、马等)的任何细胞和组织(例扁桃体、垂体、胰腺、脑、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肺、消化道、血管、心、胸腺、脾、白血球等)的那些蛋白质和包含由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列或由SEQ IDNO38代表的氨基酸序列的实质上的等同物的任何蛋白质，优选的是由SEQ ID NO39代表G蛋白偶联受体蛋白质氨基酸序列或由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列的实质上的等价物的任何蛋白质。这些G蛋白偶联受体蛋白质可以包括具有由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列的蛋白质；其中其氨基酸序列约90％到99.9％同源于由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列，并且其蛋白质的活性实质上等价于具有SEQ ID NO38代表的氨基酸序列的蛋白质等。这些G蛋白偶联受体蛋白质优选的是具有由SEQ IDNO39代表的氨基酸序列的蛋白质；其中其氨基酸序列约90％到99.9％同源于由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列，并且其蛋白质的活性实质上等价于具有SEQ ID NO39代表的氨基酸序列的蛋白质等。实质上等价的活性可以包括配体结合活性、信号信息传递等。术语“实质上等价于”或“实质上等价的”指配体结合活性等是等价的。因此，允许存在级别(例如配体结合亲和力级别和配体结合活性级别)和数量因子(如受体蛋白质分子量)的不同。
数据表明本发明的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的受体蛋白质(例如SEQ ID NO38和SEQ ID NO39，或者由pMAH2-17编码的蛋白质)是一种明显不同于现有Purinoceptor的新的Purinoceptor亚型。
在本发明的另一个具体的实施方案中，G蛋白偶联受体蛋白质包括源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的包含由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质，和以下一些源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)从SEQ ID NO38的氨基酸序列缺失的蛋白质；其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)添加到SEQ ID NO38的氨基酸序列上的蛋白质；其中SEQ ID NO38的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个氨基酸残基取代的蛋白质等。进一步优选的这些G蛋白偶联受体蛋白质包括源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的包含由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质，和以下一些源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)从SEQ IDNO39的氨基酸序列缺失的蛋白质；其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)添加到SEQ IDNO39的氨基酸序列上的蛋白质；其中SEQ ID NO39的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个氨基酸残基取代的蛋白质等。
在本发明的另一个实施方案中，G蛋白偶联受体蛋白质包括源于人的任何细胞和组织(例如胎盘、生殖腺、扁桃体、垂体、胰腺、脑、肾、肝、甲状腺、胆囊、骨髓、肺、消化道、血管、心、胸腺、白血球等)的那些蛋白质和包含由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列或由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的实质上的等价物的任何蛋白质。这些G蛋白偶联受体蛋白质可以包括具有由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的蛋白质；其中其氨基酸序列约90％到99.9％同源于由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列，并且其蛋白质的活性实质上等价于具有SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的蛋白质等。实质上等价的活性可以包括配体结合活性、信号信息传递等。术语“实质上等价于”或“实质上等价的”指配体结合活性等是等价的。因此，允许存在级别(例如配体结合亲和力级别和配体结合活性级别)和数量因子(如受体蛋白质分子量)的不同。
在本发明的另一个具体的实施方案中，G蛋白偶联受体蛋白质包括源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的包含由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质，和以下一些源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)从SEQ ID NO56的氨基酸序列缺失的蛋白质；其中一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)添加到SEQ ID NO56的氨基酸序列上的蛋白质；其中SEQ ID NO56的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(优选的是2-30个氨基酸残基，更优选的是2-10个氨基酸残基)由一个或多个氨基酸残基取代的蛋白质等。
在本发明的G蛋白偶联受体蛋白质中，氨基酸序列部分可被修饰(例如添加、缺失、用其它氨基酸取代等)。
此外，本发明的G蛋白偶联受体蛋白质包括其中N-末端Met由保护基(例如，C1-6酰基基团如甲酰基、乙酰基等)保护的那些；其中Glu N-末端侧体内裂解以使所说的焦谷氨酸化的那些；其中氨基酸分子内侧链由合适的保护基(例如，C1-6酰基基团如甲酰基、乙酰基等)保护的那些；缀合蛋白质(例如其中糖链被结合的所谓的“糖蛋白”)等。
本发明的所说G蛋白偶联受体蛋白质的盐优选的包括生理学上可接受的酸加成盐。这种盐的例子是其与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等)的盐，其与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)的盐等。
本发明的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐可以经纯化方法(所说纯化方法是本领域技术人员已知的方法或者其类似的方法)从温血动物组织或细胞制备，或者可以经培养包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的转化体(或转染体)(如本文以下所述)制备。本发明的蛋白质或其盐可以经本文以下描述的肽合成制备。
G蛋白偶联受体蛋白质片段(所说G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽)可以包括例如在G蛋白偶联受体蛋白质分子中露置于细胞膜外的位点。所说片段的例子是包含在G蛋白偶联受体蛋白质疏水图分析中分析为胞外区(亲水区或位点)的区，所说的疏水图是由图24、25、28、31、32、36、38、41、44、47、50、53、57、58、59、64、70、74和78所示的。部分含有疏水区或位点的肽也可以使用。而且，尽管同时含有两个以上的区的部分肽(肽片段)可以使用，分别含有各个区的肽也可使用。
所说G蛋白偶联受体蛋白质片段(其部分肽)的盐优选的包括生理学上可接受的酸加成盐。这种盐的例子是其与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等)的盐，其与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)的盐等。
可以由肽合成方法(其本领域技术人员已知的方法或者其类似的方法)或由合适的肽酶切割(消化)G蛋白偶联受体蛋白质制备G蛋白偶联受体蛋白质片段(G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽)。合成肽的方法可以是任何固相合成方法和液相合成方法。因此，可以构建本发明的蛋白质的部分肽(肽片段)或氨基酸与其残基部分缩合，当产物具有保护基时，所说保护基连接其上，可以制备所需的肽。已知的连接保护基的缩合方法的例子包括以下1-51. M.Bodanszky and A.Ondetti肽合成，Interscience出版社，纽约(1966)。
2. Schroeder and Luebke肽，Academic出版社，纽约(1965)。
3. Nobuo Izumiya等肽合成的基本原理和实验，Maruzen KK，日本(1975)。
4. Naruaki Yajima and Shumpei Sakakibara“Seikagaku Jikken Koza1”(生物化学实验，第一部分)，“Tanpakusitu No Kagaku IV”(蛋白质化学，IV)，205页(1977)，日本。
5. Naruaki Yajima(ed)药学进展(第二序列)，14卷，肽合成，hirokawa Shoten，日本。
反应后，选择性地组合常规的纯化技术(例如盐析、溶剂抽提、蒸馏、柱层析、液相层析、电泳、重结晶等)，以纯化和分离本发明的蛋白质。当由此获得的蛋白质是一种游离化合物时，可以用已知的方法将其转化为盐，而当其以盐获得时，可用已知的方法将盐转化为游离化合物或者其它盐。
此外，可以经培养包含编码所说部分肽的DNA的转化体(转染体)制备所说的产物。
用以上本发明DNA的筛选方法获得的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA和由所说DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质或由所说DNA编码的肽片段(其部分肽)可以用于例如判定所说G蛋白偶联受体蛋白质之配体，或者用于筛选抑制所说G蛋白偶联受体蛋白质与配体结合的化合物。
在此情况下，首先构建编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA表达系统。所说DNA之宿主可以是任何动物细胞、昆虫、酵母、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等。其所使用的启动子可以是任何一种适当的宿主(用于基因表达)的启动子。有时采用表达增强子也是有益的。
然后，对表达细胞(构建来表达G蛋白偶联受体蛋白质)或由此制备(用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法)的细胞膜组份进行各种结合实验。所使用的配体可以包括任何由市售的放射性同位素标记的化合物、直接由氯胺T方法或乳过氧化物酶方法标记的培养上清液和组织抽提物。当细胞使用粘附到底物上的细胞时，可与直接洗涤进行结合的或游离的配体的分离，而在漂浮的细胞或其细胞膜组份的情况下，所述分离可以经离心分离或过滤进行。可以经加入未标记的配体估测与容器等的非特异性结合，所说配体相对于倾倒的标记配体来说是约100倍浓缩的。
由这种受体结合实验获得的配体可以进行激动剂对拮抗剂的辨别。
更具体地说，将假定为配体的天然物质或化合物与表达G蛋白偶联受体蛋白质之细胞一起培养，此后，收集培养上清液或抽提细胞。用例如市售的测定试剂盒(如，cAMP、二酰甘油、cGMP、蛋白激酶的试剂盒)测定其中包含的组份的变化。另外由本领域技术人员已知的方法或其类似方法测定生理学反应(例如，Fura-2、〔3H〕花生四烯酸和〔3H〕肌醇磷酸盐代谢物的释放)也是可能的。由这种筛选方法获得的化合物或天然物质是所说G蛋白偶联受体蛋白质的激动剂或所说G蛋白偶联受体蛋白质的拮抗剂，被推测在所说受体分布的组织和细胞上起作用。因此，经参照RNA印迹显示的(表明的)分布等更有效地检查药学反应(药学效果)是可能的。而且，预期可开发在例如中枢神经组织、循环系统、肾、胰腺等中具有新的药学反应(药学效果)的化合物。可以经从组织选择性地扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA进行有效的药物开发。
本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA可以是任何编码DNA，只要其含有编码下列G蛋白偶联受体蛋白质之核苷酸序列含有实质上等价于具有SEQ ID NO24的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO24的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；含有实质上等价于具有SEQ ID NO25的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO25的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；含有实质上等价于具有SEQ ID NO26的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO26的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；含有实质上等价于具有SEQ ID NO27的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO27的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；或含有实质上等价于具有SEQ ID NO28的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO28的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质。
本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA也可以是任何编码DNA，只要其含有编码下列G蛋白偶联受体蛋白质之核苷酸序列含有实质上等价于具有SEQ ID NO34的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO34的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；或含有实质上等价于具有SEQ ID NO35的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO35的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质。
本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA也可以是任何编码DNA，只要其含有编码下列G蛋白偶联受体蛋白质之核苷酸序列含有实质上等价于具有SEQ ID NO38的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO38的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；或优选的含有实质上等价于具有SEQ ID NO39的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO39的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质。
本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA也可以是任何编码DNA，只要其含有编码下列G蛋白偶联受体蛋白质之核苷酸序列含有实质上等价于具有SEQ ID NO56的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO56的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质；或优选的含有实质上等价于具有SEQ ID NO56的氨基酸序列的氨基酸序列和/或具有实质上等价于具有SEQ ID NO56的氨基酸序列的活性的G蛋白偶联受体蛋白质。
本发明的DNA可以是任何人基因组DNA、人基因组DNA文库、人源于人组织和细胞的cDNA、源于人组织和细胞的cDNA文库和合成DNA。用于所说文库的载体可以包括任何噬菌体、质粒、粘粒、噬粒等。用从所说组织和细胞制备的mRNA可以经反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)直接扩增所说DNA。
在一个实施方案中，编码源于人垂体的包含SEQ ID NO24氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO29代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于人垂体的包含SEQ ID NO25氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO30代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于人垂体的包含SEQ ID NO26氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO31代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于小鼠胰腺的包含SEQ ID NO27氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO32代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于小鼠胰腺的包含SEQ ID NO28氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO33代表的核苷酸序列的DNA等。
在另一个实施方案中，编码源于人扁桃体的包含SEQ ID NO34氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO36代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于人扁桃体的包含SEQ ID NO35氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO37代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于人扁桃体的包含SEQ ID NO34氨基酸序列或SEQ ID NO35氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO36代表的核苷酸序列的DNA，具有由SEQ ID NO37代表的核苷酸序列的DNA等。在另一个实施方案中，编码源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的包含SEQ ID NO38氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO40代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的包含SEQ ID NO39氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO41代表的核苷酸序列的DNA等。编码源于人的包含SEQ ID NO56氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA包括具有由SEQ ID NO57代表的核苷酸序列的DNA等。
完全编码本发明的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA可以经以下方法克隆1.用具有部分G蛋白偶联受体蛋白质核苷酸序列(核苷酸片段)的合成底物进行PCR扩增；或2.基于与具有部分或全部人G蛋白偶联受体蛋白质编码区的标记DNA片段或具有部分或全部人G蛋白偶联受体蛋白质编码区的标记合成DNA的杂交，对在合适的载体中构建的DNA进行选择。可以按例如《分子克隆》(Molecular Cloning)(第二版，J.Sanbrook等，Cold Spring HarborLab.出版社，1989)中描述的方法进行杂交。当使用市售文库时，可以按照其中所附的方案进行。
依据不同的目的，可以使用克隆的本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA本身或者(如果需要)在用限制性酶消化后或添加接头或衔接子后使用。所说DNA在5’-末端侧可以具有翻译起始密码子ATG，在3’-末端侧可以具有翻译终止密码子TAA、TGA或TAG。也可以用合适的合成DNA衔接子添加这些翻译起始密码子和翻译终止密码子。
可以用例如以下方法产生G蛋白偶联受体蛋白质表达载体(1)从本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA切割出靶DNA片段和(2)将靶DNA片段连接到合适表达载体中的启动子下游位点。
载体可以包括源于大肠杆菌的质粒(如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)、源于枯草芽孢杆菌的质粒(如pUB110、pTP5、pC194等)、源于酵母的质粒(如pSH19、pSH15等)、噬菌体(如λ-噬菌体)、动物病毒(如逆转录病毒、痘病毒和杆状病毒)。
按照本发明，可以使用任何启动子，只要其与用于病毒基因的宿主相容。当用于转化的宿主是大肠杆菌时，启动子优选的是trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等。当用于转化的宿主是芽孢杆菌时，启动子优选的是SPO1启动子、SPO2启动子penP启动子等。当宿主是酵母时，启动子优选的是PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当宿主是动物细胞时，启动子包括SV40来源的启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热激启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等。增强子可以有效地用于表达。
另外，如果需要，将与宿主相容的信号序列加到G蛋白偶联受体蛋白质N-末端侧。当宿主是大肠杆菌时，采用的信号序列可以包括碱性磷酸酶信号序列、OmpA信号序列等。当宿主是芽孢杆菌属的微生物时，它们可以包括α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等。当宿主是酵母时，它们可以包括交配因子α信号序列、转化酶信号序列等。当宿主是动物细胞时，它们可以包括胰岛素信号序列。α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
用如此构建的载体产生转化体或转染体，其携带本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA。宿主可以是例如埃希氏菌属微生物、芽孢杆菌属微生物、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。埃希氏菌属和芽孢杆菌属微生物的例子包括包括埃希氏菌属K12-DH1[Proc.Natl Acad.Sci.美国，Vol.60，160(1968)〕，JM103[核酸研究，Vol.9，309(1981)〕，JA221[分子生物学杂志，Vol.120，517(1978)〕，HB101[分子生物学杂志，Vol.41，459(1969)]，C600[遗传学，Vol.39，440(1954)〕，等等。芽孢杆菌属微生物的例子，例如，枯草芽孢杆菌MI114[基因，Vol.24，255(1983)〕，207-21[生物化学杂志，Vol.95，87(1984)〕，等等。酵母可以是，例如，酿酒酵母AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，12，等等。昆虫可以包括蚕(Bombyx mori幼虫)，[Maeda等，自然，Vol.315，592(1985)〕等等。宿主动物细胞可以是，例如，源于猴的细胞系COS-7，Vero，中国仓鼠卵巢细胞系(CHO细胞)，DHFR基因-缺陷中国仓鼠细胞系(dhfr-CHO细胞)，小鼠L细胞，鼠骨髓瘤细胞，人FL细胞，等等。
依据所使用的宿主细胞，可以用适于这些细胞的标准的技术进行转化。可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.美国，Vol.69，2110(1972)，基因，Vol.17，107 (1982)，等中公开的方法进行埃希氏菌属微生物的转化；可以按照例如分子和普通遗传学，Vol.168，111(1979)，等中公开的方法进行芽孢杆菌属微生物的转化；可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.美国，Vol.75，1929(1978)，等中公开的方法进行酵母的转化；可以按照例如生物/技术，6，47 55，1988.中公开的方法进行昆虫细胞的转化；可以按照例如病毒学，Vol.52，456，等中公开的方法进行动物细胞的转化。按照以上提到的方法产生用包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的表达载体转化的转化体或转染体。
其宿主是埃希氏菌属或者芽孢杆菌属微生物的转化体(转染体)的培养适于在液体培养基中进行所述培养基可以包转化体生长必需的含碳源，氮源，矿物质，等。碳源可以包括葡萄糖，糊精，可溶性淀粉，蔗糖，等等。氮源可以包括有机或者无机物质如含铵盐，硝酸盐，玉米浆，蛋白胨，酪蛋白，肉提取物，大豆饼，土豆提取物，等等。矿物质的例子可以包括氯化钙，磷酸二氢钠，氯化镁，等等。还可以添加酵母，维生素，生长促进因子等。大约5至大约8的培养基pH是合乎需要的。
优选的埃希氏菌属微生物培养基是包含，例如，葡萄糖和酪蛋氨基酸的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志)，431-433，Cold SpringHarbor Laboratory，纽约，1972。根据需要，培养基可以补充药物诸如3β-吲哚基丙烯酸以改善启动子的效率，在埃希氏菌属宿主的情况下，培养通常在大约15至43℃下进行大约3至24小时。需要时可以采用通气和搅拌。在芽孢杆菌属宿主的情况下，培养通常在大约30至40℃下进行大约6至24小时。需要时可以采用通气和搅拌。在其宿主是酵母的转化体的情况下，使用的培养基可以包括，例如，Burkholder基本培养基[Bostian，K.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，Vol.77，4505(1980)〕，包含0.5％酪蛋氨基酸的SD培养基[Bitter，G.A.等，Proc.Natl.AcadSci.美国，Vol.81，5330(1984)〕，等等。将培养基的pH值调节到大约8到大约5是优选的。培养通常在大约20至35℃下进行大约24至72小时。需要时可以采用通气和搅拌。在其宿主是昆虫的转化体的情况下，所使用的培养基可以包括由添加添加剂(如钝化(固定化)的10％胎牛血清等到Grace‘s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))中获得的那些。将培养基的pH值调节到大约6.2至6.4是优选的。培养通常在大约27℃下进行大约3至5天。需要时可以采用通气和搅拌。在其宿主是动物细胞的转化体的情况下，使用的培养基可以包括MEM培养基[科学，Vol.122，501(1952)〕，DMEM培养基[病毒学，Vol.8，396(1959)〕，RPMI 1640[美国医学会杂志，Vol.199，519(1967)〕，199培养基[生物医学界进展，Vol.73，1(1950)〕，等等，它们包含，例如，大约5至20％的胎牛血清。将培养基的pH值调节到大约8-大约6是优选的。培养通常在30至40℃下进行大约15至60小时，需要时可以采用通气和搅拌。
可以按本文以下描述的方法从以上提到的培养物分离和纯化所说的G蛋白偶联受体蛋白质。
为从培养的微生物或细胞抽提G蛋白偶联受体蛋白质，在培养后用已知的方法收集微生物或细胞，悬浮到合适的缓冲液中，经超声波、溶菌酶和/或冷冻干燥裂解等。然后，经离心或过滤获得G蛋白偶联受体蛋白质的粗提取物。可以使用其它常规的抽提或分离方法。缓冲溶液可以含有蛋白质变性剂(例如尿素或盐酸胍)或表面活性剂(例如，曲通X-100(注册商标，此后常称作“TM”)。
在G蛋白偶联受体蛋白质分泌到培养基中的情况下，在培养完成后将微生物或细胞与上清液分离，用各种已知的方法收集所得的上清液。可以经各种已知的分离和纯化方法的合适的组合纯化含有G蛋白偶联受体蛋白质的上清液和抽提物。各种已知的分离和纯化方法可以包括利用溶解性的方法(例如从溶剂盐析和沉降)；主要利用分子大小或分子量的不同的方法(例如透析、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；利用所带电荷不同的方法(例如离子交换色谱)；利用特定的亲和性的方法(例如亲和色谱)；利用疏水性不同的方法(例如反向高效液相色谱)和利用等电点不同的方法(例如等电点电泳)等。
在由此获得的G蛋白偶联受体蛋白质是游离形式时，可用已知的方法或其类似的方法将游离蛋白质转化为其盐。反之，在由此获得的G蛋白偶联受体蛋白质是盐形式时，也可用已知的方法或其类似的方法将蛋白质盐转化为其游离形式或其任何其它盐。
在纯化前后，可在合适的蛋白质修饰酶作用下，人工修饰由转化体产生的G蛋白偶联受体蛋白质或者从其部分除去多肽。所说的蛋白质修饰酶可以包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酸内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。可以经与配体的偶联(结合)实验或经用特定的抗体的酶免疫测定(酶联免疫测定)测定由此形成的G蛋白偶联受体蛋白质的活性。
本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA和G蛋白偶联受体蛋白质可以用于1.测定本发明的G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，2.获得抗体和抗血清，3.构建表达重组受体蛋白质的系统，4.用以上开发的系统开发受体结合测定系统和筛选药物候选化合物，5.基于比较具有类似或相似结构的配体和受体设计药物，6.制备基因分析中的探针和制备PCR引物，和7.基因操作治疗。
特别是，经采用表达本发明的重组G蛋白偶联受体蛋白质的系统允许筛选对温血动物(如人类)特异性的G蛋白偶联受体蛋白质激动剂或拮抗剂。如此筛选或确定特征的激动剂或拮抗剂具有各种用途，包括预防和/或治疗各种疾病。
以下具体描述的是按照本发明的G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽(其肽片段)、编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA和抗G蛋白质偶联受体抗体蛋之受体的用途。
以下更详细的描述基于下列物质的有用性由按照本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA筛选方法获得的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA、由所说DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质、其肽片段或区段(包括其部分肽)或其盐(此后，包括其盐的那些将称作“G蛋白偶联受体蛋白质或其肽片段”)、各自包含重组型G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或其细胞膜组份等。以下也说明它们的各种用途。
1.判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法所说G蛋白偶联受体蛋白质作为研究或判定G蛋白偶联受体蛋白质(或其肽区段)配体的反应剂是有用的。
按照本发明，提供了判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段或其片段与待试化合物接触。
待试化合物不仅可以包括已知的配体(例如血管紧张肽、铃蟾肽、canavinoid、缩胆囊肽、谷酰胺、血清素、褪黑激素、神经肽Y、阿片样物质、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管作用肠肽和关联肽)、生长抑素、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、adrenomedullin、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰腺多肽和galanin、其修饰的衍生物、其类似物其家族的成员等)，而且也包括温血动物(例如小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、猴和人)等的组织抽提物细胞培养上清液等。例如，将所说的组织抽提物、所说的细胞培养上清液等加入到用于测定细胞刺激活性等的G蛋白偶联受体蛋白质中，并依据测定分级分离，最终可获得单个配体。
在本发明的一个特定的实施方案中，所说的判定配体的方法包括判定能够刺激靶细胞的化合物或其盐的方法，该方法包括在G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段的存在下，或者在构建和使用重组型受体蛋白质之表达系统的受体结合测定系统中将所说化合物与G蛋白偶联受体蛋白质结合；测定受体介导的细胞刺激活性等。所说细胞刺激活性的例子包括生物反应中的激发活性或抑制活性，例如，花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等。能够经与G蛋白偶联受体蛋白质结合刺激细胞G蛋白偶联受体蛋白质所说化合物或盐的例子包括肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物等。
在所说的判定配体的方法中，特征性特点是当G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段与待试化合物接触时，测定例如待试化合物对G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段的结合量、细胞刺激活性等。
在本发明更特定的释放中，所说的判定配体的方法包括1.判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将标记的待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段接触，测定与所说蛋白质或其盐或与所说的其肽区段结合的待试化合物的量；2.判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将标记的待试化合物与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜组份接触，测定与所说细胞或所说细胞组份结合的待试化合物的量；3.判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将标记的待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质接触，测定与所说G蛋白偶联受体蛋白质结合的待试化合物的量，所说的G蛋白偶联受体蛋白质是经培养包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的转化体在细胞膜上表达的。
4.判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将标记的待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质接触，测定经所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞刺激活性(例如，生物反应中的激发活性或抑制活性，例如，花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)。
5.判定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括将标记的待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质接触，测定经所说G蛋白偶联受体蛋白质(其是经培养包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的转化体在细胞膜上表达的)的细胞刺激活性(例如，生物反应中的激发活性或抑制活性，例如，花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)。
以下的描述是对按照本发明的判定方法的具体的解释，其仅仅为了说明目的。
首先，用于判定方法中的G蛋白偶联受体蛋白质可以包括任何物质，只要其含有G蛋白偶联受体蛋白质或其肽片段或区段(包括其部分肽)或其盐(尽管在动物细胞中表达大量的G蛋白偶联受体蛋白质是优选的)。在G蛋白偶联受体蛋白质的制造中，可以使用以上提及的方法，它们可以经在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达所说蛋白质编码DNA进行。就编码目的区的DNA片段来说，可以使用互补DNA(尽管不限于此)。例如，也可以使用基因片段或合成DNA。
为了将编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA片段引入到宿主动物细胞中并有效地表达它，优选地是将所说DNA片段掺合进源于属于杆状病毒的核型多角体病毒的多角体启动子、源于SV40的启动子、源于逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、人热激启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等的下游位点。可以用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法进行表达的受体的定量和定性测定。例如，可以按出版物(如Nambi，P.等生物化学会杂志(The Journal of Biochemical Society)，第267卷，19555-19559页(1992))描述方法进行。
因此，就配体的测定来说，包含G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段的物质可以包括包含G蛋白偶联受体蛋白质的产物(其可由本领域技术人员已知的方法或其类似的方法纯化)、所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽片段、包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、包含所说蛋白质的细胞膜组份等。
当包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞用于配体测定方法中时，所说的细胞可以是用结合剂(包括戊二醛/福尔马林等)固定化的。可以用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法进行固定。
包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是表达G蛋白偶联受体蛋白质的宿主细胞。所说宿主细胞的例子是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
细胞膜组份是在细胞裂解后，用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法制备的富含细胞膜的组份。细胞裂解的例子可以包括用Potter-Elvejem匀浆器挤压细胞的方法、用Waring捣碎机和Polytron (Kinematica制造)裂解、用超声波裂解、经从小管口吹出细胞并用French压施压裂解等。在细胞膜分级分离中，主要使用利用离心力的分级分离方法，例如，分级离心分离和密度梯度离心分离。例如，在低速(500rpm-3000rpm)下将裂解的细胞液离心短的一段时间(通常从约1-10分钟)，再在高速(1500rpm-3000rpm)下将上清液离心(通常)30分钟到2小时，所形成的沉淀用作膜组份。所说膜组份含有大量表达的G蛋白偶联受体蛋白质和大量的膜成分，例如源于细胞的磷脂和膜蛋白。
包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞膜组份中的G蛋白偶联受体蛋白质的量优选的是每个细胞103-108个分子，适当的是每个细胞105-107个分子。顺便指出，表达的量越多，每个膜组份的配体结合活性(特异性活性)越高，由此，构建高度敏感的筛选系统成为可能，而且，它可以使我们在相同的批次中测定大量的样品。
在实施以上提到的其中测定能够结合G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法1到2中，合适的G蛋白偶联受体蛋白质组份和标记的待试化合物是必需的。G蛋白偶联受体蛋白质组份优选的是天然产生的(天然型)G蛋白偶联受体蛋白质、活性等价于天然型的重组型G蛋白偶联受体蛋白质。这里，术语“活性等价于”意指等价的配体结合活性等。
标记的待试化合物的合适的例子是血管紧张肽、铃蟾肽、canavinoid、缩胆囊肽、谷酰胺、血清素、褪黑激素、神经肽Y、阿片样物质、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管作用肠肽和关联肽)、生长抑素、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、adrenomedullin、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰腺多肽和galanin、其类似物衍生物等。它们是由〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等标记的。
具体地说，按以下进行能够结合G蛋白偶联受体蛋白质的配体的判定首先，将包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜组份悬浮到适用于判定方法的缓冲液中，制备实施判定与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体的方法中的样品。所说的缓冲液可以包括任何缓冲液(例如Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液等，pH4-10，优选的是pH6-8)，只要其不抑制配体与受体的结合。此外，可以向缓冲液中添加表面活性剂(例如，CHAPS、吐温80TM(Kao-Atlas，日本)、毛地黄皂苷、脱氧胆酸盐等)和各种蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)、明胶、奶衍生物等)，其目的是降低特异性结合。另外，可以加入蛋白酶抑制剂(例如，PMSF、亮抑肽酶、E-64(Peptid Laboratory制造)、胃蛋白酶抑制剂等)，以抑制由蛋白酶引起的受体和配体的分解。使具有预确定的(某种)量(〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等的5000cpm到500000cpm)的待试化合物共存于0.01ml-10ml所说的受体溶液中。为了知道非特异性结合的量(NSB)，也制备添加了大量过量的未标记的待试化合物的反应试管。将反应在0-50℃(优选的是4-37℃)下进行20分钟到24小时(优选的是30分钟到3小时)。反应后，经玻璃纤维漏斗或类似的滤器过滤，用合适量的相同的缓冲液洗涤，用液体闪烁计数器或γ计数器测定保留在玻璃纤维滤器上的发射活性。从总结合量(B)减去非特异性结合的量(NSB)获得的计数(B-NSB)多于0cpm的待试化合物被选作本发明的G蛋白偶联受体蛋白质的配体。
在实施以上提到的其中测定能够结合G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法4到5中，可以用已知的方法和用市售的测定试剂盒测定G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性(例如，花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)。更特殊的是在多孔板或类似物中培养包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞。
在进行配体测定中，用对细胞无毒的新鲜的培养基或合适的缓冲液替换实验中前面使用的，在添加待试化合物等后培养一段时间。然后，抽提细胞或回收上清液，用各种方法测定所得到的产物。当因包含在细胞中的分解酶起作用使得辨别作为细胞刺激活性的标志的物质(例如花生四烯酸)的产生时，可以经加入所说分解酶的抑制剂进行测定。就对cAMP产生的抑制作用之类的活性而言，其可以作为对细胞产生(其基本产生被毛喉素等增加)的抑制作用被检测。
用于测定与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体的方法中的试剂盒包括G蛋白偶联受体蛋白质或其肽片段、包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞的膜组份等。
测定所说判定的试剂盒的例子如下1.测定所说配体的试剂(1)测定缓冲液和洗涤缓冲液其中0.05％牛血清白蛋白(Sigma制造)加入到Hanks’平衡盐溶液(Gibco制造)中的缓冲产品。
这一产品可以经用具有0.45μm孔径的膜滤器过滤灭菌，并在4℃贮存，或者可以在使用时制备。
(2)G蛋白偶联受体蛋白质样品表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞以5×105细胞/孔的比率在12孔板中传代培养，在37℃下于潮湿的5％CO2/95％空气氛围中培养2天，制备样品。
(3)标记待试化合物用市售的〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等标记的或用合适的方法标记的化合物。
水溶液状态的产物在4℃或在-20℃下贮存，使用时用测定缓冲液稀释成1μM。在待试化合物难溶入水的情况下，将其溶入二甲基甲酰胺、DMSO、甲醇等中。
(4)未标记的待试化合物以100-1000倍浓度的浓缩状态制备与标记化合物相同的化合物。
2.测定方法(1)用1毫升测定缓冲液洗涤在12孔组织培养板中培养的表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞两次，然后，将490微升测定缓冲液加入到各孔中。
(2)加入5微升待试化合物，使混合物在室温下反应1小时。为测定非特异性结合的量，加入5微升未标记的待试化合物。
(3)从各孔移去反应溶液，用1毫升测定缓冲液洗涤3次。将与细胞结合的标记待试化合物溶解在0.2N NaOH-1％SDS中，并与4毫升闪烁剂A(Wako Pure Chemical(日本)制造)混合。
(4)用液体闪烁计数器(Beckmann制造)测定放射活性。
可以与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体包括天然产生的物质，例如在脑、垂体腺、胰腺等中的。所说配体的例子是血管紧张肽、铃蟾肽、canavinoid、缩胆囊肽、谷酰胺、血清素、褪黑激素、神经肽Y、阿片样物质、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管作用肠肽和关联肽)、生长抑素、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、adrenomedullin、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-趋化因子(IL-8，GROα，GROβ，GROγ，NAP-2，ENA-78，PF4，IP10，GCP-2，MCP-1，HC14，MCP-3，1-309，MIPlα，MIP-1β，RANTES，等)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰腺多肽和galanin、其修饰的衍生物、其类似物等。
因为由pMAH2-17编码的受体蛋白质高度同源于Prinoceptor，人们认为极有可能存在Prinoceptor家族的亚型。包括电生理学测定的所有数据支持本发明的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的受体蛋白质(例如SEQ IDNO38和SEQ ID NO39，或pMAH2-17编码的蛋白质)是新的Purinoceptor亚型。换句话说，这表明可以结合本发明的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的配体(例如SEQ ID NO38和SEQ ID NO39，或pMAH2-17编码的蛋白质)是ATP之类的嘌呤化合物。此外，所说的受体蛋白质(例如SEQ ID NO38和SEQ ID NO39，或pMAH2-17编码的蛋白质)被认为是新的人型Purinoceptor。由此推定其在有效筛选受体蛋白质激动剂或拮抗剂(其控制或调节中枢神经系统或免疫系统中与嘌呤化合物有关的功能)中和在开发药物中非常有用。
2.G蛋白偶联受体蛋白质缺陷病的预防和治疗剂如果G蛋白偶联受体蛋白质配体如以上方法1所说的，基于所说配体发挥的作用，所说的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA可以用作G蛋白偶联受体蛋白质缺陷病的预防和/或治疗剂。
例如，由于体内G蛋白偶联受体蛋白质降低，配体生理活性不能发挥的病人，可由以下方法增加病人脑细胞中的G蛋白偶联受体蛋白质的量，从而完全使配体发挥作用(1)给病人施用编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，以表达它；或(2)将编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA插入到脑细胞等，以表达它，接着将所说的脑细胞转移到所说的病人。因此，所说编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA可以用作G蛋白偶联受体蛋白质缺陷病的安全无毒的预防和治疗剂。一个实施方案说明能够结合本发明的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的受体蛋白质(例如SEQ ID NO38和SEQ ID NO39，或pMAH2-17编码的蛋白质)以及本发明的源于人的受体蛋白质(例如SEQ ID NO56或phAH2-17编码的蛋白质)的配体是ATP之类的嘌呤化合物。由此，被治疗的疾病可以是与嘌呤配体化合物相关的疾病或并发症。这些疾病的例子可以包括癌症、免疫缺陷病、自体免疫病、风湿性关节炎、内器官移植排斥、高血压、糖尿病、囊性纤维症、低血压、尿失禁、疼痛等。
3.源于人的G蛋白偶联受体蛋白质缺陷病的预防和治疗药物组合物如果用以上提到的方法1筛选出编码源于人的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人并可以阐明源于人的G蛋白偶联受体蛋白质，则基于所说配体发挥的作用，编码源于人的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人可以用作所说源于人的G蛋白偶联受体蛋白质缺陷病的预防或治疗剂。
例如，由于体内G蛋白偶联受体蛋白质降低，配体生理活性不能发挥的病人，可由以下方法增加病人脑细胞中的G蛋白偶联受体蛋白质的量，从而完全使配体发挥作用(1)给病人施用编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，以表达它；或(2)将编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA插入到脑细胞等，以表达它，接着将所说的脑细胞转移到所说的病人。因此，所说编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA可以用作G蛋白偶联受体蛋白质缺陷病的安全无毒的预防和治疗剂。
当编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA用作以上提到的药剂时，所说的DNA可以单独使用，或在插入到合适的载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体等)后接着用常规的方法操作产物载体来使用。由此，可以作为药物组合物或制剂经口服、注射、吸入剂喷射、直肠或局部施用。口服制剂包括片剂(需要时是糖衣的)、胶囊剂、酏剂、微胶囊等。注射制剂包括无菌溶液或在水或其它药学上可接受的液体中的悬液之类的注射剂。例如，将本发明的DNA以制备一般认可的药物制剂所需的单位剂量与药学上可接受的载体、香味剂、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、运载体、防腐剂、稳定剂、粘结剂等混合。由此可以制备制剂。在这些制剂中有效成分的量以在指定的范围内可以获得合适的剂量的程度存在。
可以混合进片剂、胶囊剂等中的添加剂的例子是粘结剂(明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶和阿拉伯树胶)、填充剂(晶体纤维素)、膨胀剂(玉米淀粉、明胶和海藻酸)、润滑剂(硬脂酸镁)、甜味剂(蔗糖、乳糖和其它糖类)和香味剂(胡椒薄荷、akamono油和樱桃)。当单位制剂形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质外，还可以加入液体载体，例如脂肪/油。可以药剂的常规制备方法配制无菌组合物注射剂，例如将供注射的在载体(例如水)中的活性成分溶解，或者悬浮在天然产生的植物油(例如，芝麻油和棕榈油)中。
用于注射剂的含水液体的例子是生理盐水溶液和包含葡萄糖和其它辅助药剂(如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)的等渗溶液。其中也可以一起使用合适的辅助增溶剂，例如，醇(如乙醇等)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酯80TM、HCO-50等)等。油性液体的例子包括芝麻油、大豆油等。其中苄基苯甲酸酯、苄醇等也可以作为辅助增溶剂一起使用。此外，也可以混入缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等)、镇痛剂(例如，氯化苯甲烃铵、普鲁卡因盐酸盐等)、稳定剂(例如，苄醇、酚等)、抗氧化剂等。将制备的注射溶液装入到安瓿中。由此制备的制剂是安全无毒的，因而可以施用到温血动物(小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、人、等)上。
所说DNA的特定的剂量水平可以依各种因素而变化，这些因素包括所使用的药物的活性、年龄、体重、总的健康状况、性别、日常饮食、施用次数、用药途径、药物组合和症状的严重程度。在口服施用的情况下，成年人(约60公斤)每天通常约0.1-100mg，优选的约1.0-50mg，更优选的约1.0-20mg。当注射施用时，其一段时间的剂量随所施用的受治疗者(病人)、施用的器官、症状、施用方法等变化。但在注射的情况下，通常经静脉内途径方便地给药，成年人(约60公斤)每天通常约0.1-30mg，优选的约0.1-20mg，更优选的约0.1-10mg。在其它动物的情况下，按60公斤计算，也可以施用以上的剂量。
4.本发明G蛋白偶联受体蛋白质配体的定量测定G蛋白偶联受体蛋白质或其肽片段具有与配体的结合性质，因此，可以以良好的灵敏度定量测定体内配体的量。
可以例如结合竞争性方法进行这一定量测定。由此，将待测样品与G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段接触，以便在所说样品中的配体浓度可被测定。在定量测定的一个实施方案中，采用以下1和2描述的方案或其类似的方法(1).Hiroshi Irie(ed)“发射免疫测定(Radioimmunoassay)”(Kodansha，日本，1974)；和(2).Hiroshi Irie(ed)“发射免疫测定(Radioimmunoassay)，第二序列”(Kodansha，日本，1979)。
5.筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物使用G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段。另外，构建重组型G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段表达系统，使用采用所说表达系统的受体结合测定系统。在这一测定系统中，筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物(例如，肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物)或其盐是可能的。这种化合物包括表现出G蛋白质偶联受体介导的细胞刺激活性(生物反应中的激发活性或抑制活性，包括花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)的化合物，无这种细胞刺激活性的化合物(所谓的“G蛋白质偶联受体拮抗剂”)等。
因此，本发明提供了一种筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于比较下列两种情况(i)其中所说的配体与蛋白质和其盐、其肽片段或其盐接触；和(ii)其中所说的配体与蛋白质和其盐、其肽片段或其盐和所说的待试化合物的混合物接触。
在所说的筛选方法中，本发明的一个特征性特点是分别在以下两种情况下测定与所说G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段结合的所说配体的量、所说配体的细胞刺激活性，然后将两者比较(i)其中所说的配体与G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段接触；和(ii)其中所说的配体和待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段接触。
本发明的一个更具体的实施方案提供了以下方法1.一种筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于在标记配体与G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段接触时和在标记配体和待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段接触时，测定与所说G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段或其盐结合的标记配体的量，并将两者比较。
2.一种筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于在标记配体与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜组份接触时和在标记配体和待试化合物与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜组份接触时，测定与所说G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段或其盐结合的标记配体的量，并将两者比较。
3.一种筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于在标记配体与G蛋白偶联受体蛋白质接触时和在标记配体和待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质接触时，测定与所说G蛋白偶联受体蛋白质结合的标记配体的量，并将两者比较，其中所说G蛋白偶联受体蛋白质是经培养包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的转化体在细胞膜上表达的。
4.一种筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于在G蛋白偶联受体蛋白质活化化合物(例如，一种G蛋白偶联受体蛋白质配体)与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触时和在G蛋白偶联受体蛋白质活化化合物和待试化合物与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触时，测定产生的G蛋白偶联受体蛋白质介导细胞刺激活性(生物反应中的激发活性或抑制活性，包括花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)，并将两者比较。
5一种筛选抑制配体与本发明的G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于在G蛋白偶联受体蛋白质活化化合物(例如，一种G蛋白偶联受体蛋白质配体)与G蛋白偶联受体蛋白质接触时和在G蛋白偶联受体蛋白质活化化合物和待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质接触时，测定产生的G蛋白偶联受体蛋白质介导细胞刺激活性(生物反应中的激发活性或抑制活性，包括花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)，并将两者比较，其中所说G蛋白偶联受体蛋白质是经培养包含编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的转化体在细胞膜上表达的。
在本发明的G蛋白偶联受体蛋白质获得之前，筛选G蛋白偶联受体蛋白质激动剂和拮抗剂的方法是首先用源于大鼠等的包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、组织和细胞膜组份获得候选化合物(初步筛选)，然后，确证候选化合物是否真的抑制人G蛋白偶联受体蛋白质和配体的结合(第二筛选)。当使用细胞、组织和细胞膜组份时，不可避免地存在其本身的其它受体蛋白质，从而，本质上使筛选所需受体蛋白质的激动剂或拮抗剂变得困难。然而，通过采用源于人的G蛋白偶联受体蛋白质，无需进行初步筛选，而使得可以有效地筛选抑制配体和G蛋白偶联受体蛋白质之间的结合的化合物。此外，还使得可以评价被筛选的化合物是否是G蛋白偶联受体蛋白质激动剂或G蛋白偶联受体蛋白质拮抗剂。
此后给出筛选方法的具体的解释。
首先，就用于本发明的筛选方法的G蛋白偶联受体蛋白质而言，任何产物均可使用，只要其含有G蛋白偶联受体蛋白质和其肽片段(尽管哺乳动物器官的膜组份的使用是合适的)。然而，人器官非常难以获得，因而用重组体定量表达的G蛋白偶联受体蛋白质适用于筛选。
在制造G蛋白偶联受体蛋白质中，可以使用以上提到的方法，通过在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达编码所说蛋白质的DNA进行。就编码靶区的DNA片段而言，可以使用互补的DNA(尽管不限于此)。因此，也可以使用例如基因片段或合成DNA。
为了将编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA片段引入到宿主动物细胞中并有效地表达它，优选地是将所说DNA片段掺合进源于属于杆状病毒的核型多角体病毒的多角体启动子、源于SV40的启动子、源于逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、人热激启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等的下游位点。可以用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法进行表达的受体的定量和定性测定。例如，可以按出版物(如Nambi，P.等生物化学会杂志(The Journal of Biochemical Society)，第267卷，19555-19559页(1992))描述方法进行。
因此，在筛选方法中，包含G蛋白偶联受体蛋白质或其肽区段的物质可以包括包含G蛋白偶联受体蛋白质的产物(其可由本领域技术人员已知的方法或其类似的方法纯化)、所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽片段、包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、包含所说蛋白质的细胞膜组份等。
当包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞用于筛选方法中时，所说的细胞可以是用结合剂(包括戊二醛/福尔马林等)固定化的。可以用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法进行固定。
包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是表达G蛋白偶联受体蛋白质的宿主细胞。所说宿主细胞的例子是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
细胞膜组份是在细胞裂解后，用本领域技术人员已知的方法或其基本上类似的改进的方法制备的含大量细胞膜的组份。细胞裂解的例子可以包括用Potter-Elvejem匀浆器挤压细胞的方法、用Waring捣碎机和Polytron(Kinematica制造)裂解、用超声波裂解、经从小管口吹出细胞并用French压施压裂解等。在细胞膜分级分离中，主要使用利用离心力的分级分离方法，例如，分级离心分离和密度梯度离心分离。例如，在低速(500rpm-3000rpm)下将裂解的细胞液离心短的一段时间(通常从约1-10分钟)，再在高速(1500rpm-3000rpm)下将上清液离心(通常)30分钟到2小时，所形成的沉淀用作膜组份。所说膜组份含有大量表达的G蛋白偶联受体蛋白质和大量的膜成分，例如源于细胞的磷脂和膜蛋白。
包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞膜组份中的G蛋白偶联受体蛋白质的量优选的是每个细胞103-108个分子，适当的是每个细胞105-107个分子。顺便指出，表达的量越多，每个膜组份的配体结合活性(特异性活性)越高，由此，构建高度敏感的筛选系统成为可能，而且，它可以使我们在相同的批次中测定大量的样品。
在实施以上提到的其中筛选能够抑制配体与G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物的方法1到3中，合适的G蛋白偶联受体蛋白质组份和标记配体是必需的。G蛋白偶联受体蛋白质组份优选的是天然产生的(天然型)G蛋白偶联受体蛋白质、活性等价于天然型的重组型G蛋白偶联受体蛋白质。这里，术语“活性等价于”意指等价的配体结合活性等。
就标记配体而言，采用标记配体、标记配体类似的化合物等是可能的，例如可以使用〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等标记的配体和其它标记的物质。
具体地说，首先将包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜组份悬浮到适用于判定方法的缓冲液中，制备实施筛选抑制配体与G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物的方法中的样品。就缓冲液而言，可以使用任何缓冲液(例如Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液等，pH4-10，优选的是pH6-8)，只要其不抑制配体与受体的结合。
此外，可以向缓冲液中添加表面活性剂(例如，CHAPS、吐温80TM(Kao-Atlas，日本)、毛地黄皂苷、脱氧胆酸盐等)和各种蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)、明胶等)，其目的是降低特异性结合。另外，可以加入蛋白酶抑制剂(例如，PMSF、亮抑肽酶、E-64(PeptidLaboratory制造)、胃蛋白酶抑制剂等)，以抑制由蛋白酶引起的受体和配体的分解。将-定量的标记配体(5000cpm到500000cpm)加到0.01ml-10ml所说的受体溶液中。同时使使得共存10-4M-10-10M的待试化合物。为了知道非特异性结合的量(NSB)，也制备添加了大量过量的未标记的待试化合物的反应试管。
将反应在0-50(优选的是4-37)下进行20分钟到24小时(优选的是30分钟到3小时)。反应后，经玻璃纤维漏斗或类似的滤器过滤，用合适量的相同的缓冲液洗涤，用液体闪烁计数器或γ计数器测定保留在玻璃纤维滤器上的发射活性。假定经从总结合量(B0)(其中，拮抗物质不存在时设定为100％)减去非特异性结合的量(NSB)获得的计数(B0-NSB)，从总结合量(B)减去非特异性结合的量(NSB)获得的特异性结合量计数(B-NSB)低于50％的待试化合物被选作本发明的G蛋白偶联受体蛋白质的候选配体。
在实施以上提到的筛选抑制配体与G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物的方法4到5中，可以用已知的方法和用市售的测定试剂盒测定G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性(例如，生理学反应的激发活性或抑制活性，如花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、胞内Ca2+离子释放、胞内cAMP产生、胞内cGMP产生、肌醇磷酸盐产生、细胞膜势能的变化、胞内蛋白质的磷酸化。c-fos活化、pH降低、G蛋白质活化、细胞分布等)。更特殊的是在多孔板或类似物中培养包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞。
在进行筛选中，用对细胞无毒的新鲜的培养基或合适的缓冲液替换实验中前面使用的，在添加待试化合物等后培养一段时间。然后，抽提细胞或回收上清液，用各种方法测定(优选地是定量测定)所得到的产物。当因包含在细胞中的分解酶起作用使得辨别作为细胞刺激活性的标志的标志物质(例如花生四烯酸)的产生时，可以经加入所说分解酶的抑制剂进行测定。就对cAMP产生的抑制作用之类的活性而言，其可以作为对细胞产生(其基本产生被毛喉素等增加)的抑制作用被检测。
在进行经测定细胞刺激活性的筛选时，其中表达合适的G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是必需的。优选的G蛋白偶联受体蛋白质表达细胞是包含天然产生的G蛋白偶联受体蛋白质(天然型G蛋白偶联受体蛋白质)之细胞系或株(例如，小鼠胰腺β细胞系MIN6等)、表达以上提到的重组型G蛋白偶联受体蛋白质之细胞系或株等。
待试化合物的例子包括肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提物、植物抽提物、动物组织抽提物、血清、血、体液等。那些化合物可以是新的或是已知的。
用于筛选抑制配体与本发明的蛋白质和其盐结合的化合物的试剂盒包括G蛋白偶联受体蛋白质或其肽片段、包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或其细胞膜组份。
筛选试剂盒的例子包括如下1.测定所说配体的试剂(1)测定缓冲液和洗涤缓冲液其中0.05％牛血清白蛋白(Sigma制造)加入到Hanks’平衡盐溶液(Gibco制造)中的缓冲产品。
这一产品可以经用具有0.45μm孔径的膜滤器过滤灭菌，并在4℃贮存，或者可以在使用时制备。
(2)G蛋白偶联受体蛋白质样品表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞以5×105细胞/孔的比率在12孔板中传代培养，在37℃下于5％CO2/95％空气氛围中培养2天，制备样品。
(3)标记配体用市售的〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等标记的配体。
水溶液状态的产物在4℃或在-20℃下贮存，使用时用测定缓冲液稀释成1μM。
(4)未标记的待试化合物将配体溶入含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma制造)的PBS中，制成1mM，在-20℃下贮存。
2.测定方法(1)在12孔组织培养板中培养CHO细胞，以表达G蛋白偶联受体蛋白质。用1毫升测定缓冲液洗涤表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞两次，然后，将490微升测定缓冲液加入到各孔中。
(2)加入5微升10-3-10-10M待试化合物，然后加入5微升标记配体，使混合物在室温下反应1小时。为测定非特异性结合的量，加入5微升10-3M的标记配体替代待试化合物。
(3)从各孔移去反应溶液，用1毫升测定缓冲液洗涤3次。将与细胞结合的标记配体溶解在0.2N NaOH-1％SDS中，并与4毫升闪烁剂A(Wako Pure Chemical(日本)制造)混合。
(4)用液体闪烁计数器(Beckmann制造)测定放射活性，按下式计算PMB(最大结合百分率)PMB＝〔(B-NSB)/(B0-NSB)〕×100PMB最大结合百分率B 添加样品时的值NSB非特异性结合B0 最大结合经所说的筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或其盐是抑制配体与G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物，更具体地说，它是具有经G蛋白质偶联受体或其盐介导的细胞刺激活性的化合物(所谓的“G蛋白质偶联受体激动剂”)或无这种细胞刺激活性的化合物(所谓的“G蛋白质偶联受体拮抗剂”)等。所说化合物的例子是肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物等，所说化合物可以是新的或已知的。
所说的G蛋白质偶联受体激动剂具有与G蛋白偶联受体蛋白质配体相同的生理学活性，因此基于所说的配体活性，其作为安全无毒的药物组合物是有用的。
另一方面，所说的G蛋白质偶联受体拮抗剂能够已知G蛋白偶联受体蛋白质配体的生理学活性，因而，作为抑制所说配体活性的安全无毒的药物组合物是有用的。
这也有力地说明，与实施例19中获得的由pMAH2-17编码的受体和/或实施例27中获得的由phAH2-17编码的受体有关的激动剂和/或拮抗剂在治疗或预防与嘌呤配体化合物或相关的类似物有关的疾病或并发症中是有用的。推断由pMAH2-17编码的受体和/或由phAH2-17编码的受体的激动剂，除了治疗性地或预防性地治疗高血压、糖尿病、囊性纤维症等有用外，作为免疫调节剂或抗肿瘤剂也是有用的。也推断由pMAH2-17编码的受体和/或由phAH2-17编码的受体的拮抗剂作为低血压剂、止痛剂、治疗性地或预防性地治疗尿失禁的药剂等是有用的。就Purinoceptor而言，在Purinoceptor第六或第七推定的转膜区的保守碱性氨基酸残基的突变引起对ATP受体应答的改变(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，第207(9)卷，4185-4188页(1995))。这也说明，ATP经受体与血压控制和循环系统有关(循环研究(Circulation Research)，58(3)卷，319-330页(1986))，并且ATP和Purinoceptor密切相关(Am.Phys.Soc.，pp.c55-c606(1983))。
当由所说的筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或其盐用作以上提到的药物组合物时，可以采用常规的方法。所说化合物或其盐可以以组合物或制剂的形式口服、注射、吸入剂喷射、直肠或局部施用(例如，粉末、颗粒、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、糖浆、乳剂、酏剂、悬液、溶液等)。例如，可以以片剂(需要时是糖衣的)、胶囊剂、酏剂、微胶囊等经口服途径使用，或以无菌溶液或在水或其它药学上可接受的液体中的悬液之类的注射剂经注射途径使用。所说的药物组合物或制剂可以包含一种单独的这样的化合物或与以下物质混合的这样的化合物药学上可接受的载体、佐剂、运载体、赋形剂和/或稀释剂。可以按常规方法配制所说的药物组合物。例如，将所说的化合物或其盐以制备一般认可的药物制剂所需的单位剂量与药学上可接受的载体、香味剂和/或芳香剂、填充剂、运载体、防腐剂、稳定剂、粘结剂等混合。由此可以制备制剂。在这些制剂中有效成分的量以在指定的范围内可以获得合适的剂量的程度存在。
可以混合进片剂、胶囊剂等中的添加剂的例子是粘结剂(例如明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶和阿拉伯树胶)、填充剂(例如晶体纤维素)、膨胀剂(例如玉米淀粉、明胶和海藻酸)、润滑剂(例如硬脂酸镁)、甜味剂(例如蔗糖、乳糖和其它糖类)、防腐剂(例如，parabens和山梨酸)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、α-生育酚和半胱氨酸)、香味剂(例如薄荷、akamono油和樱桃)、崩解剂、缓冲剂等。其它添加剂可以包括甘露糖醇、maltitol、葡聚糖、琼脂、壳多糖、脱乙酰壳多糖、果胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物、甘油酯、环二酯等。当单位制剂形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质外，还可以加入液体载体，例如脂肪/油。可以药剂的常规制备方法配制无菌组合物注射剂，例如将供注射的在载体(例如水)中的活性成分溶解，或者悬浮在天然产生的植物油(例如，芝麻油和棕榈油)中。
用于注射剂的含水液体的例子是生理盐水溶液和包含葡萄糖和其它辅助药剂(如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)的等渗溶液。其中也可以一起使用合适的辅助增溶剂，例如，醇(如乙醇等)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酯80TM、HCO-50等)等。油性液体的例子包括芝麻油、大豆油等。其中苄基苯甲酸酯、苄醇等也可以作为辅助增溶剂一起使用。
此外，也可以混入缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等)、镇痛剂(例如，氯化苯甲烃铵、普鲁卡因盐酸盐等)、稳定剂(例如，苄醇、酚等)、抗氧化剂等。将制备的注射溶液装入到安瓿中。由此制备的制剂是安全无毒的，因而可以施用到温血动物(小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、人、等)上。
所说化合物或其盐的剂量水平可以依症状而变化，对任何特定的病人使用的特定的剂量水平取决于所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、总的健康状况、性别、日常饮食、施用次数、用药途径、排泄比率、药物组合和被治疗的特定疾病的严重程度。在口服施用的情况下，成年人(约60公斤)每天通常约0.1-100mg，优选的约1.0-50mg，更优选的约1.0-20mg。当注射施用时，其一段时间的剂量随所施用的受治疗者(病人)、施用的器官、症状、施用方法等变化。这里使用的术语“注射”包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内注射或输注技术。在注射的情况下，通常经静脉内途径方便地给药，成年人(约60公斤)每天通常约0.1-30mg，优选的约0.1-20mg，更优选的约0.1-10mg。在其它动物的情况下，按60公斤计算，也可以施用以上的剂量。
6.本发明的G蛋白偶联受体蛋白质、其肽片段或其盐的抗体或抗血清的制备用本发明的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或者本发明的G蛋白偶联受体蛋白质蛋和其肽片段片段或其盐，经本领域技术人员已知的技术或其类似的技术可以制备抗本发明的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或者本发明的G蛋白偶联受体蛋白质蛋和其肽片段片段或其盐的抗体(例如多克隆抗体和单克隆抗体)或抗血清。例如可以经以下给出的方法制备单克隆抗体。
〔单克隆抗体的制备〕(1)产生单克隆抗体之细胞的制备将本发明的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或者本发明的G蛋白偶联受体蛋白质蛋和其肽片段片段或其盐(此后缩写为“G蛋白偶联受体蛋白质”)单独或与载体或稀释剂一起使用到温血动物的经施用可能产生抗体的位置上。为了在施药后加强抗体产生，可以施用完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。通常每2-6周施药一次，总共2-10次。可用的温血动物的例子是猴、兔、天竺鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊和鸡，使用小鼠和大鼠是优选的。
在产生单克隆抗体的细胞的制备中，从用抗原免疫过的温血动物(例如小鼠)中选择出抗体滴度显著的动物，在最终免疫后2-5天收集脾脏或淋巴结，将其中包含的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，得到产生单克隆抗体的杂交瘤。可以通过例如将标记的G蛋白偶联受体蛋白质(以后将提及)与抗血清反应，接着用抗体测定标记试剂的结合活性来测定抗血清中的抗体滴度。可以用例如Koehler和Milstern(自然(Nature)，256，495，1975)的方法进行融合操作。融合促进剂的例子是聚乙二醇(PEG)和仙台病毒等，使用PEG是优选的。
骨髓瘤细胞的例子是NS-1，P3U1，SP2/0，AP-1等。使用P3U1是优选的。所使用的抗体产生细胞(脾脏细胞)的数量对骨髓瘤细胞的数量的优选的融合比率在约1∶1到20∶1的范围内。以约10-80％的浓度添加PEG(优选的是PEG 1000)后，接着在20-40℃培养20-40分钟，可以进行有效的细胞融合。
可以用各种方法筛选产生抗G蛋白质偶联受体抗体之杂交瘤。例如，将杂交瘤培养物上清液加入到固相(例如，微量培养板)(G蛋白偶联受体蛋白质抗原直接或经载体吸附到其上)上，然后向其中加入由放射性物质、酶等标记的抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞是小鼠的细胞时使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或者蛋白质A，再测定结合到固相上的抗G蛋白质偶联受体单克隆抗体；或者将杂交瘤培养物上清液加入到固相上(抗免疫球蛋白或蛋白质A吸附到其上)，然后向其中加入由放射性物质或酶等标记的抗免疫球蛋白抗体，再测定结合到固相上的抗G蛋白质偶联受体单克隆抗体。
可以用本领域技术人员已知的方法或其类似的方法进行产生本抗G蛋白质偶联受体抗体之杂交瘤的选择和克隆。通常在含有HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的动物细胞培养基中进行。就选择、克隆和生长培养基而言，任何培养基都可使用，只要杂交瘤在其中可以生长。所说培养基的例子是RPMI1640培养基(Daimippon制药有限公司，日本)、含有1-20％胎牛血清的GIT培养基(Wako Chemical，日本)和用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101，Nissui Seiyaku，日本)。培养温度通常为20-40℃，优选的为约37℃。培养时间通常为3天-3周，优选的为1-2周。培养通常在二氧化碳气体中进行。可以用与以上提到的测定血清中本抗G蛋白质偶联受体抗体滴度测定方法相同的方法测定杂交瘤培养物上清液的抗体滴度。
可以本领域技术人员已知的方法或其类似的方法进行克隆。优选的是在现代无血清培养基中培养克隆的杂交瘤，以获得上清液中抗体的最佳量。靶单克隆抗体最好也从源于腹膜内注射活杂交瘤细胞的小鼠的腹水获得。
(2)单克隆抗体的纯化与分离/纯化常规的多克隆抗体相似，可以用以下分离/纯化免疫球蛋白的方法进行本抗G蛋白质偶联受体抗体的分离/纯化盐析、用乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、用离子交换剂(例如DEAE)的吸附/解吸、超离心、凝胶过滤以及特定的纯化方法，在所说特的纯化方法中，经用活性吸附剂(例如结合抗原的固相，蛋白质A或蛋白质G)处理，进聚集抗体，在获得抗体时裂解其中的键。
由上述方法(1)或(2)的方法制备的本发明的G蛋白质偶联受体抗体可以特异性地识别G蛋白质偶联受体，因此，它能用于定量测定待测液体样品中G蛋白质偶联受体，特别是用于经夹心免疫测定法定量测定。
因此，本发明提供了例如以下方法(i)定量测定待测液体样品中G蛋白质偶联受体的方法，该方法包括(a)竞争性地将待测液体样品和标记的G蛋白质偶联受体与抗体反应，所说抗体与本发明的G蛋白质偶联受体反应，和(b)测定与所说抗体结合的标记的G蛋白质偶联受体的比率；和(ii)定量测定待测液体样品中G蛋白质偶联受体的方法，该方法包括(a)同时或先后将待试样品与固定在不溶性载体上的抗体和标记的抗体反应，和(b)测定在不溶性载体上的标记试剂的活性，其中一种抗体能够识别G蛋白质偶联受体N-末端区，而另一种抗体能够识别G蛋白质偶联受体的C-末端区。
当使用本发明的识别G蛋白质偶联受体的单克隆抗体(此后可以称作“抗G蛋白质偶联受体抗体”)时，可以测定G蛋白质偶联受体，而且也可以经组织染色等方法进行测定。为这一目的，可以使用前述的抗体分子，也可以使用抗体分子的F(ab’)2或Fab’。采用本发明的抗体的测定方法没有特定的限制，任何测定方法都可以使用，只要其涉及这样一种方法，即其中的抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量(其取决于或相应于待测样品中抗原的量(例如，G蛋白质偶联受体等的量))由化学或物理方法测定，然后由经含有已知量的抗原的标准溶液制成的标准曲线计算。例如，可以合适地使用nephrometry、竞争性方法、夹心方法。就敏感性和特异性而言，此后将要描述的夹心方法是特别优选的。
用于采用标记物质的测定方法中的标记试剂的例子是放射性同位素、酶荧光物质、发光物质、胶体、磁性物质等。放射性同位素的例子是〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕和〔14C〕；酶的优选的例子是稳定的和具有大的特异性活性的的那些，例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶过氧化物酶和苹果酸酯脱氢酶；荧光物质的例子是荧光胺、荧光素和异硫氰酸盐等；发光物质的例子是鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤虫素、lucigenin等；此外，生物素-亲和素系统也可以用于抗体或抗原与标记试剂的结合。
在抗原或抗体的不溶化(固定化)中，可以使用物理吸附，或者也可以使用通常用于不溶化或固定化蛋白质或酶的化学结合。载体的例子是不溶性多糖(例如琼脂糖、葡萄糖和纤维素)、合成树脂(例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷)、玻璃等。
在夹心(或两边)方法中，使待测液体与不溶性本抗G蛋白质偶联受体抗体反应(第一反应)，然后使其与标记的本抗G蛋白质偶联受体抗体反应(第二反应)，然后测定在不溶性载体上的标记试剂的活性，由此可以确定待测液体中的G蛋白质偶联受体的量。第一反应和第二反应可以颠倒或同时进行，或者它们可以间歇进行。标记试剂的类型和不溶化(固定化)方法可以与本文已提到的那些相同。在经夹心方法的免疫测定中，用于标记抗体的抗体和用于固定相的抗体是一种类型或荧光种类，但就改善测定敏感性等而言，也可以使用两种或多种抗体的混合物。
在经本发明的夹心方法测定G蛋白质偶联受体的方法中，用于第一和第二反应的优选的抗G蛋白质偶联受体抗体是各不相同的。由此用于第一和第二反应的抗体是这样一些，即其中当用于第二反应的抗体识别G蛋白质偶联受体C-末端区时，则识别非C-末端区的位点，即识别N-末端区的抗体优选地用于第一反应中。
本发明的抗G蛋白质偶联受体抗体可以用于非夹心方法的测定系统，例如竞争性方法，immunometric方法和nephrometry。在竞争性方法中，使待测溶液中的抗原和标记抗原以竞争性方式与抗体反应，然后将未反应的标记试剂(F)和与抗体结合的标记抗原(B)(即B/F)分离，测定任何B和F的标记的量，由此确定待测溶液中的抗原的量。就这种反应的方法而言，有一种液相方法(其中可溶性抗体用作抗体，经聚乙二醇进行B/F分离，第二抗体是以上提到的抗体等)和固相方法(其中固定化抗体用作第一抗体或可溶性抗体用作第一抗体，而固定化抗体用作第二抗体。
在immunometric方法中，将待测溶液中的抗原和固定化抗原与一定量的标记抗体进行竞争性的反应，接着分离成固相和液相；或者在加入固定化第一与结合未反应的标记抗体时将待测溶液中抗原和过量的标记抗体与固相标记抗体反应，分离成固相和液相。此后，测定任何相的标记的量，确定待测溶液中的抗原的量。
在nephrometry中，测定不溶性沉淀(其是作为凝胶或溶液中抗原-抗原反应的结果产生的)的量。即使待测溶液中的抗原量很小和获得的沉淀量很小时，其中散射激光的激光nephrometry也可以合适地使用。
在采用这些免疫学测定方法(免疫测定)为本发明的沉淀方法中，不需要建立任何特定的条件、其操作方法等。本领域技术人员从技术的角度考虑常规的条件和操作方法就可以建立G蛋白质偶联受体测定系统(试验系统)。这些常规技术方法的详细的内容可参见各种综述、参考书等。它们是例如Hiroshi Irie(ed)″发射免疫测定(Radioimmunoassay)″(Kodansha，日本)，1974；Hiroshi Irie(ed)″放射免疫测定；第二系列″(Kodansha，日本)，1979；Eiji Ishikwa等.(ed)″酶免疫测定(enzyme Immunoassay)″(Igaku Shoin，日本，1978；Eiji Ishikawa等.(ed)″酶免疫测定″(再版)(Igaku Shoin，日本，1982；EijiIshikawa等.(ed)″酶免疫测定″(第三)版本(Igaku Shoin，日本，1987；″酶学中的方法″Vol.70 (免疫化学技术(ImmuochemicalTechniques))(部分A))；同上，Vol.73(免疫化学技术(部分B))；同上，Vol.74(免疫化学技术(部分C))；同上，Vol.84(免疫化学技术(部分D选择免疫测定))；同上，Vol.92(免疫化学技术(部分E单克隆抗体和一般的免疫测定方法；同上，Vol.121个(免疫化学技术(部分I杂交瘤技术和单克隆抗体))(学院出版社)；等等。
7具有本发明的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA之动物的制备用编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA制备编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNAG蛋白质偶联受体之转基因动物是可能的，所说动物的例子是温血动物，例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗和猴。
在将编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA转移进目标动物中，经与能够在动物细胞中表达的启动子下游位点连接使用所说的DNA是有利的。例如，当编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA待转移进兔中时，将与各种启动子(其能够在动物宿主细胞中表达源于相容的动物的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA)下游位点连接的基因构建体微注射进目标动物的受精卵(例如兔的受精卵)中，由此能够制备以高的量产生G蛋白偶联受体蛋白质的转基因动物。
所使用的启动子是源于病毒的启动子，可以使用遍在启动子(例如金属硫蛋白启动子)，但最好使用能够在脑中特异性表达的烯醇化酶基因启动子和NGF启动子。
为了使DNA能够存在于目标动物的所有的胚细胞和体细胞中，在受精卵细胞阶段转移G蛋白偶联受体蛋白质DNA是可靠的。在DNA转移后G蛋白偶联受体蛋白质存在于所产生的转基因动物的受精卵中的事实意味着所有所产生的转基因动物的子代在其所有的胚细胞和体细胞中具有G蛋白偶联受体蛋白质。遗传基因的这一类动物后代在其所有的胚细胞和体细胞中具有G蛋白偶联受体蛋白质。
在证实基因可稳定保留后，转移进G蛋白偶联受体蛋白质DNA的转基因动物可以在普通饲养环境下作为携带所说DNA的动物交配和饲养。使具有所需基因的雄性和雌性动物交配，以产生在两种同源染色体中具有转导基因的同型接合体，然后使那些雄性和雌性动物交配，从而进行生长繁殖以使所有后代具有所说DNA是可能的。
转移进G蛋白偶联受体蛋白质DNA的转基因动物高水平地表达G蛋白偶联受体蛋白质，因此用于筛选所说G蛋白偶联受体蛋白质之激动剂或拮抗剂的动物是有用的。
转移DNA的动物可以用作组织培养的细胞源。例如，直接分析转移DNA的小鼠的组织中的DNA或RNA或者分析基因表达的蛋白质组织，因此分析G蛋白偶联受体蛋白质。用标准的组织培养技术培养包含G蛋白偶联受体蛋白质细胞的组织，由此，用所产生的培养物研究通常培养困难的细胞(例如，源于脑和外周组织的那些)功能是可能的。经使用所说细胞，选择能强化例如各种组织功能的药物是可能的。此外，如果具有高水平表达的细胞株是可获得的，则从其分离和纯化G蛋白偶联受体蛋白质也是可能的。
这样，现在用本发明的本抗G蛋白质偶联受体抗体可以高准确度地测定G蛋白偶联受体蛋白质的量。
8能够抑制G蛋白偶联受体蛋白质基因复制的反义寡核苷酸本发明的另一方面，基于克隆的和测定的编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的核苷酸序列信息，可以设计和合成抑制G蛋白偶联受体蛋白质基因复制之反义寡核苷酸(核酸)。这种反义寡核苷酸(核酸)可以与G蛋白偶联受体蛋白质基因RNA杂交，抑制所说RNA的合成或功能，或者经干扰G蛋白偶联受体蛋白质相关RNA调节G蛋白偶联受体蛋白质基因的表达。在控制或调节G蛋白偶联受体蛋白质基因体外和体内表达中和在治疗或诊断可疑动物的病态中，互补于G蛋白偶联受体蛋白质相关RNA的选择的序列和特异性与其杂交的寡核苷酸是有用的。术语“相应”意指同源于或互补于包含基因的核苷酸序列或核酸。在核苷酸序列(核酸)和肽(蛋白质)之间，“相应”通常指肽(蛋白质)的氨基酸在顺序上源于核苷酸序列(核酸)或其补体。尽管G蛋白偶联受体蛋白质基因中的任何区都可以作为靶，G蛋白偶联受体蛋白质基因5’末端发夹环、5’末端6碱基对重复、5’末端未翻译区、多肽翻译起始位点或密码子、蛋白质编码区、ORF翻译起始密码子、3’未翻译区、3’末端回文结构区或3’末端发夹环可以选作优选的靶。靶和互补于至少靶一部分，可与靶特异性杂交的寡核苷酸之间的关系称作“反义”。反义寡核苷酸可以是包含2-脱氧-D-核糖的多脱氧核苷酸、包含D-核糖的多脱氧核苷酸和其它类型的为N-嘌呤或嘧啶碱基的配糖物的多核苷酸，或包含非核苷酸骨架(例如市售的蛋白质核酸和合成序列特异性核酸聚合物)或非标准连接键的其它聚合物(倘若聚合物包含其构型允许在DNA和RNA中发现的碱基配对和碱基堆叠的多个核苷酸)。它们包括双和单链DNA以及酸和单链RNA，也包括DNARNA杂种以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式、已知类型的修饰物(例如，本领域技术人员已知的标志、“caps”甲基化、一个或多个天然产生的核苷酸由类似物取代)、核苷酸内修饰物(例如具有非荷电连接键(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有荷电连接键或含硫连接键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些)、包含垂悬部分(例如蛋白质(包括核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)和糖类(例如单糖等))的那些、具有嵌入剂(吖啶、补骨脂素等)的那些、具有螯合剂(金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂的那些、具有修饰的连接键(如α异头物核酸等)的那些。术语“核苷”、“核苷酸”和核酸包括那些不仅包含已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且也包含已修饰的杂环碱基的部分。这种修饰包括甲基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤和嘧啶、或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸也包括在糖基部分上的修饰，例如其中一个或多个羟基由卤素和脂肪族基团取代或者功能化为醚、胺等。
本发明的反义核酸是RNA、DNA或修饰的核酸。修饰的核酸包括但不限于核酸的抗降解的硫化的和硫代磷酸酯衍生物和多或寡核苷酸酰胺。本发明的反义核酸的优选的设计的修饰物是有以下设计的核酸的修饰物(1)增加核酸的细胞内稳定性；(2)增加核酸的细胞渗透性；(3)增加核酸对靶有义链的亲和性；或(4)降低核酸的毒性(如果有任何毒性的话)。
许多这样的修饰物对本领域技术人员是已知的，在J.Kawakami等，日本制药技术(Pharm Tech Japan)，Vol.8，pp.247，1992；Vol.8，pp395，1992；S.T.Crooke等ed.，反义研究和应用，CRC出版社，1993；等中有描述。所说核酸可以包含改变的或修饰的糖、碱基或连接键，在特定的系统(脂质体、微球体)中或经基因治疗传递，或者可以具有连接到部分。这种连接的部分包括增强与细胞膜的相互作用或增加核酸摄入的聚阳离子部分(例如作为磷酸盐骨架电荷中和剂的聚赖氨酸)或疏水部分(例如脂质体如磷脂、胆甾醇等)。优选的可以连接的脂质体是胆甾醇或其衍生物(例如胆甾醇基甲酸盐、胆酸等)。该部分可以连接到核酸的3’-末端或5’-末端，也可以经碱基、糖或核苷酸内连接键。其它部分可以是特异性置于核酸的3’-末端或5’-末端以阻止核酸酶(例如外核酸酶、RNA酶等)降解的加帽基团。这种加帽基团包括但不限于本领域技术人员已知的羟基保护基，包括二醇，例如聚乙二醇、四乙二醇等。
可以用本发明的转化体(或转染体)、本发明的体外和体内基因表达系统、蛋G蛋白质偶联受体外和体内翻译系统测定反义核酸的抑制活性。可以用已知的各种方法将所说核酸置入细胞中。
在本申请说明书和附图中用于碱基(核苷酸)、氨基酸等的缩写是IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的那些或本领域习用的那些。以下给出其例子。除非有其它说明，可能有光学异构体的氨基酸指L型的。
DNA脱氧核糖核酸cDNA互补脱氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脱氧腺苷三磷酸dTTP脱氧胸苷三磷酸dGTP脱氧肌苷三磷酸dCTP脱氧胞苷三磷酸ATP三磷酸腺甙EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基硫酸钠EIA酶免疫分析法G， Gly甘氨酸(或甘氨酰基)A， Ala丙氨酸(或丙氨酰)V， Val缬氨酸(或缬氨酰)L， Leu亮氨酸(或亮氨酰)I， Ile 异亮氨酸(或异亮氨酰)S， Ser丝氨酸(或丝氨酰)T， Thr丝氨酰(或苏氨酰)
C， Cys半胱氨酸(或半胱氨酰)M， Met蛋氨酸(或蛋氨酰)E， Glu谷氨酸(或谷氨酰)D， Asp天门冬氨酸(或天门冬氨酰)K， Lys赖氨酸(或赖氨酰)R， Arg精氨酸(或精氨酰)H， His组氨酸(或组氨酰)F， Phe苯基丙氨酸(或苯基丙氨酰)Y， Tyr酪氨酸(或酪氨酰)W， Trp色氨酸(或色氨酰)P， Pro脯氨酸(或脯氨酰)N， Asn天门冬酰胺(或Asparaginyl)Q， Gin谷酰胺(或Glutaminyl)NVal 戊氨酸(或戊氨酰)pGlu 焦谷氨酸(或焦谷氨酰)Blc r-丁内酰胺(Butyrolacton)-r-碳酰Kpc 2-酮基哌啶基-6-碳酰Otc 3-氧代全氢化-1，4-噻嗪-5-碳酰Me 甲基Et 乙基Bu 丁基Ph 苯基TC 噻唑烷基-4(R)-羧酰胺下述实施例3中获得的指定为INVαF’/p19P2的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年8月9日以保藏号BP-4776保藏在国家生物科学和人类技术研究所(NIBH)(日本国际贸易和工业部工业科学技术机构)。该菌株也于1994年8月22日以保藏号IFO15739保藏在日本大阪发酵研究所(IFO)。
下述实施例4中获得的指定为INVαF’/pG3-2的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年8月9日以保藏号BP-4775保藏在NIBH。该菌株也于1994年8月22日以保藏号IFO15740保藏在IFO。
下述实施例5中获得的指定为INVαF’/p63A2的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年8月9日以保藏号BP-4777保藏在NIBH。该菌株也于1994年8月22日以保藏号IFO15738保藏在IFO。
下述实施例6中获得的指定为JM109/phGR3的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年9月27日以保藏号BP-4807保藏在NIBH。该菌株也于1994年9月22日以保藏号IFO15748保藏在IFO。
下述实施例7中获得的指定为JM109/p3H2-17的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年9月27日以保藏号BP-4806保藏在NIBH。该菌株也于1994年9月22日以保藏号IFO15747保藏在IFO。
下述实施例8中获得的指定为JM109/p3H2-34的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1 994年10月12日以保藏号BP-4828保藏在NIBH。该菌株也于1994年10月12日以保藏号IFO15749保藏在IFO。
下述实施例9中获得的指定为JM109/pMD4的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年11月11日以保藏号BP-4888保藏在NIBH。该菌株也于1994年11月17日以保藏号IFO15765保藏在IFO。
下述实施例10中获得的指定为JM109/pMGR20的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年12月15日以保藏号BP-4937保藏在NIBH。该菌株也于1994年12月14日以保藏号IFO15773保藏在IFO。
下述实施例12中获得的指定为JM109/pMJ10的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年12月15日以保藏号BP-4936保藏在NIBH。该菌株也于1994年12月16日以保藏号IFO15784保藏在IFO。
下述实施例14中获得的指定为JM109/pMH28的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1995年1月13日以保藏号BP-4970保藏在NIBH。该菌株也于1995年1月20日以保藏号IFO1 5791保藏在IFO。
下述实施例16中获得的指定为JM109/pMN7的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1995年2月27日以保藏号BP-5011保藏在NIBH。该菌株也于1995年2月27日以保藏号IFO15803保藏在IFO。
下述实施例17中获得的指定为JM109/p5s38的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1994年10月27日以保藏号BP-4856保藏在NIBH。该菌株也于1994年10月25日以保藏号IFO15754保藏在IFO。
下述实施例19中获得的指定为JM109/pMAH2-17的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1995年4月7日以保藏号BP-5073保藏在NIBH。该菌株也于1995年3月31日以保藏号IFO15813保藏在IFO。
下述实施例20中获得的指定为JM109/pMN128的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1995年3月17日以保藏号BP-5039保藏在NIBH。该菌株也于1995年3月22日以保藏号IFO15810保藏在IFO。
下述实施例21中获得的指定为JM109/phAh2-17的转化体大肠杆菌按布达佩斯条约于1995年7月20日以保藏号BP-5168保藏在NIBH。该菌株也于1995年7月14日以保藏号IFO15856保藏在IFO。
本说明书序列表中给出的的各SEQ ID NO指下列序列〔SEQ ID NO24〕是源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列，所述蛋白质由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码。
〔SEQ ID NO25〕是源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列，所述蛋白质由包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码。
〔SEQ ID NO26〕是源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列，所述蛋白质由包含在phGR3中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码。
〔SEQ ID NO27〕是源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列，所述蛋白质由具有SEQ ID NO32的核苷酸序列的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段编码，所述核苷酸序列源于包含在pG3-2和pG1-10中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段核苷酸序列。
〔SEQ ID NO28〕是由p5s38编码的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO29〕是包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO30〕是包含在p19P2中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO31〕是包含在phGR3中的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的完整的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO32〕是源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列源于包含在pG3-2和pG1-10中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO33〕是包含在p5s38中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO34〕是源于人扁桃体的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列，所述蛋白质由包含在p63A2中的cDNA片段编码。
〔SEQ ID NO35〕是源于人扁桃体的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列，所述蛋白质由包含在p63A2中的cDNA片段编码。
〔SEQ ID NO36〕是包含在p63A2中的源于人扁桃体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO37〕是包含在p63A2中的源于人扁桃体的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO38〕是由包含在p3H2-17中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO39〕是由包含在p3H2-17中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA开放读框编码的全长氨基酸序列。
〔SEQ ID NO40〕是包含在p3H2-17中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO41〕是包含在pMAH2-17中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO42〕是由包含在p3H2-34中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA编码的氨基酸序列。
〔SEQ ID NO43〕是包含在p3H2-34中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO44〕是由包含在pMD4中的源于兔胃幽门部分(gastropyrolic patr)平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO45〕是包含在pMD4中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO46〕是由包含在pMGR20中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的完全氨基酸序列。
〔SEQ ID NO47〕是包含在pMGR20中的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO48〕是由包含在pMJ10中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO49〕是包含在pMJ10中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO50〕是由包含在pMH28中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO51〕是包含在pMH28中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO52〕是由包含在pMN7中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO53〕是包含在pMN7中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO54〕是由包含在pMN128中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的部分氨基酸序列。
〔SEQ ID NO55〕是包含在pMN128中的源于兔胃幽门部分平滑肌的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
〔SEQ ID NO25〕是源于人的G蛋白偶联受体蛋白质的全长氨基酸序列，所述蛋白质由包含在phAH2-17中的源于人的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码。
〔SEQ ID NO25〕是包含在phAH2-17中的源于人的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列。
实施例以下描述本发明的实施例，给出这些实施例仅为了说明目的，并不限制本发明的范围。经本发明的公开，本领域技术人员会清楚权利要求范围内的许多实施方案。
实施例1用于扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成DNA的制备比较编码相应于或接近下列各种蛋白质第一跨膜区的已知氨基酸序列的脱氧核糖核苷酸序列源于人的的TRH受体蛋白质(HTRHR)、源于人的RANTES受体蛋白质(L10918、HUMRANTES)、(源于人Burkitt的淋巴瘤未知配体受体蛋白质(X68149、HSBLR1A)、(源于人的生长抑素受体蛋白质L14856、HUMSOMAT)、源于大鼠的μ-阿片样物质受体蛋白质(U02083、RNU02083)、源于大鼠的κ-阿片样物质受体蛋白质(U00442)、U00442、源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482、HUMNMBR)、源于人的毒蕈硷乙酰胆硷受体蛋白质(X15266、HSHM4)、源于大鼠的肾上腺素α1B受体蛋白质(L08609、RATAADREO1)、源于人的生长抑素3受体蛋白质(M96738、HUMSSTR3X)、源于人的C5a受体蛋白质(HUMCSAAR)、源于人的未知配体受体蛋白质(HUMRDC1A)、源于人的未知配体受体蛋白质(M84605、HUMOPIODRE)和源于大鼠的肾上腺素α2B受体蛋白质(M91466、RATA2BAR)。结果(图1)发现了高度同源的区或部分。
此外、比较编码相应于或接近下列各种蛋白质第六跨膜区的已知氨基酸序列的脱氧核糖核苷酸序列源于小鼠的未知配体受体蛋白质(M80481、MUSGIR)、源于人的铃蟾肽受体蛋白质(L08893、HUMBOMB3S)、源于人的腺苷A2受体蛋白质(S46950、S46950)、源于小鼠的未知配体受体蛋白质(D21061、MUSGPCR)、源于小鼠的TRH受体蛋白质(S43387、S43387)、源于大鼠的神经调节肽κ受体蛋白质(505189、RATNEURA)、源于大鼠的腺苷A1受体蛋白质(M69045、RATA1ARA)、源于人的神经调节肽A受体蛋白质(M57414、HUMNEKAR)、源于大鼠的腺苷A3受体蛋白质(M94152、RATADENREC)、源于人的生长抑素1受体蛋白质(M81829、HUMSRI1A)、源于人的神经调节肽3受体蛋白质(S86390、S86371S4)、源于大鼠的未知配体受体蛋白质(X61496、RNCGPCR)、源于人的生长抑素4受体蛋白质(L07061、HUMSSTR4Z)和源于大鼠的GnRH受体蛋白质(M31670、RATGNRHA)。结果发现了高度同源区或部分(图2)。
在括号中的以上的缩写是标识符(参考号)，用DNASIS基因/蛋白质序列数据库(CD019、Hitachi软件工程、日本)检索GenBank EMBL数据库时指定，通常称为“入藏号”或者“登记名”。而HTRHR是在日本未决专利出版物286986/1993(EPA 638645)中公开的序列。
具体地说，依据与编码大量受体蛋白质之cDNA一致的碱基区，计划掺入混合的碱基，以增强序列碱基与许多受体cDNA(可能甚至在其它区)的一致性。基于这些序列，产生具有由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列(互补于图1的同源核苷酸序列)的简并合成DNA和具有由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列(互补于图2的同源核苷酸序列)的简并合成DNA。用DNA合成器进行核苷酸合成。5＇-CGTGG(G或C)C(A或C)T(G或C)(G或C)TGGGCAAC(A，G，C或T)(C或T)CCTG-3＇(SEQ ID NO1)5＇-GT(A，G，C或T)G(A或T)(A或G)(A或G)GGCA(A，G，C或T)CCAGCAGA(G或T)GGCAAA-3＇(SEQ ID NO2)括号中指明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换言之，上述DNA的括号中的核苷酸残基合成时在多种碱基混合物的存在下掺合。
实施例2分离编码人生长抑素受体蛋白质之DNA、编码人D5多巴胺受体蛋白质之DNA、编码大鼠抑生长素受体蛋白质之DNA(1)经聚合酶链反应(PCR)扩增DNA将从人脑扁桃体、人垂体和大鼠脑制备的cDNA(Quickclone，CLONTECH Laboratories)各1ng为模板，实施例1中制备的DNA引物各1μM、2.5mMdNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸酯)和2.5单位TaqDNA聚合酶(Takara Shuzo公司，日本)与酶试剂盒所附的缓冲液一起混合，使总量为100微升。用Perkin-Elmer公司制造的热循环器进行聚合酶链反应。设定一个循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟。总的这一循环重复30次扩增DNA。由1.2％琼脂糖凝胶电泳证实DNA的扩增〔图17〕。
(2)分离扩增的DNA和分析DNA序列采用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)，将PCR扩增的DNA插入到质粒载体PCRTMII。将DNA转染进附在试剂盒上的大肠杆菌中，形成扩增DNA文库。在基于添加X-胶(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷酶)的LB(Luria-Bertani)平板上的β-半乳糖苷酶活性的引导下选择转化体形成的菌落，以便仅分离其中插入DNA片段的白色菌落。将它们在添加氨苄青霉素的培养基中培养，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)制备质粒DNA。
将一份由此制备的DNA进一步用EcoRI消化，证实插入的DNA片段。将一份由此制备的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(应用生物系统公司)对所形成的产物进行测序反应。
用应用生物系统公司制造的370A荧光自动测序仪进行测序。用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析获得的核苷酸序列。所获得的核苷酸序列示于图18、19、20和21中。这些图和同源性检索的结果说明所获得的DNA是编码可以各自分类到G蛋白偶联受体蛋白质的一个组的人抑生长素受体蛋白质〔图18和19〕、编码人D5多巴胺受体蛋白质〔图20〕、编码大鼠生长抑素受体蛋白质〔图21〕。
在以下描述的图18中，DNA的核苷酸序列与编码人抑生长素受体(HUMSOMAT)的核苷酸序列一致，克隆A58是人生长抑素受体cDNA。下划线部分代表用于PCR的5’侧合成DNA引物。这样，即使核苷酸序列部分错配，经PCR也足够有效地扩增。
从图19将会看到，即使从相对的一边进行测序，克隆A58也与编码人生长抑素受体(HUMSOMAT)有好的一致性。下划线部分代表用于PCR的3’侧合成DNA引物。在这一图中，即使在非引物部分的部分也有某种程度的核苷酸序列错配，可能是由于PCR时碱基取代或者由于测序反应的部分偏差。需要时，可以经链互补测序证实。
在以下描述的图20中，除了引物部分(下划线)外，DNA的核苷酸序列与编码人D5多巴胺受体(HUMDRD5A)有好的一致性。说明克隆57-A-2是人D5多巴胺受体cDNA。
在以下描述的图21中，除了引物部分(下划线)外，DNA的核苷酸序列与编码大鼠抑生长素受体(RUN04738)有好的一致性。说明克隆B54是大鼠抑生长素受体cDNA。
实施例3分离编码源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人(1)用源于人垂体的cDNA经PCR扩增受体cDNA用源于人垂体的cDNA(QuickClone，CLONTECH，Laboratories，Inc.)为模板，用实施例1中合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各1μM、1ng模板DNA、2.5mMdNTPs、1μTaqDNA聚合酶和酶试剂盒所附的缓冲液使反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括95℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟，总的这一循环重复30次。由1.2％琼脂糖凝胶电泳证实DNA的扩增〔图17〕。在加入TaqDNA聚合酶之前，混合剩下的反应溶液，在95℃加热5分钟，在65℃加热5分钟。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(2)将PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用0.8％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII(TM代表注册商标)。将重组载体引入到大肠杆菌INVαF’感受态细胞(Invitrogen公司)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌INVαF’/p19P2。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。下划线部分代表相应于合成引物的区〔图22和图23〕。
基于测定的核苷酸序列〔图22和图23〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌INVαF’/p19P2包含的质粒p19P2中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图22和图23〕，进行疏水性作图〔图24和图25〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与神经肽Y受体蛋白质相关的同源性〔图26〕。
实施例4分离编码源于小鼠胰腺的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人(1)从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液(pH8.0的10mMTris-HCl，pH8.0的1mM EDTA)中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备的cDNA为模板，用实施例1中合成的DNA引物在与实施例3(2)相同的条件下进行PCR扩增。以与实施例2相同的方式将所形成的PCR产物亚克隆进质粒载体PCRTMII中，获得质粒pG3-2。将pG3-2转染进大肠杆菌INVαF’获得转化体大肠杆菌INVαF’/p G3-2。
以从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备的cDNA为模板，在与实施例1相同的条件下用Libert F.等“科学，244569-572，1989”中公开的DNA引物进行PCR扩增。所述的引物是一种由以下序列代表的简并合成引物5’-CTGTG(C或T)G(C或T)(G或C)AT(C或T)GCIIT(G或T)GA(C或T)(A或C)G(G或C)TAC-3’(SEQ ID NO60)，其中I是肌苷；和一种由以下序列代表的简并合成引物5’-A(G或T)G(A或T)AG(A或T)AGGGCAGCCAGCAGAI(G或C)(A或C)(C或T)GAA-3’(SEQ ID NO61)，其中I是肌苷。以与实施例3(2)相同的方式将所形成的PCR产物亚克隆进质粒载体PCRTMII中，获得质粒pG1-10。
采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行确定核苷酸序列(测序)反应，用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析。
图27示出了编码源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质之DNA和氨基酸序列，所述氨基酸序列是由基于转化体大肠杆菌INVαF’/p G3-2携带的质粒pG3-2和pG1-10的核苷酸序列的分离的DNA编码。下划线部分代表相应于合成引物的区。
基于测定的核苷酸序列〔图27〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由所获得的cDNA编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图27〕，进行疏水性作图证实6个疏水区的存在〔图28〕。此外，通过将所述氨基酸序列与实施例3中获得的p19P2编码的氨基酸序列比较，发现如图61所示的高级别的同源性。结果有力地说明，pG3-2和pG1-10编码的G蛋白偶联受体蛋白质识别的配体与p19P2编码的G蛋白偶联受体蛋白质所识别的相同，而pG3-2和pG1-10编码的受体蛋白质所源于的动物物种却不同于p19P2编码的受体蛋白质所源于的。
实施例5分离编码源于人扁桃体的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人(1)用源于人扁桃体的cDNA经PCR扩增受体cDNA用源于人扁桃体的cDNA(QuickClone，CLONTECH，Laboratories，Inc.)为模板，用实施例1中合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各1μM、1ng模板DNA、2.5mMdNTPs、1μTaqDNA聚合酶和酶试剂盒所附的缓冲液使反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括95℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟，总的这一循环重复30次。由1.2％琼脂糖凝胶电泳证实DNA的扩增〔图17〕。在加入TaqDNA聚合酶之前，混合剩下的反应溶液，在95℃加热5分钟，在65℃加热5分钟。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(2)将PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用0.8％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌INVαF’感受态细胞(Invitrogen公司)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌INVαF’/p63A2。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。
基于测定的核苷酸序列〔图29和图30〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌INVαF’/p63A2包含的质粒p63A2中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图29和图30〕，进行疏水性作图〔图31和图32〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与小鼠GIR相关的同源性〔图33〕。
实施例6克隆编码源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人(1)从源于人垂体的cDNA文库克隆受体蛋白质全编码区由Clontech公司构建DNA文库，其中使用的λgtll噬菌体载体(CLONTECH Laboratories，Inc.；CLH L1139b)用作源于人垂体的cDNA文库。将人垂体cDNA文库(2×106pfu(噬斑形成单位))与硫酸镁处理过的大肠杆菌Y1090-混合。与37℃培养15分钟，接着加入0.5％琼脂(Pharmacia公司)LB。将所说大肠杆菌平板接种到1.5％琼脂(Wako-Junyaku公司)LB平板(包含50微克/毫升)上。将硝基纤维素滤膜置于其上形成噬斑的平板上。用碱使滤膜变性，然后在80℃加热3小时固定DNA。
于42℃在缓冲液中将所说滤膜与本文以下提及的探针一起温育过夜，所说缓冲液包含50％甲酰胺、5×SSPE(20×SSPE(pH7.4)是3M NaCl，0.2M NaH2PO4H2O，25mMEDTA)、5×Denhardt’s溶液(Nippon Gene，日本)、0.1％SDS和100微克/毫升供杂交用的鲑精DNA。
所使用的探针是经用EcoRI切下插入到实施例3获得的质粒p19P2中的DNA片段，接着回收和用随机引物DNA标记试剂盒(Amasham公司)掺合〔32P〕dCTP(Dupont公司)获得的。
用2×SSC(20×SSC是3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)和0.1％SDS于55℃洗涤一小时，然后于-80℃进行放射自显影检测杂交噬斑。
在这一筛选中，在3个单独的噬斑中识别出杂交信号。从这3个克隆制备各自的DNA。将用EcoRI消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并用与筛选中使用的相同的探针经DNA印迹分析。分别在约0.7kb，0.8kb和2.0kb鉴别出杂交带。从其中选择约相应于约2.0kb(λhGR3)处带的DNA片段。将具有可杂交大小的源于λhGR3的EcoRI片段亚克隆进质粒pUC18的EcoRI位点，用所说质粒转化大肠杆菌JM109，获得转化体大肠杆菌JM109/phGR3。依据从实施例3所示核苷酸序列推导的限制性酶切图制成质粒phGR3的限制性酶切图。结果说明其携带从实施例3所示的编码受体蛋白质之DNA预测的全长编码受体蛋白质之DNA。
(2)测序源于人垂体的受体蛋白质cDNA在插入进以上步骤(1)获得的质粒phGR3中的EcoRI片段中，测序被认为是受体蛋白质编码区的约1330bp的EcoRI到NheI核苷酸序列。简言之，经利用存在于EcoRI片段中的限制酶位点，除去不需要的部分或者亚克隆需要的片段，以制备供分析核苷酸序列的模板质粒。
采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行确定核苷酸序列(测序)反应，用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析。
图34示出了phGR3的紧靠EcoRI位点后到NheI位点的核苷酸序列。编码源于人垂体的受体蛋白质之DNA相应于118-123位核苷酸的核苷酸序列〔图34〕。被所说核苷酸序列编码的受体蛋白质氨基酸序列示于图34中。图36示出了基于氨基酸序列的疏水性作图的结果。
(3)与编码源于人垂体的受体蛋白质之phGR3的northern杂交为了在mRNA水平上检测垂体中phGR3编码的源于人垂体的受体蛋白质的表达，进行RNA印迹。用人垂体mRNA(2.5微克，Clontech公司)作为模板，与实施例5中相同的探针为探针。以尼龙膜(Pall Biodyne，U.S.A.)为RNA印迹滤膜。按照《分子克隆》(Molecular Cloning)(ColdSpring Harbor Lab.出版社，1989)中描述的方法用印迹滤膜进行RNA迁移和其吸附(吸收)试验。
通过将以上提到的滤膜与探针在含有50％甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS和100微克/毫升鲑精DNA的缓冲液中42℃下温育过夜进行杂交。用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃洗涤滤膜，经空气干燥后，于-80℃暴露于X-光胶片(XAR5、Kodak)下3天。结果示于图35中，从该图可以认为，phGR3受体基因在人垂体中被表达。
实施例7克隆源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备的cDNA为模板，用实施例1中合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mMdNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复30次。在加入TaqDNA聚合酶之前，混合剩下的反应溶液，在95℃加热5分钟，在65℃加热5分钟。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用0.8％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌JM109/p3H2-17。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DveDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。
基于测定的核苷酸序列〔图37〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/p3H2-17包含的质粒中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图37〕，进行疏水性作图〔图38〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与鸡ATP受体(P34996)、人促生长素抑制素4亚型(JN0605)和小牛神经肽Y受体(S28278)相关的同源性〔图39〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”。
实施例8克隆源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA
按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备的cDNA为模板，用实施例1中合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mMdNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复30次。在加入TaqDNA聚合酶之前，混合剩下的反应溶液，在95℃加热5分钟，在65℃加热5分钟。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用0.8％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌JM109/p3H2-34。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。
基于测定的核苷酸序列〔图40〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/p3H2-34包含的质粒中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图40〕，进行疏水性作图〔图41〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与人促生长素抑制素受体2亚型(B41795)和源于大鼠的配体未知受体(A39297)相关的同源性〔图42〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”或“登记名”。
实施例9克隆源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从兔胃幽门部分平滑肌制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中(Tris-EDTA溶液)。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备的cDNA为模板，用实施例1中合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mM dNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复25次。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用1.0％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌JM109/pMD4。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。确定的核苷酸序列示于图43中，图43说明单链cDNA片段仅由实施例1中合成的具有SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物从两边扩增。
基于测定的核苷酸序列〔图43〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/pMD4包含的质粒中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图43〕，进行疏水性作图〔图44〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与源于大鼠的配体未知受体(A35639)相关的同源性〔图45〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”。
实施例10从源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA文库克隆包含受体蛋白质全编码区的cDNA(1)从源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的cDNA文库克隆包含受体蛋白质全编码区的cDNABRL公司出售的SuperscriptTMλ系统(BRL产品编号8256)和Stratagene公司出售的Glgapack II Gold(Stratagene产品编号200215)用于构建源于MIN6的cDNA文库。通过使用上述试剂盒，从10微克MIN6 poly(A)+RNA构建具有2.2×106pfu(噬斑形成单位)MIN6cDNA文库。将所说cDNA文库与硫酸镁处理过的大肠杆菌Y1090-混合。与37℃培养15分钟，接着加入0.5％琼脂(Pharmacia公司)LB。将所说大肠杆菌平板接种到1.5％琼脂(Wako-Junyaku公司)LB平板(包含50微克/毫升)上。将硝基纤维素滤膜置于其上形成噬斑的平板上。用碱使滤膜变性，然后在80℃加热3小时固定DNA。
于42℃在缓冲液中将所说滤膜与本文以下提及的探针一起温育过夜，所说缓冲液包含50％甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS和100微克/毫升供杂交用的鲑精DNA。
所使用的探针是经用EcoRI切下插入到实施例8获得的质粒p3H2-34中的DNA片段，接着回收和用随机引物DNA标记试剂盒(Amasham公司)掺合〔32P〕dCTP(Dupont公司)获得的。
用2×SSC(150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)和0.1％SDS于55℃洗涤一小时，然后于-80℃进行放射自显影检测杂交噬斑。
在这一筛选中，在2个单独的噬斑中识别出杂交信号。从这3个克隆制备各自的DNA。将用SalI和NotI消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳并被分析。分别在约2.0kb和3.0kb鉴别出插入片段。从其中选择约相应于约3.0kb(λNo.20)处带的DNA片段。将具有约3.0kb的源于λNo.20的NotI-SalI片段亚克隆进质粒pBluescriptTMII SK(+)的NotI-SalI位点，用所说质粒转化大肠杆菌JM109，获得转化体大肠杆菌JM109/pMGR20。依据从实施例8所示核苷酸序列推导的限制性酶切图制成质粒pMGR20的限制性酶切图。结果说明其携带从实施例8所示的编码受体蛋白质之DNA预测的全长编码受体蛋白质之DNA。
(2)测序源于MIN6的受体蛋白质全长cDNA在插入进以上步骤(1)获得的质粒pMGR20中的NotI-SalI片段中，测序约1607bp的核苷酸序列，该核苷酸序列不仅包括被认为是受体蛋白质编码区的区(ORF)而且也包括其邻近区。简言之，经利用存在于NotI-SalI片段中的限制酶位点，除去不需要的部分或者亚克隆需要的片段，以制备供分析核苷酸序列的模板质粒。就所说区部分的核苷酸序列而言，基于已确定的核苷酸序列合成测序引物并用于证实。
采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行确定核苷酸序列(测序)反应，用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析。
图46示出了由pMGR20中cDNA插入物编码的小鼠galanin受体蛋白质开放读框(ORF)周围的核苷酸序列。编码小鼠galanin受体蛋白质之DNA相应于图46的48-1525位核苷酸的核苷酸序列。被所说核苷酸序列编码的受体蛋白质氨基酸序列示于图34中。图36示出了基于氨基酸序列的疏水性作图的结果。将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图46〕并进行疏水性作图〔图47〕。因为所说氨基酸序列在氨基酸水平上具有与源于人的galanin受体蛋白质92％的同源性〔图48〕，所以这说明pMGR20中cDNA插入物是编码源于小鼠的galanin受体蛋白质的cDNA。
实施例11制备扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成DNA引物通过在已知G蛋白质偶联受体中比较相应于或接近第三跨膜区〔图4中3C和3D〕和第六跨膜区〔图6中6C〕的核苷酸序列发现了高度同源的部分，所说受体即，源于大鼠的血管紧张肽II受体蛋白质(L32840)、源于大鼠的血管紧张肽Ib受体蛋白质(X64052)、源于大鼠的血管紧张肽受体蛋白质亚型(M90065)、源于人的血管紧张肽Ia受体蛋白质(M91464)、源于大鼠的缩胆囊素A受体蛋白质(M88096)、源于大鼠的缩胆囊素B受体蛋白质(M99418)、源于人、的缩胆囊素B受体蛋白质(L04473)、源于小鼠的低亲和性白细胞介素8受体蛋白质(M73969)、源于人的高亲和性白细胞介素8受体蛋白质(X65858)、源于小鼠的C5a过敏毒素受体蛋白质(S46665)、源于人的N-甲酰基肽受体蛋白质(M60626)等。
在括号中的以上的缩写是参考号，用DNASIS基因/蛋白质序列数据库检索GenBank EMBL数据库时指定，通常称为“入藏号”。
依据与编码大量受体蛋白质之cDNA一致的碱基区，计划掺入混合的碱基，以增强序列碱基与许多受体cDNA(可能甚至在其它区)的一致性。基于这些序列，产生具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列(互补于图4的同源核苷酸序列)的简并合成DNA(图43D)和具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的简并合成DNA(互补于图6的6CD核苷酸序列)。用DNA合成器进行核苷酸合成。5＇-CTCGC(G或C)GC(C或TC)T(A或C)TI(A或G)G(C和T)A TGGA(C和T)CGITAT-3’(SEQ ID NO3)5＇-CAGTG(A或G)G(T或A)AGGGAAICCAG(G或C)A(A或C)AI(A或G)A(A或G)(A或G)AA-3＇(SEQ ID NO2)括号中指明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换言之，倘若I指肌苷，上述DNA的括号中的核苷酸残基合成时在多种碱基混合物的存在下掺合。
实施例12克隆源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从兔胃幽门部分平滑肌制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备的cDNA为模板，用具有由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物和在实施例11中合成的具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mM dNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复25次。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用1.0％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌JM109/pMJ10。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。确定的核苷酸序列示于图49中。
基于测定的核苷酸序列〔图43〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/pMJ10包含的质粒中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图49〕，进行疏水性作图〔图50〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与源于人配体未知受体蛋白质(B42009)、人N-甲酰基肽受体蛋白质(A46520)、小鼠C5a过敏毒素受体蛋白质(A46525)和小牛神经肽Y受体蛋白质(S28787)相关的同源性〔图51〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR/Swiss-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”。
实施例13用于扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成DNA的制备在下列已知氨基酸序列中比较编码相应于或接近第三跨膜区的核苷酸序列蛋白质(X69676)，源于大鼠的缓激肽B2受体蛋白质(M599967)，源于小鼠的铃蟾肽受体蛋白质(M35328)，源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482)，源于人的胃泌素释放肽受体蛋白质(M73481)，源于人的铃蟾肽受体蛋白质亚型3(L08893)，源于小鼠的物质κ受体蛋白质(X62933)，源于小鼠的物质P受体蛋白质(X62934)，源于大鼠的神经激肽3受体蛋白质(J05189)，源于大鼠的内皮素受体蛋白质(M60786)，源于大鼠的配体未知受体蛋白质(L04672)，(X61496)，(x59249)和(L09249)，源于小鼠的配体未知受体蛋白质(P30731)，源于人的配体未知受体蛋白质(M31210)和(U03642)，等等。具体地说，依据与编码大量受体蛋白质cDNA一致的核苷酸序列区，合成具有高度相同的碱基(高同源性核苷酸)核苷酸序列(图3中3B；SEQ ID NO6)的简并DNA引物，以增强序列碱基与许多受体cDNA(可能甚至在其它区)的一致性。用DNA合成器进行核苷酸合成。
由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列是5’-CTGAC(C或T)G(C或T)TCTI(A或G)(G或C)I(A或G)(C或T)TGAC(A或C)G(A，C或G)TAT-3’括号中指明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换言之，倘若I指肌苷，上述DNA的括号中的核苷酸残基合成时在多种碱基混合物的存在下掺合。
此外、在下列已知氨基酸序列中比较编码相应于或接近第六跨膜区的核苷酸序列蛋白质(X69676)，源于大鼠的缓激肽B2受体蛋白质(M599967)，源于小鼠的铃蟾肽受体蛋白质(M35328)，源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482)，源于人的胃泌素释放肽受体蛋白质(M73481)，源于人的铃蟾肽受体蛋白质亚型3(L08893)，源于小鼠的物质κ受体蛋白质(X62933)，源于小鼠的物质P受体蛋白质(X62934)，源于大鼠的神经激肽3受体蛋白质(J05189)，源于大鼠的内皮素受体蛋白质(M60786)，源于大鼠的配体未知受体蛋白质(L04672)，(X61496)，(x59249)和(L09249)，源于小鼠的配体未知受体蛋白质(P30731)，源于人的配体未知受体蛋白质(M31210)和(U03642)，等等。具体地说，依据与编码大量受体蛋白质cDNA一致的核苷酸序列区，合成互补于具有高度相同的碱基(高同源性核苷酸)核苷酸序列(图5中6A)之核苷酸序列(SEQ ID NO8)的简并DNA引物，以增强序列碱基与许多受体cDNA(可能甚至在其它区)的一致性。
由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列是5’-GATGTG(A或G)TA(A或G)GG(G或C)(A或G)ICCAACAGAIG(A或G)(C或T)AAA-3’括号中指明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换言之，倘若I指肌苷，上述DNA的括号中的核苷酸残基合成时在多种碱基混合物的存在下掺合。
在括号中的以上的缩写是参考号，用DNASIS基因/蛋白质序列数据库(CD019、Hitachi软件工程、日本)检索GenBank EMBL数据库时指定，通常称为“入藏号”。
实施例14克隆源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从兔胃幽门部分平滑肌制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备的cDNA为模板，用具有由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物和在实施例13中合成的具有由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mM dNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复25次。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用1.0％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，加热融化，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得转化体大肠杆菌JM109/pMH28。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。确定的核苷酸序列示于图52中。
基于测定的核苷酸序列〔图52〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/pMH28包含的质粒中的cDNA片段编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图52〕，进行疏水性作图〔图53〕和进行同源性检索，在氨基酸水平上寻找与小鼠IL-8受体蛋白质(P35343)、人生长抑素受体蛋白质1(A41795)、和人生长抑素受体蛋白质4(A47457)相关的同源性〔图54〕。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR或SWISS-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”。
实施例15用于扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成DNA的制备在下列已知氨基酸序列中比较编码相应于或接近第二跨膜区的核苷酸序列源于人的galanin受体(HUMGALAREC)，源于大鼠的α-1B-肾上腺素能受体(RATADR1B)，源于人的β-1-肾上腺素能的受体(HUMADRB1)，源于兔的IL-8受体(RABIL8RSB)，源于人的阿片样物质受体(HUMOPIODRE)，源于小牛的物质κ受体(BTSKR)，源于人的生长抑素受体-2(HUMSTRI2A)，源于人的生长抑素受体-3(HUMSSTR3Y)，源于人的胃泌素受体(HUMGARE)，源于人的缩胆囊素A受体(HUMXXKAR)，源于人的多巴胺受体-D5(HUMD1B)，源于人的血清素受体5HT1E(HUM5HT1E)，源于人的多巴胺受体D4(HUMD4C)，源于小鼠的血清素受体-2(MMSERO)，源于大鼠的α-1A-肾上腺素能受体(RATADRA1A)，源于大鼠的组胺H2受体(S57565)，等等。具体地说，依据与编码大量受体蛋白质cDNA一致的核苷酸序列区，合成具有高度相同的碱基(高同源性核苷酸)的核苷酸序列(图7中T2A；SEQ ID NO10)的简并DNA引物，以增强序列碱基与许多受体cDNA(可能甚至在其它区)的一致性。用DNA合成器进行核苷酸合成。
由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列是5’-GYCACCAACN2WSTTCATCCTSWN2HCTG-3’其中S代表G或C；Y代表C或T；W代表C或T；H代表A、C或T；和N2代表I。
括号中指明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换言之，倘若I指肌苷，上述DNA的括号中的核苷酸残基合成时在多种碱基混合物的存在下掺合。
此外、在下列已知氨基酸序列中比较编码相应于或接近第七跨膜区的核苷酸序列源于人的galanin受体(HUMGALAREC)，源于大鼠的Al腺苷受体(RAT1ADREC)，源于猪的血管紧张素受体(PIGA2R)，源于大鼠的血清素受体(RATSHTRTC)，源于人的多巴胺受体(S58541)，源于人的胃泌素释放肽受体(HUMGRPR)，源于小鼠的GRP/铃蟾肽受体(MUSGRPBOM)，源于大鼠的脉管1型血管紧张素受体(RRVT1AIIR)，源于人的毒蕈硷乙酰胆碱受体(HSHM4)，源于人的β-肾上腺素能受体(HUMDRB1)，源于人的胃泌素受体(HUMGARE)，源于大鼠的缩胆囊素受体(RATCCKAR)，源于大鼠的配体未知受体(S59748)，源于人的生长抑素受体(HUMSST28A)，源于大鼠的配体未知受体(RNGPROCR)，源于小鼠的生长抑素受体1(MUSSRI1A)，源于人的α-Al-肾上腺素能受体(HUMA1AADR)，源于小鼠的δ-阿片样物质受体(S66181)，源于人的生长抑素受体-3(HUMSSTR3Y)，等等。具体地说，依据与编码大量受体蛋白质cDNA一致的核苷酸序列区，合成具有高度相同碱基(高同源性核苷酸)的核苷酸序列之核苷酸序列(图8中T7A，SEQ ID NO11)的简并DNA引物，以增强序列碱基与许多受体cDNA(可能甚至在其它区)的一致性。用DNA合成器进行核苷酸合成。
由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列是5’-ASN2SAN2RAAGSARTAGAN2GAN2RGGRTT-3’其中R代表A或G；S代表G或C；和N2代表I。
括号中指明掺合多种碱基，导致引物制备中的多种寡核苷酸。换言之，倘若I指肌苷，上述DNA的括号中的核苷酸残基合成时在多种碱基混合物的存在下掺合。
在括号中的以上的缩写是参考号，用DNASIS基因/蛋白质序列数据库(CD019、Hitachi软件工程、日本)检索GenBank EMBL数据库时指定，通常称为“入藏号”。
实施例16克隆源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从兔胃幽门部分平滑肌制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备的cDNA为模板，用具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和在实施例15中合成的具有由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mM dNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复25次。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用1.4％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，并电洗脱，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得100个转化体克隆。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机PI-100(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA。
基于测定的核苷酸序列〔图52〕用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/pMN包含的质粒中的cDNA片段编码。图56和图57示出了cDNA片段的核苷酸序列。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图55和图56〕，进行疏水性作图〔图57〕。结果证实了指明其为G蛋白偶联受体蛋白质的疏水区的存在。另外在氨基酸水平上进行同源性检索，发现所说DNA是具有相对源于大鼠的β3肾上腺素受体蛋白质(A41679)的27％同源性、相对源于大鼠的血清素(5-HT6)受体蛋白质(JN0591)的29％同源性、相对源于狗的组胺H2受体蛋白质(A39008)的27％同源性、相对源于人的生长抑素受体(4型)蛋白质(JN0605)的27％同源性、相对源于人的多巴胺D1受体蛋白质(S11377)的24％同源性、相对源于大鼠的神经降压肽受体蛋白质(JH0164)的23％同源性、相对源于人的缩胆囊素B受体蛋白质(JC1352)的31％同源性和相对源于大鼠的胃泌素受体蛋白质(JQ1614)的30％同源性的新的受体蛋白质。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR或SWISS-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”。
实施例17用源于MIN6的cDNA经PCR扩增受体cDNA并测序以实施例4(1)中从小鼠胰腺β细胞株MIN6制备的cDNA为模板，在与实施例3(1)相同的条件下用Libert F.等“科学，244569-572，1989”中公开的在实施例4(2)中合成的DNA引物进行PCR扩增。所述的引物是一种由以下序列代表的合成引物5’-CTGTG(C或T)G(C或T)(G或C)AT(C或T)GCIIT(G或T)GA(C或T)(A或C)G(G或C)TAC-3’(SEQ ID NO60)，其中I是肌苷；和一种由以下序列代表的合成引物5’-A(G或T)G(A或T)AG(A或T)AGGGCAGCCAGCAGAI(G或C)(A或C)(C或T)GAA-3’(SEQ ID NO61)，其中I是肌苷。以与实施例3(2)相同的方式将所形成的PCR产物亚克隆进质粒载体PCRTMII中，获得质粒p5S38。将质粒p5S38转染进大肠杆菌JM109获得转化体大肠杆菌JM109/p5S38。
采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行确定核苷酸序列(测序)反应，用荧光自动测序仪解码DNA，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取。
图62示出了编码源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA人(SEQ ID NO33)和氨基酸序列(SEQ ID NO28)，所述氨基酸序列是由基于质粒p5S38的核苷酸序列的分离的DNA编码。下划线部分代表相应于合成引物的区。
基于测定的核苷酸序列〔图62〕进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由所获得的cDNA编码。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图62〕，进行疏水性作图证实4个疏水区的存在〔图64〕。此外，通过将所述氨基酸序列与实施例3(2)中获得的p19P2编码的和由实施例4(2)中获得的pG3-2编码的氨基酸序列比较，发现如图63所示的高级别的同源性。结果有力地说明，由p5S38编码的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质识别的配体与p19P2编码的源于人垂体的G蛋白偶联受体蛋白质所识别的相同，而p5S38编码的受体蛋白质所源于的动物物种却不同于p19P2编码的受体蛋白质所源于的。结果也有力地说明，由p5S38编码的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质识别的配体与pG3-2和pG1-10编码的源于小鼠胰腺β细胞株MIN6的G蛋白偶联受体蛋白质所识别的相同，它们相互是类似受体蛋白质(所谓的“亚型”)。
实施例18用包含在编码源于MIN6的受体蛋白质之p3H2-17中的cDNA片段进行northern杂交将小鼠细胞系MIN6、Neuro-2a Poly(A)+RNA(2.5微克)和小鼠脑、脾、胸腺和胰腺Poly(A)+RNA(2.5微克)用作Poly(A)+RNA。经用EcoRI切割实施例7(3)中获得的质粒p3H-17回收插入进所说质粒中的DNA片段作为具有约400bp的DNA片段，经用随机引物DNA标记试剂盒(Amasham公司)掺合〔32P〕dCTP(Dupont公司)标记所形成的DNA片段。将约400bp的标记DNA片段用作杂交探针。
以尼龙膜(Pall Biodyne，U.S.A.)为RNA印迹滤膜。按照《分子克隆》(Molecular Cloning)(Cold Spring Harbor Lab.出版社，1989)中描述的方法用印迹滤膜进行RNA迁移和其吸附(吸收)试验。
通过将以上提到的滤膜与探针在含有50％甲酰胺、5×SSPE(20×SSPE(pH7.4)是3M NaCl，0.2M NaH2PO4H2O，25mMEDTA)、5×Denhardt’s溶液(Nippon Gene，日本)、0.1％SDS和100微克/毫升鲑精DNA的缓冲液中42℃下温育过夜进行杂交。用0.1×SSC(20×SSC是3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)、0.1％SDS于50℃洗涤滤膜，经空气干燥后，于-80℃暴露于X-光胶片(XAR5、Kodak)下15天。结果示于图65中。
从图65可以看出，包含在p3H2-17中的cDNA片段受体基因的mRNA在小鼠细胞系MIN6、Neuro-2a和小鼠脑、胰腺、脾和胸腺中表达，特别是在小鼠脾和胸腺中强烈表达。在RNA印迹中可杂交的MIN6信号位置其它器官细胞的。
实施例19PCR克隆包含源于小鼠脾和胸腺Poly(A)+RNA的受体蛋白质全编码区的cDNA并测序(1)PCR克隆包含受体蛋白质全编码区的cDNA
为了获得由包含在p3H2-17中的cDNA片段编码的受体蛋白质的全长开放读框(编码区)，用5’RACE和3’RACE(其中使用源于小鼠脾和胸腺的Poly(A)+RNA)进行PCR扩增。
基于公开的3H2-17的核苷酸序列，合成了以下4种引物(合成引物的核苷酸序列)(1)5＇-TAGTGTGTGGAGTCGTGTGGCTGGCTG-3’ (SEQ ID NO20)(2)5＇-AGTCTTTGCTGCCACAGGCATCCAGCG-3″ (SEQ ID NO21)(3)5＇-CAAGCCAGT～AGGCTATGAAGGGCAGCAAG-3＇ (SEQ IDNO22)(4)5＇-ACAGGACCTGCTGGGCCATCCTGGCGACACA-3＇(SEQID NO23)按照ClonTech公司(ClonTech公司)的5’Ampli Finder RACE试剂盒的方案进行5’RACE。
在一个实施方案中，用上述引物(4)从源于小鼠脾和胸腺的Poly(A)+RNA各2微克制备cDNA，并与5’RACE试剂盒所附的锚连接。用4种聚合酶(Taq(Takara，日本)、Ex Taq(Takara，日本)、Vent(NewEngland Biolabs)和Pfu(Stratagene))在以下条件下对1/200量的由此制备的cDNA、锚和上述的引物(3)的混合物进行PCR96℃30秒钟、60℃60秒钟、72℃90秒钟，35个循环。将1/5量的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭(EtBr)染色。结果示于图66中。扩增DNA带出现在约1kbp位置，用SUPRECTM-01(Takara，日本)处理分离的约1kbpDNA带(其是用Ex Taq聚合酶由5’RACE从源于小鼠脾和胸腺的Poly(A)+RNA合成的)以回收cDNA。
用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)将分离的DNA亚克隆进PCRTMII载体，并将该载体转染进大肠杆菌JM109，获得3种转化体克隆N26、N64和N75。克隆N26携带源于胸腺的cDNA(其由5’RACE扩增)，克隆N75携带源于脾的cDNA(其由5’RACE扩增)(图68)。
按照3’RACE试剂盒(GIMCO BRL公司)的方案进行5’RACE。
在一个实施方案中，用3’RACE试剂盒所附的衔接引物从源于小鼠脾和胸腺的Poly(A)+RNA各1微克制备cDNA。用4种聚合酶(Taq(Takara，日本)、Ex Taq(Takara，日本)、Vent(NEB)和Pfu(Stratagene))在以下条件下对由此制备的衔接引物和1/10量的用上述引物(1)制备的cDNA的混合物进行PCR96℃30秒钟、55℃60秒钟、72℃120秒钟，30个循环。在与本文以上所述的5’RACE方法中的相同的条件下用上述聚合酶对1/50量的第一PCR产物、以上所说的引物(2)和衔接引物的混合物进行第二PCR，将1/5量的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。结果示于图67中。
分别用SUPRECTM-01(Takara，日本)处理出现在约1kbp位置的扩增DNA带(其是用Vent聚合酶由3’RACE从源于小鼠胸腺的Poly(A)+RNA合成的)和出现在约1kbp位置的扩增DNA带(其是用Pfu聚合酶由3’RACE从源于小鼠胸腺的Poly(A)+RNA合成的)以回收cDNA。
用T4多核苷酸激酶(Wako Pure Chenical公司，日本)处理分离到DNA以磷酸化其末端，用DNA连接试剂盒(Takara，日本)将磷酸化的DNA与pUC18 SmaI BAP(Pharmacial)连接，接着转化大肠杆菌JM109，获得3种转化体克隆C2、C13和C15。克隆C13和C15携带源于胸腺的cDNA(其由3’RACE扩增)，克隆C2携带源于胸腺的cDNA(其由3’RACE扩增)(图68)。
基于克隆N26、N64和N75的核苷酸序列(被认为携带包含在p3H2-17中的cDNA片段的开放读框(OFR)的N-末端区)和克隆C2、C13和C15的核苷酸序列(被认为携带包含在p3H2-17中的cDNA片段的开放读框(OFR)的C-末端区)，测定了由包含在p3H2-17中的cDNA编码的受体蛋白质的开放读框和邻近区的完整的核苷酸序列。为了更有针对性，采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)，用5’RACE和3’RACE中使用的引物和供测序的合成引物进行测序，用荧光自动测序仪解码核苷酸序列，获得的核苷酸序列数据用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析。
在PCR时很可能偶然发生的PCR错误已由这样一种方法校正，即，当由PCR单独产生的两个克隆间的核苷酸相互相同时(例如，在克隆N75和N64之间的那些核苷酸是相同的)，相同的碱基被认为是正确的。确定的核苷酸序列示于图69中。基于确定的核苷酸序列推导氨基酸序列(图69)。基于推导的氨基酸序列进行疏水性作图(图70)。结果说明，如从包含在p3H2-17中的cDNA片段所说明的，它是七转膜G蛋白质偶联受体。
在氨基酸水平上的同源性检索表明其同源于小鼠P2UPurinoceptor和鸡P2YPurinoceptor。
此外，在开放读框(ORF)中无错误的克隆选来用于构建携带由p3H2-17编码的受体蛋白质全长ORF。在一个实施方案中，用限制酶DraIII和EcoRI消化克隆N75携带的cDNA片段，以获得p3H2-17携带的受体蛋白质N-末端区的cDNA片段。用限制酶DraIII和EcoRI消化由C13编码的C-末端cDNA片段，以从C-末端DraIII位点缺失5’侧区，用限制酶DraIII和EcoRI消化C13获得长的片段用DNA连接试剂盒(Takara，日本)将源于N75的N-末端cDNADraIII-EcoRI片段与长的源于C13的DraIII-EcoRI片段连接，转染进大肠杆菌JM109，获得转化体大肠杆菌JM109/pMAH2-17。
(2)pMAH2-17编码的受体的电生理学测定在非洲蟾蜍属卵母细胞中进行pMAH2-17编码的受体的电生理学测定。用其T7启动子下游的引导序列将由pMAH2-17编码的受体的ORF插入到pBluescriptTMII SK(+)(Stratagene)的XhoI-XhoI位点。用mCAPTMmRNA加帽试剂盒(Stratagene)处理作为模板的所形成的质粒，产生这一受体基因的cRNA。
将所说cRNA注射进非洲蟾蜍属卵母细胞(50ng cRNA/50nl/卵母细胞)，所说卵母细胞以事先按Nathan Daxcal等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.90，pp.6596-6600(1993)中公开的方法制备。于20℃培养注射了cRNA的卵母细胞2-3天，并进行电生理学测定。用可用微电极的高输入阻抗扩增仪(Mez-8300，Nippon Koden公司，日本)和电压强加扩增仪(CEz-/200 Nippon Koden公司，日本)进行测定。将卵母细胞的起始膜势能设定为-60mV，用记录仪(Thermal Array记录仪，Nippon Koden公司，日本)记录由添加配体激发的应答(膜的电流改变)(Nathan Daxcal等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.90，pp.6596-6600(1993))。
经10μM ATP刺激，在注射了pMAH2-17cRNA的卵母细胞中观察到由磷脂酶C-偶联受体活化引起的典型的向内的电流。相反，在注射了水而不是pMAH2-17cDNA的卵母细胞中，经ATP刺激后观察不到这种电流。
总之，由pMAH2-17 cRNA编码的受体被认为属于ATP受体中的一个亚类，P2Purinoceptor。
实施例20克隆源于兔胃幽门部分平滑肌的的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备Poly(A)+RNA组份和合成cDNA按硫氰酸胍方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979))从兔胃幽门部分平滑肌制备总RNA(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127.No.1，p.126-132)。然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组份。接着添加5微克Poly(A)+RNA组份，随机DNA六聚体(BRL公司)为引物，将所形成的混合物与MMLV逆转录酶(BRL公司)在MMLV逆转录酶试剂盒所附缓冲液中反应，合成互补DNA。反应产物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提，在乙醇中沉淀，然后溶解到30微升TE缓冲液中。
(2)用源于MIN6的cDNAPCR扩增受体cDNA和测序以5微升以上步骤(1)从兔胃幽门部分平滑肌制备的cDNA为模板，用具有由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物和在实施例15中合成的具有由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的组成为合成DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)各100pM、0.25mM dNTPs、1μl TaqDNA聚合酶和10μl 10×酶试剂盒所附的缓冲液，反应溶液总共为100微升。用热循环器(Perkin-Elmer公司)进行聚合酶链反应，扩增循环包括96℃30秒钟，45℃1分钟和60℃3分钟，总的这一循环重复25次。借助1.2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实扩增产物。
(3)将以上步骤(2)中获得的PCR产物亚克隆进质粒载体和经解码插入cDNA区的核苷酸序列选择新的受体候选克隆。用1.0％低熔点温度琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶切下带部分，并电洗脱，经苯酚抽提和乙醇沉淀回收DNA。按照TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)所附的方案，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。将重组载体引入到大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo公司，日本)，产生转化体。然后，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-胶的LB琼脂培养基中选择具有cDNA插入片段的转化克隆。用无菌牙签仅挑取显示出白色的克隆，获得100个转化体克隆。
将单个克隆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养过夜，用自动质粒抽提机PI-100(Kurabo公司，日本)处理制备质粒DNA片段的大小。将一份由此制备的DNA用EcoRI切割，证实插入的DNA片段。将一份剩下的DNA用RNA酶处理，用苯酚/氯仿抽提，在乙醇中沉淀，以使其凝结。采用DyeDeoxy终止剂循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序。用荧光自动测序仪解码DNA。
基于确定的核苷酸序列进行同源性检索。结果说明新的G蛋白偶联受体蛋白质由插入到转化体大肠杆菌JM109/pMN128包含的质粒中的cDNA片段编码。图71和图72示出了cDNA片段的核苷酸序列。为进一步证实，采用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)，将核苷酸序列转化成氨基酸序列〔图71和图72〕，基于疏水性作图〔图73〕在氨基酸水平上进行同源性检索，发现一种具有相对源于仓鼠的β2肾上腺素受体蛋白质(A03159)的27％同源性、相对源于大鼠的缓激肽受体(B2)蛋白质(A41283)的20％同源性、相对源于人的多巴胺D1受体蛋白质(S11377)的24％同源性和相对源于人的蓝敏视蛋白受体蛋白质(A03156)的23％同源性的新的受体蛋白质。以上括号中的缩写是在NBRF-PIR或SWISS-PROT登记时指定的参照号，通常都称为“入藏号”。
实施例21从源于人的cDNA文库克隆受体蛋白质全编码区由Clontech公司构建DNA文库，其中使用的λgtll噬菌体载体(CLONTECH Laboratories，Inc.；CLH L1139b)用作源于人胰腺的cDNA文库。将人胰腺cDNA文库(1×105pfu(噬斑形成单位))热变性。采用源于人胰腺的cDNA文库，用在实施例19中合成的具有由SEQ IDNO20代表的核苷酸序列的DNA引物和具有由SEQ ID NO23代表的核苷酸序列的DNA引物进行PCR扩增。
(合成引物的核苷酸序列)5＇-TAGTGTGTGGAGTCGTGTGGCTGGCTG-3＇ (SEQ ID NO20)5＇-ACAGGACCTGCTGGGCCATCCTGGCGACACA-3＇(SEQ IDNO23)用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)亚克隆分离的DNA，并进行测序。图76示出了获得的cDNA片段的核苷酸序列，ph3H2-17。结果说明ph3H2-17高度同源于小鼠purinoceptor cDNA片段p3H2-17。在有力地说明源于人的cDNA片段是人purinoceptor的部分核苷酸序列。
基于测序的ph3H2-17的核苷酸序列，合成了下列引物(合成引物的核苷酸序列)5＇-ACAGCCATCTTCGCTGCCACAGGCAT-3″ (SEQ ID NO58)5＇-AGACAGTAGCAGGCCAGCAGGGCAGCAAA-3＇(SEQ IDNO59)将以上合成的2种引物各自用于与λgtll引物(Takara，日本；产品编号3864)组合，以获得全长人prinoceptor cDNA。由此，利用热变性，源于人胰腺的λgtllcDNA文库(CLONTECH；CLHL 1008b)，用Ex Taq聚合酶(Takara，日本)分别在下列引物组合下进行PCR扩增具有由SEQ ID NO20代表的核苷酸序列的DNA引物与λgt ll正向引物；具有由SEQ ID NO20代表的核苷酸序列的DNA引物与λgt ll反向引物；具有由SEQ ID NO23代表的核苷酸序列的DNA引物与λgt ll正向引物；具有由SEQ ID NO23代表的核苷酸序列的DNA引物与λgt ll反向引物。
除了以具有由SEQ ID NO58代表的核苷酸序列的DNA引物代替具有由SEQ ID NO20代表的核苷酸序列的DNA引物，以具有由SEQ ID NO59代表的核苷酸序列的DNA引物代替具有由SEQ ID NO23代表的核苷酸序列的DNA引物外，用与第一PCR相同的方式用1/50量的第一PCR产物进行第二PCR扩增(30个循环；95℃/60秒钟，65℃/60秒钟，72℃/60秒钟)。用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)对扩增产物DNA的3个克隆的各5’和3’侧进行测序(图77)。
基于从图77所示的确定的人purinoceptor cDNA推导的氨基酸序列(图77)，进行疏水性作图。结果说明源于人的受体是新的七转膜区G蛋白质偶联受体，类似于小鼠型。它也说明人受体的推导的氨基酸序列具有相对于小鼠purinoceptor氨基酸序列的87％的同源性，且其氨基酸残基是非常保守的(图79)。选择PCR扩增中常出现的无PCR错误的克隆，从其获得包含重叠区的限制酶区。用由此获得的限制酶区构建具有人purinoceptorcDNA全长开放读框的质粒phAH2-17。该质粒由转化体电极JM109/phAH2-17携带。
本发明的DNA引物允许编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA有效地扩增。这使得有效地筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA并完成克隆成为可能。
本发明的G蛋白偶联受体蛋白质和其编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA在以下方面是非常有用的1.判定配体，2.获得抗体和抗血清，3.构建表达重组受体蛋白质的系统，4.经采用以上表达系统研究和开发受体结合试验系统和筛选药物候选化合物，5.基于与具有与其类似的或相似的结构的配体和受体设计药物。
6.制备基因诊断中的探针和/或PCR引物，和7.基因操作治疗。
特别是，所述G蛋白质偶联受体的结构和性质的发现将导致开发出在这些系统上起作用的独一无二的药物。
本发明的实施要利用常规的分子生物学、微生物学、重组DNA、药理学、免疫学、生物科学和医学技术，这些都在本领域技术人员的知识范围内。本文提及的所有专利、专利申请书和出版物(在前的和在后的)一并被本文参考。
序列表(1)一般信息(I)申请人(A)名称Takeda化学工业有限公司(B)街道1-1，Doshomachi 4-chome，Chuo-ku(C)城市大阪-shi(D)州大阪(E)国家日本(F)邮区代码(ZIP)541(ii)发明名称G蛋白偶联受体蛋白质及其产生方法和用途(iii)序列数61(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release 1.0#，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(I)序列特征(A)长度25(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是A，G，C，或者T(xi)序列描述SEQ ID NO1CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG25(2)SEQ ID NO2信息(I)序列特征(A)长度27(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是A，G，C，或者T(xi)序列描述SEQ ID NO2GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA27(2)SEQ ID NO3信息(I)序列特征(A)长度27(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO3CTCGCSGCYM TNRGYATGGA YCGNTAT27(2)SEQ ID NO4信息(I)序列特征(A)长度30(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO4CATGTRGWAG GGAANCCAGS AMANRARRAA30(2)SEQ ID NO5信息(I)序列特征(A)长度27(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO5CTGACYGYTC TNRSNRYTGA CMGVTAC27(2)SEQ ID NO6信息(I)序列特征(A)长度27(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID 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Val85 90 95Leu Asn His Leu His Lys Lys Leu Lys Asn Met Ser Lys Lys Ser Glu100 105 110Ala Ser Lys Lys Lys Thr Ala Gln Thr Val Leu Val Val Val Val Val115 120 125(2)SEQ ID NO43信息(I)序列特征(A)长度384(B)类型核酸(C)单链双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(C)识别方法S(xi)序列描述SEQ ID NO43GCCGCGATGT CTGTGGATCG CTACGTGGCC ATTGTGCACT CGCGGCGCTC CTCCTCCCTC60AGGGTGTCCC GCAACGCACT GCTGGGCGTG GGCTTCATCT GGGCGCTGTC CATCGCCATG 120GCCTCGCCGG TGGCCTACCA CCAGCGTCTT TTCCATCGGG ACAGCAACCA GACCTTCTGC 180TGGGAGCAGT GGCCCAACAA GCTCCACAAG AAGGCTTACG TGGTGTGCAC TTTCGTCTTT 240GGGTACCTTC TGCCCTTACT GCTCATCTGC TTTTGCTATG CCAAGGTCCT TAATCATCTG 300CATAAAAAGC TGAAAAACAT GTCAAAAAAG TCTGAAGCAT CCAAGAAAAA GACTGCACAG 360ACCGTCCTGG TGGTCGTTGT AGTA 384(2)SEQ ID NO44信息(I)序列特征(A)长度71(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO44Val Leu Trp Phe Phe Gly Phe Ser Ile Lys Arg Thr Pro Phe Ser Val1 5 10 15Tyr Phe Leu His Leu Ala Ser Ala Asp Gly Ala Tyr Leu Phe Ser Lys20 25 30Ala Val Phe Ser Leu Leu Asn Ala Gly Gly Phe Leu Gly Thr Phe Ala35 40 45His Tyr Val Arg Ser Val Ala Arg Val Leu Gly Leu Cys Ala Phe Val50 55 60Ala Gly Val Ser Leu Leu Pro65 70(2)SEQ ID NO45信息(I)序列特征(A)长度215(B)类型核酸(C)单链双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(C)识别方法S(xi)序列描述SEQ ID NO45GTGCTCTGGT TCTTCGGCTT CTCCATCAAG AGGACCCCCT TCTCCGTCTA CTTCCTGCAC60CTGGCCAGCG CCGACGGCGC CTACCTCTTC AGCAAGGCCG TGTTCTCCCT GCTGAACGCC 120GGCGGCTTCC TGGGCACCTT CGCCCACTAT GTGCGCAGCG TGGCCCGGGT GCTGGGGCTC 180TGCGCCTTCG TGGCGGGCGT GAGCCTCCTG CCGGC 215(2)SEQ ID NO46信息(I)序列特征(A)长度348(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO46Met Glu Leu Ala Met Val Asn Leu Ser Glu Gly Asn Gly Ser Asp Pro1 5 10 15Glu Pro Pro Ala Pro Glu Ser Arg Pro Leu Phe Gly Ile Gly Val Glu20 25 30Asn Phe Ile Thr Leu Val Val Phe Gly Leu Ile Phe Ala Met Gly Val35 40 45Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Thr Val Leu Ala Arg Ser Lys Pro Gly50 55 60Lys Pro Arg Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ser Ile Ala65 70 75 80Asp Leu Ala Tyr Leu Leu Phe Cys Ile Pro Phe Gln Ala Thr Val Tyr85 90 95Ala Leu Pro Thr Trp Val Leu Gly Ala Phe Ile Cys Lys Phe 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ID NO54信息(I)序列特征(A)长度263(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO54Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu Val1 5 10 15Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys Val Ile20 25 30Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Val Val Leu Thr Leu Ser35 40 45Ser Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His Pro Leu Leu Phe50 55 60Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile Leu Gly Ile Trp Ala65 70 75 80Val Ser Leu Ala Val Met Val Pro Gln Ala Ala Val Met Glu Cys Ser85 90 95Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg Thr Arg Leu Leu Ser Val Cys100 105 110Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys115 120 125Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala130 135 140Tyr Phe Gln Ile Phe Arg Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr145 150 155 160Thr Ser Ala Leu Val Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Asp165 170 175Asp Gln Gly Gln Gly Leu Ser Ser Glu Pro Gln Pro Arg Ala Arg Ala180 185 190Phe Leu Ala Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys 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GCGTGCTGGA CCCCATCCTC 900TTCTACTTCA CCCAGAAGAA GTTCCGCCGG CGACCACATG AGCTCCTACA GAAACTCACA 960GCCAAATGGC AGAGGCAGGG TCGC 984(2)SEQ ID NO58信息(I)序列特征(A)长度26(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO58ACAGCCATCT TCGCTGCCAC AGGCAT 26(2)SEQ ID NO59信息(I)序列特征(A)长度29(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO59AGACAGTAGC AGGCCAGCAG GGCAGCAAA 29(2)SEQ ID NO60信息(I)序列特征(A)长度27(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO60CTGTGYGYSA TYGCNNTKGA YMGSTAC 27(2)SEQ ID NO61信息(I)序列特征(A)长度29(B)类型核酸(C)单链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸，合成DNA(iii)特性N是肌苷(xi)序列描述SEQ ID NO61AKGWAGWAGG GCAGCCAGCA GANSRYGAA 29
权利要求
1.一种DNA，它包含由选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO19的SEQ IDNO所代表的核苷酸序列。
2.一种用聚合酶链反应扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括(i).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii).在下列物质的混合物存在下进行聚合酶链反应(1)一种编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA，所说DNA可以用作模板；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
3.一种从DNA文库筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的方法，该方法包括(i).在选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之模板DNA的条件下，在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，并选择所说的DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO5代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO6代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO7代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO10代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO14代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO16代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO18代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO4代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO8代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO9代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO11代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO15代表的核苷酸序列的DNA引物、包含由SEQ ID NO17代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO19代表的核苷酸序列的DNA引物；或(ii).在选择性扩增包含在所说DNA文库中的编码所说G蛋白偶联受体蛋白质蛋之DNA的条件下，在下列物质的混合物存在时进行聚合酶链反应，并选择所说的DNA(1)所说的DNA文库；(2)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO1代表的核苷酸序列的DNA引物和包含由SEQ ID NO12代表的核苷酸序列的DNA引物；和(3)至少一种DNA引物，该DNA引物选自包含由SEQ ID NO13代表的核苷酸序列的DNA引物。
4.一种编码G蛋白偶联受体蛋白质或其片段之DNA，该DNA是由权利要求2-3的方法获得的。
5.一种由按照权利要求4的DNA编码的G蛋白偶联受体蛋白质，其肽区段或片段或者其盐。
6.一种G蛋白偶联受体蛋白质、其肽区段(或片段)、其修饰的肽衍生物或其盐，所说的蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO24代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO25代表的氨基酸序列、由SEQ IDNO26代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO27代表的氨基酸序列、由SEQID NO28代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO34代表的氨基酸序列、由SEQID NO35代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列、由SEQID NO39代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列和由SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39或SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的实质上的等价物。
7.按照权利要求6的G蛋白偶联受体蛋白质，该蛋白质包含选自下组的氨基酸序列由SEQ ID NO38代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO39代表的氨基酸序列、由SEQ ID NO56代表的氨基酸序列和由SEQ IDNO38、SEQ ID NO39或SEQ ID NO56代表的氨基酸序列的实质上的等价物。
8.按照权利要求6或7的G蛋白偶联受体蛋白质，其中所说的受体是purinoceptor。
9.按照权利要求6到8任一之G蛋白偶联受体蛋白质，其中所说受体的激动剂除了在治疗性或预防性治疗高血压、糖尿病或胆囊纤维症中有用外，作为免疫调节剂或抗肿瘤剂也是有用的，所说受体的拮抗剂作为低血压剂、止痛剂或者治疗性或预防性治疗尿失禁药剂是有用的。
10.一种DNA，该DNA包含编码权利要求6之G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列。
11.按照权利要求10的DNA，该DNA包含编码按照权利要求7之G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列。
12.按照权利要求11的DNA，该DNA包含由SEQ ID NO40、SEQ IDNO41或SEQ ID NO57代表的核苷酸序列。
13.一种包含载体或表达系统的转化体，所说的载体包含按照权利要求4或10的DNA，所说的表达系统包含源于按照权利要求4或10之G蛋白偶联受体蛋白质DNA的DNA的开放读框(ORF)，其中所说的ORF是可操作连接到与宿主细胞相容的控制序列上的。
14.一种判定按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，该方法包括将(i)至少一种选自按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质、其肽区段或盐和它们的混合物的组份与(ii)至少一种待试化合物接触，并判定所说的待试化合物是否结合到(i)的组份上。
15.一种筛选能够抑制按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质与配体结合的化合物的方法，该方法包括将以下两者进行比较(i)至少这样一例，其中所说的配体与至少一种选自按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质、其肽区段或盐和它们的混合物的组份接触；(ii)至少这样一例，其中所说的配体和待试化合物一起与至少一种选自按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质、其肽区段或盐和它们的混合物的组份接触。
16.一种经按照权利要求15的方法判定的化合物或其盐。
17.按照权利要求16的化合物，该化合物是按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质的激动剂或拮抗剂。
18.一种按照权利要求5-8任一之G蛋白偶联受体蛋白质的配体，该配体是经按照权利要求14的方法判定的。
全文摘要
本发明提供了在筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA片段中有效的DNA引物，设计并合成了与某些核苷酸序列互补的引物，所述核苷酸序列同于(同源于)编码相应于或接近各种已知G蛋白偶联受体蛋白质第一跨膜区或第六跨膜区氨基酸序列的核苷酸序列。本发明也提供了用所述DNA引物扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA片段的方法和编码新的靶标G蛋白偶联受体蛋白质之DNA片段，有效地进行了DNA文库的筛选。本发明还提供了源于人垂体或扁桃体和源于小鼠胰腺等的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或其部分肽；编码以上G蛋白偶联受体蛋白质之DNA；产生上述G蛋白偶联受体蛋白质的方法；判定上述G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法；筛选抑制所述配体与G蛋白偶联受体蛋白质之间结合的化合物的方法或其筛选试剂盒；用上述筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物和其盐；含有上述化合物和其盐的药物组合物以及抗上述G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的抗体。
文档编号C07K14/705GK1155299SQ95194530
公开日1997年7月23日 申请日期1995年8月10日 优先权日1994年8月11日
发明者日沼州司, 细谷昌树, 藤井亮, 大泷彻也, 福住昌司, 大仪和宏 申请人:武田药品工业株式会社