专利名称：与主要组织相容性复合体i类重链表达负调节有关的人巨细胞病毒基因的鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及感染后不会负调节细胞MHC I类重链表达的重组突变体人巨细胞病毒(HCMV)以及鉴别两种足以造成这种负调节的人巨细胞病毒基因产物。
背景技术：
人巨细胞病毒(HCMV)是一种β疱疹病毒，它会在免疫减弱和免疫抑制的成人、以及在子宫中或在围产期被感染的婴儿中引起严重的临床疾病(Alford和Britt，1990)。在人巨细胞病毒(HCMV)感染的细胞中，细胞主要组织相容性复合体(MHC)I类重链的表达被负调节。230-kb的HCMV双链DNA基因组已测序(Chee等，1990)，它至少具有200个可读框架(ORFs)。这200个基因中大多数的功能还不知道。出于本申请的目的，可读框架定义为某基因的一部分，它编码一串氨基酸因而可能编码某种蛋白质。某些HCMV蛋白因其与其它病毒(尤其是单纯疱疹病毒)或细胞蛋白的同源性，其功能是已知或可预测的。但是，大多数HCMV ORF所编码蛋白的功能是未知的。
为了研究HCMV基因的功能，可构建HCMV缺失突变体以评价其体外生长特性(Jones等，1991；Jones和Muzithras，1992)。出于本申请的目的，缺失突变体定义为缺失了部分野生型病毒基因组的人巨细胞病毒突变体。该方法涉及用一个原核细胞报道基因(通常为β-葡糖苷酸酶，但也可使用鸟苷磷酸核糖转移酶)定点置换诱变选定的HCMV基因。以此方式，重组病毒只有在被置换的病毒基因是非必需基因时才能被分离。
有研究者证明，HCMV感染会导致细胞MHC I类重链的负调节(Browne等，1990；Beersma等，1993；Yamashita等，1993)。出于本申请的目的，负调节定义为MHC I类重链的合成、稳定性或表面表达的下降。对其它DNA病毒也报道过此类现象，例如腺病毒、鼠巨细胞病毒和单纯疱疹病毒(Anderson等，1985；Burget和Kvist，1985；del Val等，1989；Campbell等，1992；Campbell和Slater，1994；York等，1994)。在腺病毒和单纯疱疹病毒系统中，体外复制非必需的病毒基因的产物足以引起MHC I类重链的负调节(Anderson等，1985；Burget和Kvist，1985)。还未鉴定出与鼠巨细胞病毒负调节有关的基因。
发明概述本发明提供了一种重组突变体人巨细胞病毒，它不会在感染后负调节细胞MHC I类重链的表达。在重组巨细胞(HCMV)突变体中含有可读框架US2的基因组区域被缺失。
本发明还提供了一种在感染了巨细胞病毒的细胞中调控主要组织相容性复合体(HMC)I类表达负调节的方法，该方法使用重组突变体人巨细胞病毒。
本发明还提供了使用重组突变体人巨细胞病毒的疫苗，以及采用重组的突变体人巨细胞病毒使个体对巨细胞病毒免疫的方法。缺失了可读框架US2基因区域的活减毒HCMV疫苗能够引起优于含此基因区域的疫苗的免疫应答，因为前者不引起I类的负调节。所以，缺失了此区域的病毒是有利的免疫原。
本发明还提供了通过施用免疫原性量的重组突变体人巨细胞病毒来预防或降低个体对急性巨细胞病毒易感性的方法。
本发明还提供了一种基因治疗载体，其中，涉及MHC I类重链负调节的HCMV基因的US2可读框架可整合入腺病毒载体或类似的以病毒为基础的基因治疗载体中，以尽可能减弱免疫应答。这将允许使用重组的腺病毒或类似的以病毒为基础的用于基因治疗的基因治疗载体。
参照以下附图将能够更充分地理解本发明。
图1显示重组病毒基因组的结构。图1A，第一行是HCMV野生型基因组的总体结构图。单一区序列用线表示，重复区序列用阴影框表示。L和S部分内的相关Hind III片段用指定字母表示(Oram等，1982)。第二行是野生型的S部分内Hind III片段Q、X和V区域的放大。重要的可读框架及其取向用空心框表示(Chee等，1990)。IRs重复序列的位置用阴影矩形表示。给出了Hind III(H)和Xhol(X)限制性核酸内切酶位置。图1B-I显示所示HCMV突变体的基因组结构。各图中，第一行都是亲代AD169野生型基因组的结构，第二行代表用于制造重组病毒的线性化质粒的相关序列。斜线表示病毒侧翼序列的边界，这些序列可能与生成所需突变的同源重组有关。缺失区用第一行下的阴影框表示。图1J显示RV799的衍生化与结构。第一、二行与图1B-I的相同，第三行表示从RV134亲代(第二行)制造RV799所用线性化质粒的相关序列。限制性内切酶位点是ApaI(A)、AatH(Aa)、BsmI(Bs)、HindIII(H)、HpaI(Hp)、NarI(Na)、NcoI(Nc)、NheI(Nh)、PstI(P)、SalI(S)、SauI(Sa)、SphI(Sp)、SstI(T1)、SstII(T2)、XbaI(Xb)和XhoI(X)。
图2显示重组病毒基因组的结构。图2A，第一行是HCMV野生型基因组的总体结构图。单一区序列用线表示，重复区序列用阴影框表示。L和S部分内的相关Hind III片段用指定字母表示(Oram等，1982)。第二行是野生型的S部分内Hind III片段Q、X和V区域的放大。重要的可读框架及其取向用空心框表示(Chee等，1990)。IRs重复序列的位置用阴影矩形表示。给出了Hind III(H)和Xhol(X)限制性核酸内切酶位点位置。图2B和2C显示了所示HCMV突变的基因组结构。各图中，第一行都是亲代AD169野生型基因组的结构，第二行代表用于制造重组病毒的线性化质粒的相关序列。斜线表示病毒侧翼序列的边界，这些序列可能与生成所需突变的同源重组有关。缺失区用第一行下的阴影框表示。限制性位点是EcoRV(RV)、HindIII(H)、KpnI(K)、PstI(P)、SacI(Sa)、SmaI(Sm)、XbaI(Xb)和XhoI(X)。括号中的位点在重组病毒中不再存在。
图3显示的是利用免疫荧光流式细胞计数法进行的在HCMV感染细胞中细胞表面MHC I类的检测。用所示病毒以感染倍数(5PFU/细胞)感染人包皮成纤维(HFF)细胞72小时。此时，将细胞与1％的仲甲醛混合，并先用HLA-A、B、C(W6/32)特异的第一抗体或对照的鼠IgG(同种型匹配的)、然后用第二抗体FITC结合的山羊抗鼠IgG染色。使用Immuno Program，CoulterMDADS 1，根据前向角光散射比log积分的90°光散射计算阳性细胞(总共5×103个)百分比和平均荧光强度(MFI)。
图4显示在HCMV野生型AD169株感染的细胞中MHC I类重链的表达。图4A是Western印迹分析。HFF细胞不经感染(U)或用5PFU/细胞的感染倍数感染。在感染后24、48和72小时(24、48和72hp.i.)，收获总细胞蛋白，通过15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳印迹到硝酸纤维素膜上，使用ECL化学发光检测试剂盒(Amersham)，用TP25.99鼠单克隆抗体(对MHC I类重链上一非构象型表位特异)检测。图4B和4C是免疫沉淀测试。在不加或加有(+PFA)膦酰基甲酸条件下，对HFF细胞不进行感染或如上进行感染，并在感染后晚期(69-73小时)放射性标记4小时(图4B)或在感染后指定的时刻标记2小时(图4C)。放射性标记后立刻收获蛋白质，然后用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀I类重链。
图5显示被HCMV突变体感染的细胞内重链表达的分析。以所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后晚期(69-73小时)放射性标记4小时。放射性标记后立刻收获蛋白质。图5A是TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链的放射显影图。图5B是证实近乎相当的放射性标记效率的全部放射性标记蛋白的放射显影图。图5C是证实通过病毒复制循环后进展情况相当的放射显影图。UL80蛋白是用抗装配蛋白兔多克隆抗血清免疫沉淀的。
图6显示被RV789、RV799、RV134或AD169野生型感染细胞的I类重链免疫沉淀。HFF细胞用所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后晚期(71-73小时)放射性标记2小时。放射性标记后立刻收获蛋白质。图6A是用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链放射显影图。如图5B和C所述，证实了相当的放射性标记效率(图6B)和通过病毒复制的进展情况(图6C)。
图7是显示RV798感染细胞中合成的I类重链的内切糖苷酶H敏感性的放射显影图。用RV798感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后早期(6-8小时)或感染后晚期(80-82小时)放射性标记2小时。为了用于比较，未感染的细胞放射性标记2小时。蛋白质在放射性标记后立刻收获(脉冲)或在完全未标记的培养基中追踪2小时后收获(追踪)。用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀I类重链。免疫沉淀的蛋白质加(+)或不加(-)1.5mU的内切糖苷酶H孵育6小时，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及荧光显影。
图8显示被RV798、RV7181、RV7177或AD169野生型感染细胞的I类重链免疫沉淀。用所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后晚期(65-67小时)放射性标记2小时。在放射性标记后立刻收获蛋白质。图8A是用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链的放射显影图。如图5B-C所述，证实了相当的放射性标记效率(图8B)和通过病毒复制的进展情况(图8C)。
图9提供了用野生型和突变型HCMV感染的HFF细胞的MHC I类重链表达数据的归纳。第一行是HCMV野生型基因组的总体结构，第二行是野生型S部分的Hind III-Q和-X区域的放大。ORF用无阴影矩形指示；与US4和US5重叠的未标明ORF是US4.5。各种HCMV突变体中的缺失用阴影矩形表示。RV670缺失IRS1-US9和US11；RV35缺失US6-US11；RV67缺失US10-US11；RV80缺失US8-US9；RV725缺失US7；RV69缺失US6；RV47缺失US2-US3；RV5122缺失US1；RV46缺失IRS1；RV798缺失US2-US11；RV7181缺失IRS1-US9；RV7177缺失IRS1-US6；RV7186缺失IRS1-US11。通过免疫沉淀实验(使用重链构象非依赖性单克隆抗体，TP25.99)得出MHC I类重链的负调节结果，实验中，HCMV感染的HFF细胞在感染后晚期放射性标记。最后一行显示含有足以进行MHC I类重链负调节的基因的两个亚区的位置。亚区A含有ORF US2至US5(碱基193119-195607)，亚区B含有ORF US10至US11(碱基199083-200360)。
图10A-D是利用了免疫荧光的、显示被感染细胞内US11基因产物(gpUS11)位置的照片。用AD169野生型或RV699(US11基因缺失)感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞。8小时后，将未感染和感染的细胞与4％的仲甲醛混合。然后用0.2％ Triton X-100透化某些细胞。第一抗体是针对US11融合蛋白产生的兔多克隆抗血清(Jones和Muzithras，1991)。用Zeiss显微镜目测荧光度。
图11是来自用野生型和突变型HCMV感染的细胞的MHC I类重链的免疫沉淀图。HFF或U373-MG细胞是未感染的(U)或者用所示病毒(感染倍数分别为5或3PFU/细胞)，然后在感染后指定的时间放射性标记4小时。在放射性标记后立即抽提感染细胞的蛋白质，然后用抗人MHC I类重链单克隆抗体TP25.99进行免疫沉淀。HFF细胞在感染后早期(图11A)或晚期(图11B)被放射性标记。U373-MG细胞在感染后晚期被标记(图11C)。AD169是HCMV野生型株，从该株衍生得到缺失突变体病毒。RV699仅缺失US11基因；RV35缺失US6-US11基因；RV8146缺失US4-US11；RV8173缺失US3-US11；而RV798缺失US2-US11。
图12提供了用野生型和突变型HCMV感染的HFF细胞的MHC I类重链表达数据的归纳。第一行是野生型HCMV野生型基因组的总体结构，第二行是野生型S部分的Hind III-Q和-X区域的放大。ORF用无阴影矩形指示；与US4和US5重叠的未标明ORF是US4.5。含有足以负调节MHC I类重链的基因的基因座位的位置用黑矩形表示。一个基因座位含有ORF US2-US5(碱基193119-195607)，而另一个基因座位是US11(碱基199716-200360)。各种HCMV突变体中的缺失用阴影矩形表示。AD169是野生型株，它没有缺失；RV798缺失US2-US11；RV699仅缺失US11；而RV35缺失US6-US11。RV8146缺失US4-US11，而RV8173缺失US3-US11。通过免疫沉淀实验得出MHC I类重链的负调节结果，其中使用抗人MHC I类重链构象非依赖性单克隆抗体TP25.99和来自HCMV野生型或突变型感染细胞的代谢标记的蛋白质。
图13显示了US2的RNA和蛋白质表达。在图13A-D中所述的所有试验中，感染倍数是5。对于图13A和13B，从未感染的(U)或感染的HFF，在感染后4小时收获总细胞质RNA，在1.2％琼脂糖上电泳，转至尼龙膜上，再与US-2特异性单链核糖体探针(riboprobe)杂交(即Northern印迹分析)。如图所示，细胞被用HCMV野生型(AD169)或US11-US2缺失突变体RV798感染。在感染后72小时的来自RV798感染细胞的RNA样品(图13B，泳道7)被包括在内作为阴性对照，从而证实了在AD169的感染后72小时的样品(图13B，泳道6)中检测到的少量0.9kb US2 mRNA。在图13C中，在感染后所示的、来自未感染(U)或HCMV野生型(AD169)感染的HFF细胞的总细胞蛋白在15％ SDS-PAGE上电泳，转至硝酸纤维素膜，然后用抗US2的多克隆抗血清探测(即Western印迹分析)。标出了～24千道尔顿的US2编码的蛋白质(pUS2)的位置。在图13D中，与图13C类似地进行野生型和突变型HCMV感染细胞的Western印迹分析，不同点在于所有感染细胞的蛋白质在感染后11小时收获。
图14显示在HCMV突变体感染的细胞中感染后早期的重链表达的分析。用所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后6-10小时放射性标记4小时。放射性标记后立即收获蛋白质。图14A是用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链的放射显影图。图14B是一张放射显影图，其中为了证实近乎相当的感染情况，用鼠单克隆抗体9221免疫沉淀72-kDa IE1极早期蛋白。图14C是用鼠单克隆抗体Ber-T9进行的细胞运铁蛋白受体免疫沉淀的放射显影图，为的是证实该糖蛋白近乎相当的表达。图14D是为了证实近乎相当的放射性标记效率的全部放射性标记蛋白的放射显影图。
图15A-B是表达HCMV US11基因的细胞系Western印迹。用US11表达质粒稳定转化的未感染的人U373-MG细胞，分别用TP25.99单克隆抗体和US11多克隆抗血清通过Western印迹分析细胞的MHC I类重链表达(图15A)和US11表达(图15B)。
图16显示了稳定转染的细胞的蛋白质的Western印迹分析。与图13C相似，将来自U373-MG亲代或稳定转染(55代)细胞的总蛋白质抽提物进行电泳和印迹。水平地切下印迹，使含MHC I类重链(heavy chain，HC)的印迹蛋白可用重链单克隆抗体TP25.99进行分析(图16A)，而含有US2编码的蛋白(pUS2)的印迹部分用US2多克隆抗体分析(图16B)。55-212和55-215是阴性细胞系。细胞系55-302，尽管用US2表达质粒进行转染，但是不能表达数量可检测的pUS2。细胞系55-303、55-304和55-310表达可轻易测量的pUS2。累积数据表明pUS2和MHC I类重链水平之间存在相反关系。
图17显示了在pUS2存在下I类重链的不稳定性。在图17A中，HFF细胞用5感染倍数的RV35(缺失US11-US6；保留US2)感染。在感染后3天，细胞被脉冲标记0.5小时，然后或者立刻收获感染细胞的蛋白质(P)，或者在未标记的培养基中跟踪一段时间后(0.5、1、2或3小时)收获蛋白质。重链(HC)用TP25.99单克隆抗体进行免疫沉淀。在RV35感染细胞中I类重链的半衰期约为0.5小时。相反，用未感染的或用RV798感染的细胞进行的平行试验(未标出)表明，重链的半衰期大于3小时。在图17B中，在U373-MG亲代细胞或稳定转染的细胞系55-212和55-310中进行类似的脉冲-追踪放射性标记-免疫沉淀试验。与表达可方便检测量的pUS2的55-310细胞系不同，U373-MG细胞或55-212细胞系都不表达US2。I类重链在不表达US2的细胞中是稳定的，但是在表达pUS2的细胞(即55-310)中半衰期短。在图17C中，将图17B中所用的同样脉冲-追踪抽提物用于使用Ber-T9单克隆抗体的对照免疫沉淀中，该抗体对另一种细胞糖蛋白运铁蛋白受体(TfR)特异。在全部3种细胞系中，运铁蛋白受体的稳定性和加工是相似的。
优选实施例的说明构建表达标记基因(β-葡糖苷酸酶)(该基因取代了一组病毒基因)的重组HCMV突变体RV670(Jones and Muzithras，1992)。用此突变体感染人成纤维细胞后，主要组织相容性复合体(MHC)I类重链的表达并不象野生型HCMV感染此类细胞时那样被降低。
与野生型HCMV不同，本发明的重组HCMV突变病毒并不负调节细胞的MHC I类重链蛋白的表达。令人惊奇的是，已发现一个7kb的HCMV基因组区域含有重链表达负调节必需的基因，并被用于本发明。下面详细所述的，是两个位于该7kb区域的、能足以独立地负调节MHC I类重链的遗传基因座。US11基因是一个这样的基因座，而另一个基因座是US2-US5基因亚区(即亚区A)。这两个基因座都在从US2至US11(含)的HCMV基因组7kb区域中，该区域在重组病毒RV798中被缺失(图9和12)。因此，RV798感染的细胞不会负调节MHC I类重链。通过构建和分析其他限定的HCMV突变体，已发现基因座被US11基因所界定，这被其他研究所证实。US11在多种稳定转染的细胞系中组成型地以各种水平表达。在这些细胞系中的蛋白表达分析表明US11的表达与MHCI类的表达呈反相关。随后发现，在第二个基因座(US2-US5)中的、足以负调节MHC I类重链的HCMV基因是US2。
本领域熟练技术人员应该知道，激活和扩增有效的细胞介导的免疫应答所需的细胞毒性T淋巴细胞前体需要有效的抗原加工和呈递。有效的病毒抗原呈递要求在感染全过程中MHC I类蛋白的持续表达。用RV670感染细胞能够产生稳定的I类重链的持续表达。
本领域熟练技术人员应该知道，病毒(RV670)或具有类似基因缺失的其它人巨细胞病毒可被用于生成有效的活疫苗，因为I类重链在RV670感染细胞中仍象在非感染细胞中一样得以表达，并由此产生为了引发细胞毒性T细胞应答的病毒抗原呈递。
在本发明中，流式细胞计数和免疫荧光实验证实，在HCMV野生型AD169株感染的HFF细胞中，I类重链的细胞表面表达在感染后晚期严重降低。放射性标记-免疫沉淀实验显示，从感染后很早(3小时)开始，新合成MHC I类重链的负调节发生于感染的全过程(图4C)。这种降低据报道是发生于转译后水平I类重链在HCMV感染细胞中的周转速度高于其在非感染细胞中(Beersma等，1993)。这种I类重链的不稳定性因病毒肽不能有效呈递而降低了细胞介导的对HCMV感染的免疫应答。因此，就在确立持久的或潜在的HCMV感染中躲避宿主的免疫系统而言，I类重链表达的降低是十分重要的(Gooding，1992)。
筛选了一个HCMV突变体库，它代表了18个ORF，它们就其在组织培养中的病毒复制以引起MHC I类重链负调节的能力而言是非必需的。HCMV基因组S部分中一段7kb区域(含有ORF US2-US11，碱基193119-200360)清除地显示出含有这种表型所必需的基因(数据归纳于图9)。在此区域内，有两个亚区，每个都含有足以进行重链负调节的基因。
亚区A具有ORF US2-US5(碱基193119-195607)。US2和US3被认为编码膜糖蛋白(Chee等，1990)。US3是差异剪接基因，在病毒复制循环的全过程中表达，编码着一种具有转录反式激活功能的蛋白质(Tenney和Colberg-Poley，1991；Colberg-Poley等，1992；Tenney等，1993；Weston，1988)。此亚区内还有几个较小的ORF(位于ORF US3和US5之间)，但它们的表达特征或功能未有报道。据Gretch和Stinski报道，有一段1.0kb的从HCMV基因组该区域转录的早期mRNA，但未对精细作图。现在，第一次发现在该基因座(US2-US5)中的US2基因的表达足以负调节MHC I类重链。
亚区B也足以引起MHC I类重链的负调节，它含有US10和US11基因(图9)，碱基199083-200360。但是，根据使用表达野生型水平的US10基因产物的HCMV突变体RV67而得到的数据，US10的表达不足以引起重链表达的负调节(图5A)。遗传数据暗示，US11基因产物是必需的。本文已表明，在不含其它HCMV蛋白时，US11的表达足以在稳定转化的非感染细胞中引起MHC I类重链的负调节(图15)。US11的RNA和蛋白质表达都开始于早期且贯穿感染的全过程(Jones和Muzithras，1991)；US11编码32kDa(gpUS11)糖蛋白，它具有N连接的、对内切糖苷酶H敏感性的糖残基。免疫荧光试验显示，gpUS11并不位于细胞表面，相反可在HCMV感染细胞的细胞质中检测到(图10)。因此，gpUS11存在于内质网或高尔基体内侧中。HCMV gpUS11的特征与腺病毒2型E3区域编码的25kDa糖蛋白(E3-19K)相似。Ad E3-19K不是病毒复制所必需的。已证明，其特征为含有内切糖苷酶H敏感性的N连接糖残基、存在于内质网中、以及与I类重链结合，因而能够防止其向细胞表面9的运送(Anderson等，1985；Burgert和Kvist，1985)。与Ad E3-19K相反，没有发现gpUS11与I类重链之间的直接关联(即通过共免疫沉淀)(未给出数据)。
鉴定US2-US11基因区域作为HCMV基因组的MHC I类重链负调节必需区有几方面意义。如上所述，在感染全过程中基因组此区域的表达起着干扰有效的细胞介导的免疫应答的作用。供激活和扩增细胞毒性T淋巴细胞(CTL)前体群的抗原呈递需要有MHC I类分子的表面表达(Schwartz，1985)。此外，它们也是已激活的CTL识别目标所必需的(Zinkernagel和Doherty，1980)。在MCMV中，针对主要极早期蛋白的CTL能够避免此病毒的致命感染(Jonjic等，1988)。但是据报道，在HCMV感染个体中，针对同源HCMV极早期蛋白IE1的CTL极少(Gilbert等，1993)。最近的研究表明，以干扰素-γ处理过的HCMV感染的细胞呈递IE肽比未处理过的细胞更有效(Gilbert等，1993)。干扰素γ引起MHC I类蛋白表面表达的增加。因此，提高HCMV感染的细胞中I类重链的表达在有效产生IE特异的CTL或针对其它重要的HCMV抗原的CTL方面可能是重要的。US2-US11基因区域缺失的HCMV突变体具有此效果，因为以此突变体感染细胞时I类重链并不被负调节。所以，在开发诱导高效抗HCMV免疫应答的活HCMV疫苗中，病毒基因组此区域的缺失是重要的。
出于多种理由，阐述US2和US11基因产物足以负调节I类是至关重要的，因为基于这样的事实I类蛋白质介导细胞毒T淋巴细胞(它是细胞免疫应答的主要成员)的激活及细胞毒T淋巴细胞识别靶细胞。US2和US11，作为基因，也可作为蛋白质，可以用于不需要细胞I类MHC表达的临床治疗方案中基因治疗载体(如腺病毒载体)和减少同种移植排斥。US2和US11可用作工具以鉴别与I类重链相互作用从而影响I类重链蛋白稳定性、加工、和向细胞表面的转移的其他细胞蛋白质。使用活的、去除US2或US11或两者都去除的病毒HCMV疫苗策略可以获得一种比含有这些基因的病毒更佳的免疫原病毒。
几年前，有报道称HCMV UL18ORF编码一种类似MHC I类重链的蛋白质(Beck和Barrell，1988)。HCMV感染细胞中重链的负调节被假设为是由于UL18基因产物对β2-微球蛋白的竞争，该竞争有效地防止了正常情况下I类重链与β2-微球蛋白的结合(Browne等，1990)。UL18缺失的HCMV突变体仍保持其负调节重链表达的能力，此假设因而被否认(Browne等，1992)。仍有可能，UL18基因的产物只是多个HCMV基因中的一个，其表达足以导致此表型。但是，本发明的数据显示，只有US2-US11区域内的基因才足以负调节I类重链。
有两种互不相关的机制都能引起MHC I类表达的负调节，强调了这种表型对在宿主中有效感染和抗性的重要性。一种机制可能是另一种机制的支持体系，但也可认为每一体系都有其细胞类型特异性。在HFF细胞体系中，两种机制都有效。在单纯疱疹病毒体系中存在这种情况。据最近的报道，88个氨基酸的US12基因产物足以在内质网中与I类重链螯合(York等，1994)。但是，在单纯疱疹病毒感染的鼠细胞中，重链的表达不受影响，但ICP47蛋白在那些细胞中有表达，在HSV感染的人成纤维细胞体系中鼠的重链表达被负调节(York等，1994)。
可制备一种含有本发明重组HCMV突变体的药物组合物，其中能够在被感染细胞中负调节MHC I类表达的HCMV基因组区域已经被缺失。在药物组合物中可使用稳定剂或其它合适的载体。
如前所述，缺失了MHC I类表达负调节HCMV基因组区域的本发明重组HCMV突变体可用于预防巨细胞病毒感染的疫苗中。被缺失的HCMV基因组最好是US2、US11可读框架或两者。该疫苗在药学上认可的载体中含有有效量的重组HCMV突变体。疫苗中可加也可不加佐剂。
给个体施用免疫原性量的本发明重组HCMV突变体可对个体进行针对巨细胞病毒免疫，此突变体中缺失了能够负调节MHC I类表达的基因序列。被缺失的基因序列最好是含有US2、US11可读框架或两者的区域。
个体施用以免疫原性量的本发明重组HCMV突变体可防止或降低个体对急性巨细胞病毒的易感性，此突变体中缺失了能够负调节MHC I类表达的基因序列。被缺失的基因序列最好是含有US2、US11可读框架或两者的区域。
有一种方法可控制巨细胞感染细胞中MHC I类表达负调节的方法，其步骤包括鉴定能够负调节主要组织相容性复合体的基因序列，然后从巨细胞病毒基因组中删除鉴定出的基因序列。
如前所述，与MHC I类重链负调节有关的基因序列可与腺病毒或其它类似的以病毒为基础的基因治疗载体结合，以尽可能减弱免疫应答，从而允许这些载体用于基因治疗。一种以病毒为基础的基因治疗载体含有可读框架US2的基因序列。另一种以病毒为基础的基因治疗载体含有可读框架US11的基因序列。另一种以病毒为基础的基因治疗载体含有亚区A和B的基因序列(分别是可读框架US2-US5和US10-US11)。
实施例1病毒与细胞向美国典型培养物保藏中心(ATCC)获取HCMV AD169株，按本领域熟练技术人员所熟知的标准实验方案进行繁殖。人包皮成纤维(HFF)细胞是在此实验室中分离的，且使用传代数20以内的细胞(Jones和Muzithras，1991)。HFF细胞被培养在含10％胎牛血清和25mM HEPES的Dulbeccos改良Eagle培养基(DMEM)中。
DNA序列本发明使用的是HCMV AD169株DNA序列(基因库编号X17403)的Chee等(1990)的编号体系。
质粒利用现有方法构建用于制造HCMV突变体的质粒(Jone等，1991；Muzithras；1992)。一般，在β-葡糖苷酸酶报道基因两侧环绕以两段1.5kb的HCMV序列，两序列位于要从病毒中删除的基因的两侧。每一次，在转染前，用于原核骨架内剪切的限制性酶将质粒DNA线性化。衍生于pHind-G、pHind-X、或pXba-P的HCMV AD169株基因组DNA片段，分别含有HindIII-G DNA片段(碱基176844至195837)、-X DNA片段(碱基195837至200856)和XbaI-P DNA片段(碱基200391至206314)(Oram等，1982；Jones等，1991)。pUS7/US3含有衍生自pHind-G和pHind-X的1.7kb的PstI-PstI HCMV片段(pIBI30载体中的碱基196447至194741，[International Biotechnologies，Inc.])。
通过β-葡糖苷酸酶置换ORF IRS1至US9和US11(但没有US10)，以及质粒载体序列都如以前所描述(Jones and Muzithras，1992)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至IRS1(即RV7186；图1B)，构建pBgdUS11/IRS1。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、含有早期和晚期聚腺苷酸化信号的288b SV40片段(取自pRcCMV[Invitrogen])和1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基189763至188062，含有J1I至IRL1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US12(即RV798；图1C)，构建pBgdUS11/US12。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、含有US10聚腺苷酸化信号的255b片段(碱基199276至199021，来自pHind-X)和1.3kb的NheI-ApaI片段(碱基193360至192063，含有C末端的US2至IRS1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US6(即RV35；图1D)，构建pBgdUS11/US6。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶和1.5kb的HpaI-SstII片段(碱基195589至194062，含有C末端的US6至US3序列，来自pHind-G)。
以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US10、或单个US11(即RV67和RV699)在前已说明(Jones等，1991)。此外，以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US9-US8、US7(单个)或US6(单个)(即分别是RV80、RV725和RV69)以前已经描述过(Jones and Muzithras，1992)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US9至IRS1(即RV7181；图1E)，构建pBgdUS9/IRS1。在序列上，该质粒含有1.1kb的SalI-ApaI片段(碱基200171至199021)、351b的SV40早期启动子(来自pRcCMV)、β-葡糖苷酸酶、288bSV40聚腺苷酸化信号片段和1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基189763至188062，含有J11至JRL1序列，来自pHind-G)为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US6至IRS1(即RV7177；图1F)，构建pBgdUS6/IRS1。在序列上，该质粒含有1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基188062至189763，含有IRL1、J11和IRS1启动子序列，来自pHind-G)、β-葡糖苷酸酶、含有US10聚腺苷酸化信号的255b片段(碱基199276至199021，来自pHind-X)和1.8kb的BsmI-SauI片段(碱基196222至198030，含有C末端的US9序列，来自pHind-X)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US3和US2(即RV47；图1G)，构建pBgdUS3/US2。在序列上，该质粒含有1.7kb的PstI-PstI片段(碱基196447至194741)，含有HSV-1gH启动子的180b SmaI-HaeIII片段(McKnight，1980)、β-葡糖苷酸酶、255b US10聚腺苷酸化信号片段和1.3kb的NheI-ApaI片段(碱基193360至192063，含有C末端的US2至IRS1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US1(即RV5122；图1H)，构建pBgdUS1。在序列上，该质粒含有1.8kb的AatII-SstI片段(碱基190884至192648，含有IRS1和US1的C末端序列，来自pHind-G)，180b的含HSV-1gH启动子的SmaI-HaeIII片段(McKnight，1980)、β-葡糖苷酸酶，255b US10聚腺苷酸化信号片段和1.6kb的SphI-SphI片段(碱基192934至194544，含有US2和C末端的US3序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF IRS1(即RV46；图1I)，构建pBgdIRS1。在序列上，该质粒含有1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基188062至189763，含有IRL1、J1I和IRS1的启动子序列，来自pHind-G)、β-葡糖苷酸酶、255b含US10聚腺苷酸化信号的片段(碱基199276至199021，来自pHind-X)和1.2kb的NarI-XhoI片段(碱基191830至193003，含C末端IRS1和US1序列，来自pHind-G)。
为了删除HCMV ORF US11至US2但不插入报道基因(即RV799；图1J)，构建pdUS11/US2。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、65b的含有US10聚腺苷酸信号的NruI-ApaI片段(碱基199086至199021，来自pHind-X)和1.3kb的NheI-ApaI片段(碱基193360至192033，含有C末端的US2至IRS1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US4(即RV8146；图2B)，构建pBgΔUS11/US4。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11的启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、180b的HSV-1胸苷激酶聚腺苷酸化信号的SmaI-HaeIII片段(McKnight，1980)和1.662kb的EcoRV-SmaI片段(碱基195083至193421；含有US3和US2序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US3(即RV8173；图2C)，构建pBgΔUS11/US3。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11的启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、180b的HSV-1胸苷激酶聚腺苷酸化信号的SmaI-HaeIII片段(McKnight，1980)和1.464kb的KpnI-SacI片段(碱基194112至192648；含有US2和US1序列，来自pHind-G)。
重组突变HCMV的分离如现有技术所述进行重组突变体HCMV的产生与分离(Jones等，1991；Jones和Muzithras，1992)。转染当天裂解HFF细胞使其具有70％至80％的汇合性。以胰蛋白酶处理细胞，在DMEM/10％FCS/25mM HEPES中悬溶成5.6×106细胞/ml。利用改良的硫酸钙协同沉淀技术进行DNA转染。将1.5μg感染型HCMV DNA和2.5μg线性质粒DNA混合于氯化钙溶液(300μl，含10mMTris pH7.0/250mM氯化钙)中，冰上冷却。为了引发协同沉淀，将DNA从冰上移开，温和搅拌的同时滴加300μl 2X HeBS pH6.95(室温下；1X HeBS为19.2mM HEPES，137mM NaCl，5mM KCl，0.8mM磷酸钠，0.1％葡萄糖)。1.5分钟后，将沉淀置于冰上(为了防止进一步形成沉淀)。将沉淀与3×106细胞(悬浮液)混合，置于82mm的组织培养板中。在37℃ 6小时后，去除培养基，在1X HeBS中以20％的DMSO休克细胞2分钟。细胞以PBS洗涤两次，加入生长培养基。每4-7天换一次培养基。14天后，可观察到病毒噬斑，在细胞上铺一层含0.5％琼脂糖的含150μg/ml X-gluc(5-溴4-氯3-碘葡糖苷酸；Biosynth)的DMEM。加入上层几天后，选取蓝色噬斑(即β葡糖苷酸酶阳性突变体病毒噬斑)。重组病毒噬斑纯化三次。HCMV突变体RV799是β葡糖苷酸酶阴性的，所以对以上方法进行改良后进行分离。此时，以β葡糖苷酸酶阳性的HCMV突变体RV134作为亲代病毒(Jones等，1991)。这样，在转染中用HCMV突变体RV134代替野生型AD169株DNA。随机挑选初级转染板上出现的初级噬斑，在HFF细胞上再铺平板。10天后，去除培养基，如上所述在被感染细胞上铺以含X-gluc琼脂糖。此种情况下，4天后选取白色噬斑(β葡糖苷酸酶阴性突变体病毒噬斑)，并纯化噬斑。根据现有技术所述，通过DNA印迹杂交分析法验证每一种HCMV突变体的正确基因组结构。
抗体与HCMV US11蛋白和HCMV UL80蛋白反应的兔多克隆抗体同现有描述(Jones等，1991；1994)。人MHC I类蛋白重链上一构象依赖性表位特异性的鼠单克隆抗体W6/32和人运铁蛋白受体特异性的Ber-T9是购置的。向Dr.S.Ferrone获取对人MHC I类蛋白重链上一构象非依赖性表位特异的鼠单克隆抗体TP25.99(D’Urso等，1991)(Department of Microbiology，New YorkMedical College，Valhalla，NY)。HCMV IE1蛋白特异性的鼠单克隆抗体9221是向Dupont购置的。
US2多克隆抗血清的获得是通过分离US2-谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白，然后将其在兔中用作免疫原。具体地，HCMV US2基因的编码氨基酸20至110的部分通过聚合酶链反应以NcoI/EcoRI片段形式产生，然后按框架融合在pGST(Nco)载体中GST蛋白的C末端，形成质粒pGST(Nco)-US2。载体pGST(Nco)是从谷胱甘肽S转移酶融合载体pGEX-2T(Pharmacia货号No.27-4801-01)修饰而得，即通过用SmaI消化并添加NcoI接头从而保留可读框架。将质粒pGST(Nco)-US2引入大肠杆菌DH5株，用IPTG诱导融合蛋白的合成。从超声波破碎的大肠杆菌中通过结合于谷胱甘肽葡聚糖4B(Pharmacia)然后洗脱(按制造商所述方法)而分离GST-US2融合蛋白。将100微克的每份GST-US2融合蛋白在雌性新西兰白兔中用作免疫原，以产生US2多克隆抗血清。
被感染细胞蛋白质的放射性标记和免疫沉淀根据标准方案进行脉冲-追踪放射性标记(Sambrook等，1989)。HCMV感染的HFF细胞(感染倍数5PFU/细胞)在感染后的所示时段，在无甲硫氨酸/半胱氨酸的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)中，以200μCi[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(NEN-DuPont)/ml脉冲标记。去除放射性培养基，细胞在完全DMEM中洗涤两次，在完全DMEM中进行所示时间的追踪。用三重去垢剂裂解缓冲液(Sambrook等，1989)抽提蛋白质。保留澄清后的蛋白质提取物(4℃以15000×g离心5分钟后的上清液)，用于根据标准法的免疫沉淀(Sambrook等，1989)。使用蛋白A琼脂糖(Pharmacia)沉淀出与抗体结合的蛋白质。为了人运铁蛋白受体的免疫沉淀，在蛋白质A琼脂糖之前加入兔抗鼠IgG(Pierce)。在2-巯基乙醇存在下煮沸经洗涤的沉淀物，在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。固定凝胶，并浸在1M水杨酸钠(Sambrook等，1989)中，然后干燥并放射自显影。
免疫荧光术根据标准方案进行免疫荧光测试(Harlow，1989)。全部步骤在60mm的组织培养板中进行。简而言之，感染或未感染的细胞用仲甲醛固定，用0.2％TritonX-100(有指示)透化。加入3％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液溶液后，细胞在4℃静止过夜。顺次用以下抗血清处理细胞、每种均在室温下处理30分钟10％HCMV阴性人血清(为了封闭Fc受体)；所示第一抗体；和FITC结合的抗鼠或抗兔IgG(适当选用)。
实施例2HCMV感染的人成纤维细胞中的I类负调节在人包皮成纤维(HFF)细胞培养体系中确定MHC I类重链负调节的时间和特性。根据流式细胞计数，使用构象依赖性I类单克隆抗体W6/32时，在感染后晚期(即72小时)，被HCMV AD169株野生型感染的HFF细胞在I类重链于细胞表面表达方面显著降低(图1)。在使用构象非依赖性I类单克隆抗体TP25.99的Western测试中证明，在感染后晚期，I类蛋白质的稳态水平也降低(图4A)。由于病毒肽是在细胞表面被感染后组装的I类复合体呈递的，所以通过代谢放射性标记的蛋白质免疫沉淀来评价感染后各时刻合成的I类蛋白质状态。如图4B所示，不论有无病毒DNA合成抑制剂膦酰基甲酸盐，都可检测到I类重链表达的减少。这表明，病毒极早期或早期基因功能足以减少重链。此外，还证明了感染后很早就出现重链负调节3小时(图4C)。由于此效果是使用构象非依赖性抗体观察到的，这种减少反映了新合成重链的总体水平。
无MHC I类负调节功能的HCMV突变体的筛选代表了18个非必需ORF(UL33、UL81、IRS1、US1-US13、US27-US28和TRS1)的几种前文构建的HCMV缺失突变体通过流式细胞计数和免疫沉淀分析就重链表达进行筛选。只有RV670，缺失了HCMV基因组(Jones和Muzithras，1992)S部分内一段9kb区域的突变体不保留野生型的负调节表型(图5A)。该突变体缺失了至少11个ORF，从IRS1至US11(US10除外)，其中包括据说编码糖蛋白的US6族基因(US6-US11)(Chee等，1990)。为了证实这一观察结果，分别对另外获得的两个突变体进行了测试，一个与RV670具有相同的缺失，另一个新突变体RV7186缺失了完整的IRS1至US11区域(图1)。表型均与RV670相同，而且稳定表达I类重链。先前，我们构建了US6族ORF缺失HCMV突变体，包括单个缺失或成组缺失(Jones和Muzithras，1992)，以及类似的邻近IRS1-US3区域内的缺失突变体。根据利用构象非依赖性抗体的免疫沉淀，全部这些突变体均被证明保留了在HFF细胞内，在感染后晚期负调节I类重链的能力(图5A)。对照实验显示，根据pp65蛋白(图5B)和UL80蛋白(图5C)的表达判断，不同的感染细胞培养物间放射性标记相当(图5B)，而且直至晚期的感染进展相当。这些数据显示(i)一个以上病毒基因足以减少I类重链；或(ii)US3至US6之间的基因(在RV670和RY7186中缺失但保留于其它突变体中)是表型所必需的。
MHC I类重链负调节所必需的HCMV基因组的一7kb区域的鉴定为了进一步确定含有与MHC I类重链负调节有关基因的区域的位置，构建了缺失IRS1-US11基因区内多个基因的其它HCMV置换突变体(图1)。其中之一，RV798缺失了US2-US11的基因。以RV798感染HFF细胞，并在感染后晚期进行测试，MHC没有象在野生型AD169株感染的细胞中那样被负调节(图5A)；实际上，观察到轻微的刺激作用。对与RV798相同的几种非依赖性缺失突变体进行了类似的检测全都丧失了负调节I类重链的能力。
为了进一步证实7kb的HCMV US2-US11区域含有重链负调节所需的基因，构建了突变体RV799，其中具有与RV798相同的US2-US11缺失，但是以一种不同的方法产生的。通过插入β葡糖苷酸酶标记基因代替US2-US11，由野生型AD169株制得RV798。相反，RV799的亲代是RV134(β葡糖苷酸酶阳性突变体，因为具有插入在US9-US10基因间区域的β葡糖苷酸酶表达盒(Jones等，1991))。为了构建RV799，涉及了一种质粒，它在与RV134重组后同时就缺失了US2-US11和β葡糖苷酸酶表达盒(图1J)。根据β葡糖苷酸酶底物存在下的白色噬斑分离出合适的RV799HCMV突变体，因为它是β葡糖苷酸酶阴性的。RV799而不是其RV134亲代，与RV798的表型相同(图6)。这样，由于RV789和RV799是使用保留了I类重链负调节能力的亲代以不同方法构建的，这就证实了表型必需基因位于7kb的US2-US11区域内(碱基193119至200360)。
为了测定适当的I类重链细胞表面表达是否发生在RV798或RV799感染后的晚期，进行了免疫荧光测试。使用构象依赖性单克隆抗体(W6/32)或构象非依赖性单克隆抗体(TP25.99)，在未感染和RV798和RV799感染的HFF细胞中都检测到了MHC I类重链的细胞表面表达，但野生型AD169感染的HFF细胞除外。I类重链在非感染细胞中适当成熟而产生内切糖苷酶H抗性分子。相反，AD169感染细胞中合成的I类重链据报道是完全内切糖苷酶H敏感性的(Beersma等，1993)。如图7所示，RV798感染细胞内合成的I类重链不论在感染后早晚还是晚期，都转化为成熟的内切糖苷酶抗性形式，转化率与非感染细胞中合成的相近。总之，这些数据表明，MHC I类的合成、加工和表面表达在以这些HCMV突变体感染的细胞中均未受到破坏。此外，此结果显示，含US2-US11基因的7kb区域包含了一个或多个HCMV负调节重链所需的基因。
在US2-US11基因区域中的两个亚区含有涉及I类重链负调节的基因在RV35中缺失的HCMV基因组区域来自US6-US11，而在RV798中缺失的区域来自US2-US11(图1)。在RV35感染的HFF细胞中，MHC I类重链被负调节，但是在RV798感染的细胞中没有被负调节(图5A)。该数据表明，在重链负调节中所涉及的一个或多个基因位于从ORF US2至US5的2kb亚区(亚区A；碱基193119-195607)中。为了确定该2kb亚区是否是I类重链负调节所需要的，检查HCMV置换突变体RV7181和RV7177。在这些突变体中分别缺失HCMV ORF IRS1-US9和IRS1-US6(图1)；因此，在两个突变体中都不存在亚区A。在感染后晚期时受感染HFF细胞的试验表明，两种突变体都保留了有效地负调节I类重链基因表达的能力(图8)。因此，当亚区A中的基因存在于HCMV基因组中时，便足以减少MHC表达(如RV35)，尽管它们的存在并不是该表型所必需的。此外，累积的数据(总结于图9)表明，在所鉴别的7kb的US2-US11区域(即在RV798中缺失的区域)中，没有一个HCMV基因是在受感染的HFF细胞中有效地负调节重链所绝对需要的，这暗示来自US2-US11基因区域的其他部分的基因也足以在感染晚期表型出该表型。
表明US11基因产物涉及MHC I类重链负调节的证据在用突变体RV7181(缺失IRS1-US9(图1))感染的HFF细胞中，MHC I类重链表达被负调节，这与RV798感染的HFF细胞相反(图8A)。该数据暗示由US10和US11基因(碱基199083-200360)构成的第二个亚区(亚区B)与减少重链表达有关。然而，从HCMV基因组结构中表达US10不足以进行重链负调节。HCMV突变体RV670以类似于野生型的稳态水平表达US10而且缺失了7kb的US2-US11基因区域中所有其他ORF，但是它不能在受感染的HFF细胞中造成MHC I类重链的负调节(图5A)。因此，US11是该遗传数据所暗示的位于亚区B中的基因。
US11编码32千道尔顿的糖蛋白(gpUS11)，该糖蛋白含有N-连接的(而不是O-连接的)碳水化合物，该碳水化合物对内切糖苷酶H完全敏感，这表明糖处于高甘露糖形式。在感染过程中都检测到gpUS11，从感染后非常早的时候(即3小时)开始并持续到晚期。然而，gpUS11在受感染细胞中的水平在感染后约8小时时最高。为了确定它在受感染细胞中的位置，在野生型AD169株感染细胞的免疫荧光分析中使用兔多克隆抗血清(Jones andMuzithras，1991)。将未感染和RV699感染的HFF细胞用作阴性对照。RV699是与AD169同型的HCMV突变体，不同点是缺失了US11 ORF(Jone等，1991)。在感染后8小时被固定和透化的细胞中，在AD169感染的HFF细胞中观察到使核界限模糊的细胞质荧光，但是在两个阴性对照细胞中都没有观察到(分别为图10A和10C)。一般，在核周围区域中的特异性荧光更强。在未透化细胞中没有检测到特异性的荧光(图10B和10D)。荧光数据和内切糖苷酶H敏感性数据表明，gpUS11不是细胞表面糖蛋白。根据翻译的DNA序列，预计gpUS11在靠近其N-末端和C末端处有疏水性结构域(Weston andBarrell，1986)，它们分别是假定的信号肽序列和跨膜结构域。因此该gpUS11与细胞质内的膜(可能是内质网或这一边的高尔基体(cis golgi))关联。
表明US2基因产物涉及MHC I类重链负调节的证据在RV35感染的细胞中I类重链被负调节，但是在RV798感染的细胞中不负调节(图11和12)。为了确定在亚区A(即US2-US5)中的、足以负调节MHC I类重链的HCMV基因，构建了几个额外的HCMV缺失突变体并分析。这些新的突变体包括RV8146和RV8173，它们分别缺失基因区域US4-US11和US3-US11(图2)。新的突变体的构建使用前述的同源重组技术。在被这些病毒感染的细胞中，I类重链表达用代谢放射性标记-免疫沉淀试验进行分析。与RV798感染的细胞不同，在用RV8146和RV8173感染的细胞中MHCI类重链被负调节(图11)。来自这些试验的累积数据表明，含有US3-US5的基因不是I类重链负调节所必需的。因为在突变体RV798和RV8173之间的基因型差别是后者有US2，因此US2在这些遗传试验中被牵涉。
RNA印迹分析表明，US2基因在HCMV复制周期的大部分中是被转录的，从感染后非常早的时候(如3小时)到晚期(如72小时)(图13A和13B)。为了直接分析US2蛋白(pUS2)的表达，在细菌中形成GST-US2融合蛋白，然后在兔中用作免疫原以产生针对pUS2的多克隆抗血清。该抗血清与在被HCMV野生型AD169株感染的细胞中、并在复制周期中表达的约24千道尔顿蛋白反应(图13C)。在这些试验中的pUS2的表观质量与计算机计算出的23.1千道尔顿的、衍生自翻译的US2 DNA序列(Chee等，1990)的US2蛋白的分子量相关性很好。来自上述遗传试验的数据预测，pUS2在用缺失突变体RV8146和RV8173感染的细胞中表达，但是不在RV798感染的细胞中表达。受感染细胞的蛋白质Western印迹分析证实了该预测(图13D)。
在感染后早期HCMV突变体对MHC I类重链表达的负调节已表明，在野生型AD169株感染的细胞中MHC I类表达的负调节在感染后非常早时间便开始(图4C)。为了确定突变体中某些是否不能早期负调节，用在感染后6-10小时放射标记的受感染HFF细胞的抽提物进行免疫沉淀试验。在用每个突变体感染后早期，HFF中I类重链的水平都被降低，除了RV798(该突变体缺失整个7kb的US2-US11区域)之外(图14A)。对照试验显示，不同突变体感染的细胞被同样地感染和放射标记(图14B和D)。另一种细胞糖蛋白即运铁蛋白受体的表达无差别地受各种突变体的影响(图14C)。因此，在感染后早期重链负调节所需的基因与感染后晚期减少重链所需的基因是相同的。此外，来自两个已鉴别的在感染后晚期负调节重链表达中所涉及的亚区中基因的表达，足以在感染后非常早的时候降低表达。
实施例3重组HCMV(RV798)疫苗制备用以前所描述的方法(Elek and Stern，1974)制备HCMV疫苗。HCMV突变体RV798在MRC-5人二倍体肺成纤维细胞(CCL171，美国典型培养物保藏中心)或人包皮成纤维细胞(MRHF[BioWhittaker])上生长。用等于1的感染倍数，在含5％牛血清和5％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle培养基中感染细胞。24小时后，除去培养基，用Hank′s平衡盐溶液或Dulbecco′s磷酸盐缓冲液洗涤3次。加入无血清的新鲜DMEM培养基；在出现晚期病毒细胞病变效应后(约为感染后7天)，孵育受感染的细胞4天。在预清除的离心步骤(在18℃ 6000×g离心20分钟)之后，再在18℃于15,500×g下离心1小时使无细胞的病毒沉淀。沉淀后的病毒再悬浮于含有25％山梨糖醇的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液中，以等份形式储藏于-70℃。RV798疫苗贮存物的效价用标准程序在人包皮成纤维细胞上确定(Wentwork and French，1970)。按以前所描述的方法(Elek and Stern，1974；Gehrz等，1980；Starr等，1981)，通过将约103-107噬斑形成单位的接种量皮下注射入上臂的三角肌区域而施用疫苗。
实施例4gpUS11足以负调节MHC I类重链在实施例2中来自被缺失病毒感染的细胞的数据表明，US11是在MHC I类重链负调节中所涉及的、位于HCMV亚区B(即US10-11)中的基因。为了确定在其他病毒基因产物不存在的情况下US11基因产物是否能够造成重链负调节，将包括碱基200391-199683在内的US11编码区域(碱基200360-199716[Chee等，1990])和某些非编码的侧翼序列克隆入真核表达质粒，处于组成型HCMV主要极早期启动子-增强子(major immediate-early promoter-enhancer)的转录调控之下。人U373-MG星形细胞瘤细胞(HTB17，美国典型培养物保藏中心)用该质粒转染(Sambrook等，1989)，并且在0.375mg/ml嘌呤霉素存在下选择稳定转化的细胞，因为该质粒还编码原核的嘌呤霉素抗性基因。挑出克隆并扩大成细胞系。那些表达gpUS11的克隆用Western印迹法鉴别；不同的细胞系表达不同数量的US11。在这些细胞中MHC I类重链表达按类似方式进行。如图15中所示，US11的表达与I类重链的表达呈反相关。这些数据证明，HCMV US11的表达足以在其他表达基因不存在的情况下负调节MHC I类重链的表达。
实施例5pUS2足以负调节MHC I类重链在实施例2中来自被缺失病毒感染的细胞的遗传数据表明，US2是在MHCI类重链负调节中所涉及的、位于HCMV亚区A(即US2-US5)中的基因。为了证实，构建组成型表达pUS2的稳定转染的细胞。在该例子中，将包括碱基193779-193003在内的HCMV US2编码区域(碱基193715-193119)和某些非编码的侧翼序列克隆入表达质粒pIEsp-puro，形成pIEspUS2-puro。在该质粒中，US2处于组成型HCMV主要极早期增强子-启动子的转录调控之下。该质粒还含有嘌呤霉素抗性基因表达盒。在将该质粒转入U373-MG星形细胞瘤细胞后，在药物嘌呤霉素(0.375mg/ml)存在下选择稳定转化的细胞并克隆。作为阴性对照，将含有代替US2的原核β-葡糖苷酸酶基因的类似质粒(pIEspBgluc-puro)用于转染，并筛选和克隆细胞系。用Western印迹分析这些细胞系中稳态蛋白质的表达。
与实施例4中表达US11的细胞系相似，发现US2的表达与MHC I类重链的表达呈反相关。具体地，亲代U373-MG细胞和用阴性对照质粒转染而得的细胞系55-212以及55-215不表达US2，并有高水平的I类重链(图6，泳道1-3)。细胞系55-303、55-304和55-310用pIEspUS2-puro转染并表达US2，但是I类重链的水平较低(图6，泳道5-7)。另一种来自pIEspUS2-puro转染的细胞系55-302不表达US2(可能是由于产生该细胞系过程中US2基因遭破坏。)，相反表达高水平的I类重链(图6，泳道4)。累积的数据表明，US2表达造成MHC I类重链表达的负调节。
来自HCMV感染细胞的数据表明，MHC I类重链的负调节通过转录后机制进行，它造成这些蛋白质的周转增加(即半衰期更短)(Beersma等，1994；Yamashita等，1994)。在用突变体RV35(缺失US6-US11并含有US2-US5基因座)感染的细胞中，I类重链的半衰期约为0.5小时，而在未感染的或被RV798感染的细胞中半衰期大于3小时(图17A)。因为US2是位于US-US5基因座中的、与I类重链负调节有关的基因，所以在稳定转染的、表达US2的细胞系中，预计I类重链的周转速度高于亲代U373-MG细胞和阴性对照细胞系。为了证实该预计，将各种类型的代表性细胞系用含35S-甲硫氨酸/半胱氨酸的培养基“脉冲”代谢放射性标记半小时，然后立刻收获或者在未标记的培养基中“追踪”一段不等的时间再收获。用脉冲-追踪抽提物进行的免疫沉淀试验表明，在亲代U373-MG细胞和阴性对照细胞系中(图17B，分别为泳道1-4和5-8)I类重链是稳定的(半衰期＞3.5小时)。相反，在表达US2的细胞系55-310中，I类重链的半衰期非常短(图17B，泳道9-12)，这可以由仅在脉冲样品检测到重链为证。
参考文献1.Alford，C.A.，and W.J.Britt.1990.Cytomegalovirus，p.1981-2010.In D.M.Knipe and B.N.Fields(ed.)，Virology，2nd ed. Raven press，New York.
2.Anderson，M.，S.Paabo，T.Nilsson，and P.A.Peterson.1985.Impairedintracellular transport of class I MHC antigens as a possible means for adenovirusesto evade immune surveillance.Cell 43215-222.
3.Beck，S.，and B.G.Barrell.1988.Human cytomegalovirus encodes aglycoprotein homologous to MHC class I antigens. Nature 331269-272.
4.Beersma，M.F.C.，M.J.E.Bijlmakers，and H.L.Ploegh.1993.Humancytomegalovirus down-regulates HLA class I expression by reducing the stability ofclass I H chains.J.Immunol.1514455-4464.
5.Browne，H.，M.Churcher，and T.Minson.1992.Construction andcharacterization of a human cytomegalovirus mutant with the UL 18(class I homolog)gene deleted.J.Virol.666784-6787.
6.Brown，H.，G.Smith，S.Beck，and T.Minson.1990.A complex between theMHC class I homolog encoded by human cytomegalovirus and β2 microglobulin.Nature 347770-772.
7.Burgert，H.G.，and S.Kvist.1985.An adenovirus type 2 glycoprotein blockscell surface expression of human histocompatibility class I antigens.Cell 41987-997.
8.Campbell，A.E.，J.S.Slater.1994.Down-regulation of majorhistocompatibility complex class I synthesis by murine cytomegalovirus early geneexpression.J.Virol.681805-1811.
9.Campbell，A.E.，J.S.Slater，V.J.Cavanaugh，and R.M.Stenberg.1992.Anearly event in murine cytomegalovirus replication inhibits presentation of cellularantigens to cytotoxic T lymphocytes.J.Virol.663011-3017.
10.Chee，Ms.，A.T.Bankier，S.Beck，R.Bohni，C.M.Brown，R.Cerny，T.Horsnell，C.A.Hutchinson，T.Kouzarides，J.A.Martignetti，E.Preddie，S.C.Satchwell，P.Tomlinson，K.Weston，and B.G.Barrell.1990.Analysis of theprotein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169.Curr.Top.Microbiol.Immunol.154125-169.
11.Colberh-Poley，A.M.，L.D.Santomenna，P.P.Harlow，P.A.Benfield，andD.J.Tenney.1992.Human cytomegalovirus US3 and Ul36-38 immediate-earlyproteins regulate gene expression.J.Virol.6695-105.
12.del Val，M.，K.Munch，M.Reddehasse，and U.Koszinowski.1989.Presentation of CMV immediate-early antigen to cytotoxic T Lymphocytes isselectively prevented by viral genes expressed in the early phase. Cell 58305-315.
13.D’Urso，C.M.，Z.Wang，Y.Cao，R.Tatake，R.A.Zeff，and S，Ferrone.1991.Lack of HLA class 1 antigen expression by cultured melanoma cells FO-1 dueto a defect inβ2m gene expression.J.Clin.Invest.87284-292.
14.Elek，S.D.，and H.Stern.1974.Development of a vaccine against mentalretardation caused by cytomegalovirus infection in utero.Lancet 11-5.
15.Gehrz，R.C.，W.R.Christianson，K.M.Linner，K.E.Groth，and H.H.Balfour，Jr.1980.Cytomegalovirus vaccinespecific humoral and cellular responsesin human volunteers.Arch.intern.Med.140936-939.
16.Gilbert，M.J.，S.R.Riddell，C-R.Li，and P.D.Greenberg.1993.Selectiveinterference with class I Major histocompatibility complex presentation of the majorimmediate-early protein following infection with human cytomegalovirus.J.Virol.673461-3469.
17.Gooding，L.R.1992.Virus proteins that counteract host immune defenses.Cell 715-7.
18.Gretch，D.R.，and M.F.Stinski.1990.Transcription of the humancytomegalovirus glycoprotein gene family in the short unique component of the viralgenome.Virology 174522-532.
19.Jones，T.R.，and Muzithras，V.P.1991.Fine mapping of transcriptsexpressed from the US6 gene family of human cytomegalovirus strain AD169.J.Virol.652024-2036.
20.Jones，T.R.，and V.P.Muzithras.1992.A cluster of dispensable geneswithin the human cytomegalovirus genome short componentIRS1，US1 throughUS5，and the US6 family.J.Virol.662541-2546.
21.Jones，T.R.，V.P.Muzithras，and Y.Gluzman.1991.Replacementmutagenesis of the human cytomegalovirus genomeUS 10 and US 11 gene productsare nonessential.J.Virol.6558600-5872.
22.Jones，T.R.，L.Sun，G.A.Bebernitz，V.P.Muzithras，H-J.Kim，S.H.Johnston，and E.Z.Baum.1994.Proteolytic activity of human cytomegalovirusUL80 protease cleavage site mutants.J.Virol.683742-3752.
23.Jonjic，S.，M.de Val，G.M.Keil，M.J.Reddehasse，and U.Koszinowski.1988.A nonstructural viral protein expressed by a recombinant vaccinia virusprotects against lethal cytomegalovirus infection.J.Virol.621653-1658.
24.Mavromara-Nazos，P.，M.Ackerman.and B.Roizman.1986.Constructionand properties of a viable herpes simplex virus 1 lacking coding sequences of thealpha 47 gene.J.Virol 60807-812.
25.McKnight，S.L.1980.The nucleotide sequence and transcript map of theherpes simplex virus thymidine kinase gene.Nucl.Acids Res.85949-5964.
26.Oram，J.D.，R.G.Downing，A.A.krigg，A.A.Dollery，C.J.Duggleby，G.W.G.Wildinson，and P.J.Greenaway.1982.Use of recombinant plasmids toinvestigate the structure of the human cytomegalovirus genome.J.Gen.Virol.59111-129.
27.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989.Molecular cloningalaboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.
28.Schwartz，R.H.1985.T lymphocyte recognition of antigen in associationwith gene products of the major histocompatibility complex.Ann.Rev.Immunol.3237-261.
29.Starr，S.E.，J.P.Glazer，H.M.Friedman.J.D.Farquhar，and S.A.Plotkin.1981.Specific cellular and humoral immunity after immunization with live Towne straincytomegalovirus vaccine.J.Infect.Dis.143585-589.
30.Tenney，D.J.，and A.M.Colberg-Poley.1991.Human cytomegalovirusUL36-38 and US3 immediate-early genestemporally regulated expression ofnuclear，cytoplasmic，and polysome-associated transcripts during infection.J.Virol.656724-6734.
31.Tenney，D.J.，L.D.Santomenna，K.B.Goudie，and A.M.Colberg-Poley.1993.The human cytomegalovirus US3 immediate-early protein lacking the putativetransmembrane domain regulates gene expression.Nucl.Acids Res.212931-2937.
32.Wentworth，B.B.，and French，L.1979.Plaque assay of cytomegalovirusstrains of human origin.Proc.Soc.Exp.Biol.，Med.135253-258.
33.Weston，K.1988.An enhancer element in the short unique region of humancytomegalovirus regulates the production of a group of abundant immediate earlytranscripts.Virology 162406-416.
34.Weston，K.，and B.G.Barrell.1986.Sequence of the short unique region，short repeats，and parts of the long repeats of human cytomegalovirus.J.Mol.Biol.192177-208.
35.Yamashita，Y.，K.Shimokata，S.Mizuno，H.Yamaguchi，and Y.Nishiyama.1993. Down-regulation of the surface expression of class 1 MHC antigens by humancytomegalovirus.Virology 193727-736.
36.Yamashita，Y.，Shimokata，K.，S.Mizuno，S.Tsurumi，T.，and Nishiyama，Y.1994.Rapid degradation of the heavy chain of class I major histocompatibilitycomplex antigens in the endoplasmic reticulum of human cytomegalovirus-infectedcells.J.Virol.687933-7943.
37.York，I，A.，C.Roop，D.W.Andrews，S.R.Riddell，F.L.Graham，andD.C.Johnson.1994.A cytosolic herpes simplex virus protein inhibits antigenpresentation to CD8+T lymphocytes.Cell 77525-535.
37.Zinkernagel，R.M.，and P.C.Doherty.1980.MHC restricted cytotoxic Tcellsstudies on the biological role of polymorphic major transplantation antigensdetermining T cell restriction specificity.Adv.Immunol.2751-177.
权利要求
1.一种重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，其特征在于，具有一基因组，该基因组缺失了一段能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类表达的基因序列，其中该缺失基因序列具有一段包含可读框架US2的区域。
2.一种在巨细胞病毒感染细胞中调控主要组织相容性复合体I类表达负调节的方法，其特征在于，其步骤包括(a)鉴定巨细胞病毒基因组区域内的一段基因序列，该序列含有能够负调节MHC I类表达的可读框架US2；和(b)从巨细胞病毒基因组中删除鉴定出的基因序列。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有一段缺失了能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类表达的基因序列的基因组，被缺失基因序列具有含可读框架US2的区域。
4.用于预防巨细胞病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，它在药学上认可的载体中包含有效量的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有缺失了能够负调节主要组织相容性复合体I类表达的基因序列的基因组，其中被缺失的基因序列具有含可读框架US2的区域。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，还含有佐剂。
6.一种免疫个体以抵抗巨细胞病毒的方法，其特征在于，对个体施用免疫有效量的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有一段缺失了能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类表达的基因序列的基因组，被缺失序列具有含可读框架US2的区域。
7.一种预防或降低个体对急性巨细胞病毒易感性的方法，其特征在于，对个体施用免疫原性量的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有一段缺失了能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类表达的基因序列的基因组，被缺失序列具有含可读框架US2区域。
8.一种以病毒为基础的基因治疗载体，其特征在于，它含有来自人巨细胞病毒基因组可读框架US2的基因序列。
全文摘要
以人巨细胞病毒(HCMV)感染人成纤维细胞引起MHC I类细胞表面表达的负调节。描述了一种不能负调节I类重链表达的重组突变体HCMV。还描述了在巨细胞病毒感染细胞中调控MHC I类表达的负调节的方法、药物组合物、疫苗组合物、预防或降低个体对急性巨细胞病毒易感性的方法和基于病毒的基因治疗载体。
文档编号C07K14/005GK1162336SQ95194401
公开日1997年10月15日 申请日期1995年7月31日 优先权日1995年7月31日
发明者T·R·琼斯 申请人:美国氰胺公司