表达嵌合的主要组织相容性复合物（mhc）ii类分子的转基因小鼠的制作方法
【专利说明】表达嵌合的主要组织相容性复合物（MHC)II类分子的转基 因小鼠
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月11日提交的美国专利申请13/793,935的权益，其内容在 此全部并入本申请。 发明领域
[0003] 本发明涉及一种非人动物，例如，啮齿动物（例如，小鼠或大鼠），所述动物经基因 工程改造以表达人源化主要组织相容性复合物（MHC)II类蛋白，以及表达其的胚胎、组织 和细胞。本发明还涉及到用于制备表达人源化MHCII类蛋白质的基因修饰非人动物的方 法。本发明还提供了使用表达人源化MHCII类蛋白的非人动物、细胞和组织来鉴定激活淋 巴细胞并衔接T细胞的肽的方法，并且用于开发人用疫苗和其他疗法的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 在适应性免疫应答中，外源抗原被在B淋巴细胞和T淋巴细胞上的受体分子（例 如，免疫球蛋白和T细胞受体或TCR)识别。这些外来抗原由特定的蛋白在细胞表面上以蛋 白片段的形式递呈，统称为主要组织相容性复合物（MHC)分子。MHC分子是由跨度约4Mb 的、被发现为基因的连接簇的多个基因座编码。在小鼠中，在17号染色体上发现MHC基因， 由于历史原因，其被称为组织相容性2 (H-2)基因。在人类中，在染色体6上发现该基因，被 称为人类白细胞抗原（HLA)基因。小鼠和人类中的基因座是多基因的；它们包括三个高多 态类MHC基因（1、11和III类），在人类和小鼠基因组（分别参见图2和图3)中表现出类 似的组织。
[0006] MHC基因座在基因组中表现出最高的多态性；一些基因由>300等位基因代表（例 如，人HLA-DRI3和人HLA-B)。所有I和II类MHC基因都可以递呈肽片段，但每个基因表达 具有不同结合特性、反映多态性和等位基因变体的蛋白质。任何给定的个体具有独特的肽 片段范围，其可以在免疫应答过程中被递呈在B和T细胞的细胞表面上。
[0007] 人类和小鼠都具有II类MHC基因（见图2和3)。在人类中，经典MHCII基因被 称为HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，而在小鼠中它们是H-2A和H-2E(通常分别缩写为I-A和 I-E)。由MHCII基因座中的基因编码的额外的蛋白，人类中的HLA-DM和HLA-D0,和小鼠中 的H-2M和H-20,都没有出现在细胞表面上，但它们驻留在内吞隔室并且确保MHCII分子正 确装载肽。II类分子由两条多肽链组成：a链和P链。所述a链的胞外部分包括两个胞 外域，a1和a2 ;并且P链的胞外部分也包括两个胞外域，P1和P2(见图1)。所述a 链和P链非共价地相互连接。
[0008] MHCII类分子在抗原呈递细胞（APC)上表达，例如，炎症的过程中的B细胞、巨噬 细胞、树突细胞、内皮细胞等。在APC表面上表达的MHCII类分子通常针对CD4+T细胞递 呈在细胞内囊泡中产生的抗原。为了参与CD4+T细胞衔接，所述具有目的抗原的MHCII类 复合物必须是足够稳定的，以存活足够长以衔接CD4+T细胞。当CD4+辅助T细胞由在APC 表面上的外源肽/MHCII复合物衔接时，所述T细胞被激活以释放协助针对入侵者的免疫 反应的细胞因子。
[0009] 因耐受机制，不是所有的抗原都引发T细胞活化。然而，在一些疾病（例如，癌 症、自身免疫性疾病）中，来自自体蛋白的肽成为免疫系统的细胞成分的靶标，这导致递呈 这些肽的细胞遭受破坏。在临床上具有显著意义的识别抗原方面（例如，与不同类型的癌 症相关的抗原）已经有显著进步。但是，为了提高对将引发人T细胞的适当的响应的肽的 识别和选择，特别是临床显著的抗原的肽，仍然需要模仿人免疫系统方面的体内和体外系 统。因此，需要可以显示人的免疫系统组件的生物系统（例如，遗传修饰的非人类动物和细 胞）。
[0010]发明概沐
[0011] 本发明提供了一种生物系统，其用于产生或鉴定与人MHCII类蛋白质及其嵌合物 相关联，并且与CD4+T细胞结合的肽。本发明提供了非人类动物，其包括表达在细胞免疫反 应中起作用的人源化分子的非人类细胞。本发明还提供了编码人源化MHCII蛋白质的人 源化啮齿动物基因座。还提供了表达人源化MHC分子的人源化啮齿动物细胞。本发明提供 了包括人源化啮齿动物细胞的体内和体外系统，其中，所述啮齿动物细胞表达一种或多种 人源化的免疫系统分子。
[0012] 本发明提供了非人类动物，例如，啮齿动物（例如，小鼠或大鼠）在其基因组中包 括编码人源化MHCII复合物的核苷酸序列，其中所述人源化MHCII复合物的人类部分包 括人MHCII复合物的胞外域，例如，人源化MHCIIa胞外域和人源化MHCIIP胞外域。
[0013] 在一个方面，本发明提供一种非人类动物，其在内源性MHCIIa基因座包括编码 嵌合的人/非人MHCIIa多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，这种嵌合的人/非人 MHCIIa多肽的人类部分包括人MHCIIa胞外域。在一个实施方式中，所述非人类动物在 该动物的细胞的表面上表达功能性的MHCII复合物。在一个实施方式中，在该动物中所述 人MHCIIa胞外域包括人MHCIIal和a2域；在一个实施方式中，所述嵌合人/非人MHC IIa多肽的非人类部分包括内源非人MHCIIa多肽的跨膜域和胞质域。在一个实施方式 中，编码嵌合的人/非人MHCIIa多肽的核苷酸序列与内源非人MHCIIa启动子和调控元 件可操作地连接（例如，在调节控制下被表达）。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类 部分来自人HLAII类蛋白，所述人HLAII类蛋白选自下组：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DPjiJ 如所述人类部分来自人HLAII类蛋白，所述人HLAII类蛋白选自下组：HLA-DR4、HLA-DR2、 HLA-DQ2和HLA-DQ8蛋白。所述非人类动物可以是啮齿动物，例如，小鼠。在一个方面，包 括在内源性MHCIIa基因座编码嵌合的人/非人MHCIIa多肽的核苷酸序列的所述非人 类动物进一步包括在内源性MHCIIP基因座编码嵌合人/非人MHCIIP多肽的核苷酸序 列。本发明还提供了一种制备基因修饰的非人类动物的方法，所述非人类动物包括在内源 性MHCIIa基因座编码嵌合的人/非人MHCIIa多肽的核苷酸序列。这种方法可以包括 在内源性MHCIIa基因座用编码嵌合的人/非人MHCIIa多肽的核苷酸序列取代编码内 源性非人MHCIIa多肽的核苷酸序列。
[0014] 本发明还提供一个非人动物，其包括在内源MHCIIP基因座编码嵌合的人/非人 MHCIIP多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，这种嵌合的人/非人MHCIIP多肽的 人类部分包括人MHCIIP胞外域。在一个实施方式中，所述非人动物在该动物的细胞的表 面上表达功能性MHCII复合物。在一个实施方式中，在该动物中的所述人MHCIIP胞外 域包括人MHCIIP1和(62域；在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人MHCIIP多肽的 非人类部分包括内源性非人MHCIIP多肽的跨膜域和胞质域。在一个实施方式中，编码嵌 合的人/非人MHCIIP多肽的所述核苷酸序列与内源性非人MHCIIP启动子和调控元件 可操作地连接（例如，在调节控制下被表达）。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部 分来自人HLAII类蛋白，所述HLAII类蛋白选自下组：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DPji^nm 述人类部分来自HLAII类蛋白，所述HLAII类蛋白选自下组：HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2 和HLA-DQ8蛋白。所述非人类动物可以是啮齿动物，例如，小鼠。在一个方面，包括在内源 性MHCIIP基因座编码嵌合的人/非人MHCIIP多肽的核苷酸序列的所述非人动物进一 步包括在内源性MHCIIa基因座编码嵌合的人/非人MHCIIa多肽的核苷酸序列。本发 明还提供一种制备基因修饰非人动物的方法，所述动物包括在内源性MHCIIP基因座编码 嵌合的人/非人MHCIIP多肽的核苷酸序列。这种方法可以包括在内源性MHCIIP基因 座以编码嵌合的人/非人MHCIIP多肽的核苷酸序列取代编码内源非人MHCIIP多肽的 核苷酸序列。
[0015] 在一个方面中，本发明提供了一种非人动物，所述非人动物包括在内源性MHCII基因座编码嵌合的人/非人MHCIIa多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/非人MHC IIP多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的人/非人MHCIIa多肽的人类部分包括人 MHCIIa胞外域并且嵌合的人/非人MHCIIP多肽的人类部分包括人MHCIIP胞外域。 在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人MHCIIa和P多肽在细胞表面上形成功能性嵌 合MHCII复合物（例如，人/非人MHCII复合物）。在一个实施方式中，所述人MHCIIa 胞外域包括人MHCII的人a1和a2域。在一个实施方式中，所述人MHCIIP胞外域包 括人MHCII的人P1和(62域。在各个方面，所述第一核苷酸序列在内源性非人MHCIIa 启动子和调节元件的调节控制下（例如，可操作地连接）表达。在各个方面，所述第二核苷 酸序列在内源性非人MHCIIP启动子和调节元件的调节控制下（例如，可操作地连接）表 达。在一些实施方式中，所述嵌合的人/非人MHCIIa多肽的非人类的部分包括内源性非 人MHCIIa多肽的跨膜域和胞质域。在一些实施方式中，所述嵌合的人/非人MHCIIP 多肽的非人类的部分包括内源性非人MHCIIP多肽的跨膜域和胞质域。
[0016] 在各种实施方式中，所述非人类动物是啮齿动物，并且所述嵌合的人/啮齿动物MHCIIa和0多肽的人类部分包括来自HLAII类蛋白的人序列，所述HLAII类蛋白选 自下组：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动 物MHCIIa和P序列的人类部分来自人HLA-DR4序列；因而，编码MHCIIa胞外域的所 述核苷酸序列是来自HLA-DRa*〇1基因的序列，并且编码MHCIIP胞外域的所述核苷酸序 列是来自HLA-DRP1*04基因序列。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物 的MHCIIa和0序列的人的部分均来自于人HLA-DR2序列；因而，编码所述MHCIIa胞 外域的核苷酸序列是来自HLA-DRa1*01基因的序列，并且编码所述MHCIIP胞外域的核 苷酸序列是来自HLA-DRI3 1*02基因的序列（例如，HLA-DRI3 1*02(1501)基因）。在本发 明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物MHCIIa和0序列的人的部分均来自于 人HLA-DQ2序列；因而，编码所述MHCIIa胞外域的核苷酸序列来自HLA-DQa1*05基因 的序列（例如，HLA-DQA1*1501基因），并且编码所述MHCIIP胞外域的核苷酸序列是来 自HLA-DQP1*02基因的序列。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物MHC IIa和序列的人的部分均来自于人HLA-DQ8序列；因而，编码所述MHC IIa胞外域的 核苷酸序列是来自HLA-DQa 1*0301基因的序列，并且编码所述MHC IIP胞外域的核苷酸 序列是来自HLA-DQ 1*0302基因的序列。
[0017] 在本发明的各种实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列位于同一条染色体上。 在一些方面中，所述动物包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的两个拷 贝，而在其它方面，所述动物包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的一个 拷贝。因此，所述动物对包括第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座可为纯合或杂合的。 在一个实施方式中，本发明所述嵌合MHC II是在非人类动物的种系中。
[0018] 在一些方面，所述嵌合的MHC IIa多肽和/或嵌合MHC IIP多肽与非人前导序 列可操作地连接。
[0019] 在一个方面，基因工程改造的非人类动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮 齿动物选自小鼠和大鼠。因此，在一些实施方式中，所述嵌合的MHC IIa和0基因的非人 序列来源于编码小鼠MHC II类蛋白质的核苷酸序列，例如，鼠H-2A或H-2E蛋白。在一个 实施方式中，本发明的所述啮齿动物（例如，大鼠或小鼠）不在其内源性的基因座表达功能 性内源性MHC II多肽。在一个实施方式中，其中所述啮齿动物是小鼠，所述小鼠不在其内 源性基因座表达功能性内源性H-2E和H-2A多肽。
[0020] 因此，在一些实施方式中，本发明提供了一种小鼠，所述小鼠在内源性小鼠MHC II 基因座包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIa多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/小鼠 MHC IIP多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC IIa多肽的人类部分包括来自人 HLA II类蛋白的a多肽的胞外域，所述人HLA II类蛋白选自HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2 和HLA-DQ8并且所述嵌合的人/小鼠的MHC IIP多肽的人类部分包括来自人HLA II类蛋 白的P多肽的胞外域，所述人HLA II类蛋白选自HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2和HLA-DQ8， 其中所述嵌合的MHC II a多肽的小鼠部分包括小鼠H-2A或H-2E a链的跨膜域和胞质域， 并且所述嵌合MHC II P多肽的小鼠部分包括小鼠H-2A或H-2E P链的跨膜域和胞质域，其 中所述小鼠表达功能性嵌合的HLA II类复合物。在一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DR4/H-2E。在另一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物 是HLA-DR2/H-2E。在另一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DQ2/ H-2A。在另一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DQ8/H-2A。在一些 方面，所述嵌合的MHC II a多肽的胞外域包括人a 1和a 2域；在一些方面，所述嵌合MHC 110多肽的胞外域包括人(61和(62域。在一些实施方式中，所述第一核苷酸序列在内源 性小鼠MHC IIa启动子和调节元件的调节控制下（例如，可操作地连接）表达，并且所述 第二核苷酸序列在内源性非人MHC IIP启动子和调节元件的调节控制下（例如，可操作地 连接）表达。在各种实施方式中，所述小鼠不在它们的内源基因座表达功能性内源性MHC II多肽，例如，H-2E和H-2A多肽。在一些方面中，所述小鼠包括含有所述第一和第二核苷 酸序列的MHC II基因座的两个拷贝，而在其它方面，所述小鼠包括含有所述第一和第二核 苷酸序列的MHC II基因座的一个拷贝。
[0021 ] 此外，本发明提供一种小鼠，其在其基因组，例如，在其内源性MHC 11基因座，包括 一个或多个，例如一个、两个、三个、四个编码嵌合人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列。在 一个实施方式中，每种复合物都包括MHC IIa和MHC IIP多肽，并且所述嵌合的MHC IIa 和MHCIIP多肽的人类部分分别包括人MHCIIa和MHCIIP多肽的胞外域，而小鼠部分 分别包括小鼠MHCIIa和MHCIIP多肽的跨膜域和胞质域。因此，所述小鼠可以表达一 种或多种，例如一个、两个、三个、四个嵌合的人/小鼠MHCII复合物。
[0022] 本发明在此还提供了一种制备基因工程非人动物（例如，啮齿动物，例如，小鼠或 大鼠）的方法。在各种实施方式中，本发明的非人动物（例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠） 通过用编码嵌合的人/非人（例如人/小鼠）MHCIIa和P多肽的核苷酸序列取代内源 性MHCII序列而制备。在一个实施方式中，本发明提供一种修饰啮齿动物的MHCII基因座 (例如，小鼠或大鼠）以表达嵌合的人/啮齿动物MHCII复合物的方法，所述复合物包括在 内源性啮齿动物MHCII基因座用编码嵌合的人/啮齿动物MHCII复合物的核苷酸序列取 代编码啮齿动物MHCII复合物的核苷酸序列。在所述方法的一个方面，所述编码嵌合的人 /啮齿动物MHCII复合物的核苷酸序列包括编码人MHCIIa链的胞外域和MHCIIa链 的跨膜域和胞质域的第一核苷酸序列和编码人MHCIIP链的胞外域和啮齿动物MHCIIP 链的跨膜域和胞质域的第二核苷酸序列。在一些方面中，所述嵌合的MHCII复合物的啮齿 动物部分来自小鼠H-2E蛋白并且人类部分来自人HLA-DR4蛋白。在一些方面，所述嵌合的 MHCII复合体的啮齿动物部分来自小鼠H-2E蛋白并且人类部分来自人HLA-DR2蛋白。在 一些方面，所述嵌合的MHCII复合物的啮齿动物部分来自小鼠H-2A蛋白并且人类部分来 自人HLA-DQ2蛋白。在其它方面，所述嵌合的MHCII复合物的啮齿动物部分来自小鼠H-2A 蛋白并且人类部分来自人HLA-DQ8蛋白。在一些实施方式中，本申请描述的所述内源性MHC II基因座的取代发生在单个ES细胞中，并且所述单个ES细胞被引入啮齿动物（例如，小鼠 或大鼠）胚胎，以制备遗传修饰的啮齿动物（例如，小鼠或大鼠）。
[0023] 本发明还提供一种编码嵌合的人/非人MHCII复合物的非人嵌合的MHCII基因 座，其包括编码人MHCIIa链的胞外域和非人MHCIIa链的跨膜域和胞质域的第一核苷 酸序列和编码人MHCIIP链的胞外域和非人MHCIIP链的跨膜域和胞质域的第二核苷 酸序列。在一个方面，所述嵌合的MHCII基因座是在非人类动物的基因组中的内源性MHC II的位置。在一个方面，所述嵌合的MHCII基因座表达嵌合的人/非人（例如，人/啮齿 动物，例如，人/小鼠或人/大鼠）MHCII复合物。在一个实施方式中，所述人MHCII选自 HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP(例如，HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2 和HLA-DQ8)。在一个实施方 式中，所述非人类MHCII是选自H-2A和H-2E的小鼠MHCII。在一个方面，所述嵌合的MHC II基因座可以通过本发明所述的用于产生转基因非人类动物（例如，啮齿动物，例如，小鼠 或大鼠）的任何方法获得。
[0024] 本申请还提供来自本发明所述的非人动物（例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠） 细胞，例如，分离的抗原递呈细胞。本发明还提供了本申请描述的来自非人动物的组织和胚 胎。
[0025] 除非另有明示或者从上下文中是显而易见的，本申请所述的任意实施方式和方面 均可以用于彼此之间组合。通过对随后详细描述的回顾，其他实施方式对本领域技术人员 将是显而易见的。下述的详细描述包括对本发明不同实施方式的示例性表述，其对所主张 本发明不具有限制作用。附图构成本说明书的一部分，其与该描述一起，仅用于说明实施方 式，并非用于限制本发明。
[0026] 附图简述图1是表示在抗原递呈细胞（APC)的表面上MHCII类分子的示意图， 包括四个结构域：a1，a2, 13 1和13 2。灰色的圆圈代表结合在肽结合裂隙的肽。
[0027] 图2是所述人HLA的相对基因组结构的示意图（未按比例），表示I、II和III类 基因。
[0028]图3是所述小鼠MHC的相对基因组结构的示意图（未按比例），表示I、II和III 类基因。
[0029] 图4(A_D)是用于产生靶向载体的策略的示意图（未按比例），所述靶向载体包括 人源化的I-EP和I-Ea(g卩，分别为H-2EP/HLA-DRP1*04 和H-2Ea/HLA-DR*01 嵌合体）。 在图4C中，来自图4B的最终人源化的MHCII序列连接在如图4A的最终构建体的PI-SceI 和I-CeuI限制性位点之间以产生包括人源化MHCII和来自BALB/c的I-Ea的外显子1 的构建体。Pg=假基因；BHR=细菌同源重组；CM=氯霉素；spec=大观霉素；hyg=潮霉 素；neo=新霉素；EP=电穿孔。三角形表示外显子，实心三角形表示来自C57BL/6小鼠的 小鼠外显子（散列三角形除外，它们代表来自BALB/c小鼠的I-Ea的外显子1)和空心三 角形代表人类外显子。
[0030] 图5示出未按比例绘制的MHCII类I-E和I-A基因的示意图，显示了使用潮霉素 表达盒敲除小鼠基因座，接着引入一个包括人源化的I-EP和I-Ea的载体（即，分别为 H-2EP/HLA-DRP1*04和H-2Ea/HLA-DRa*01嵌合体）。空心三角形代表人类外显子；实 心三角形代表小鼠的外显子。用于基因分型的探针用圆圈标出。
[0031] 图6示出未按比例绘制的图5的Cre-介导的去除新霉素表达盒的示意图。空心 三角形代表人类外显子；实心三角形代表小鼠的外显子。顶端两条链代表在人源化的MHC II杂合的小鼠内的MHCII的基因座，所述小鼠具有新霉素表达盒，和底部的两条链代表在 人源化的MHCII杂合的小鼠中的MHCII基因座，所述小鼠已移除新霉素表达盒。
[0032] 图7示出未按比例的小鼠和人II类基因座的示意性对比说明。II类基因由框表 示。各种核酸片段的相对尺寸（kb)均包括在内。
[0033] 图8,在左侧面，是未按比例的用于MHCIIa链的人源化策略的示意图；特别地， 图中显示了对a1和a2域的替换，由MHCIIa基因的外显子2和3编码，同时保持小鼠 跨膜和胞质尾序列。在人源化基因座，所述MHCIIa前导序列来自小鼠BALB