/c菌株。右 侧图显示了MHCII链的人源化；特别地，图中显示了对1和2域的替换，由MHCII0 基因的外显子2和3编码，同时保留了小鼠前导序列和小鼠跨膜和胞质尾序列。上排都是 人类序列；中间一排都是小鼠序列；底部一排都是人源化序列，具有来自人的HLA-DR基因 外显子2和3。
[0034] 图9显示了，用来自针对嵌合的HLA-DR4(移除neo表达盒）（在存在（1681HET+ 聚（I:C)或不存在聚（I:C)的（1681HET)下）杂合的小鼠和野生型小鼠（WT小鼠）的B细 胞的抗HLA-DR抗体的进行的FACS的分析。
[0035] 图10是用于产生人源化MHCII基因的靶向载体的（未按比例）的示意图，具体 地，用于产生的HLA-DQ2. 5/H2-A小鼠的靶向载体（图10A)，用于产生HLA-DQ8. 1/H-2A小鼠 的靶向载体（图10B)，以及用于产生HLA-DR2/H-2E小鼠（图10C)的靶向载体。在图中，除 非另有说明（例如，IoxP基因座等），空心盒状或三角形是人类外显子的序列，双线是人类 内含子序列，实心盒状或三角形是小鼠外显子的序列，单线是小鼠内含子序列，和散列三角 形是来自BALB/c小鼠的I-Ea的外显子。在每个靶向载体图下都指示了连接处序列的位 置并在表1和序列表中列明。
[0036] 图11显示在获取自WT的或杂合的HLA-DQ2. 5/H-2A( "6040Het"）小鼠的CD19+B 细胞上的小鼠H-2A/H-2E(IA/IE)和人类HLA-DQ2. 5的表达。
[0037] 发明详沐
[0038] 定义
[0039] 本发明提供了表达人或人源化的MHCII多肽的基因修饰的非人动物（例如小鼠、 大鼠、家兔等）；包含其的胚胎、细胞和组织；制备其的方法；以及使用其的方法。除非另有 定义，本申请中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在现有技术中已有的含义，除 非存在相反的明确指示或从该术语或短语使用的上下文中是显而易见的。
[0040] 术语"保守的"当用于描述保守的氨基酸取代时，包括氨基酸残基被带有具有相似 化学性质（例如电荷或疏水性）的侧链R基团的其他氨基酸残基取代。可以通过修饰核 苷酸序列实现保守的氨基酸取代，以引入编码保守的取代的核苷酸改变。在通常情况下，保 守的氨基酸取代将基本上不改变目的蛋白的功能性性质，例如MHCII分子递呈目的肽的能 力。带有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬 酰胺和谷氨酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组 氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基 酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨 酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸 取代可以是使用丙氨酸取代蛋白中的任意天然残基，如用在例如丙氨酸扫描诱变中。在一 些实施方式中，Gonnet等（（1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequence Database,Science256:1443-45)披露保守的氨基酸取代使得在PAM250log-似然性矩阵 中具有正值，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度保守的取代，其 中所述取代在PAM250log-似然性矩阵中具有非负值。
[0041] 因此，本发明也包括转基因非人动物，其基因组包括编码人或人源化MHCII多肽 的核苷酸序列，其中所述多肽包括在本申请中所描述的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。
[0042] 本领域技术人员将理解，除了在本申请中所述的编码人或人源化MHCII多肽的核 酸残基，由于遗传密码的简并性，其它核酸可以编码本发明的多肽。因此，除了转基因的非 人类动物外（其基因组中包括用保守的氨基酸取代基编码MHCII多肽的核苷酸序列），本 申请也提供了一种非人动物，由于遗传密码的简并性，其基因组包括不同于本申请中所描 述的核苷酸序列。
[0043] 术语"同一性"当与序列结合使用时包括根据本领域公知的能够用于测定核苷酸 和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在本申请所述的一些实施方式 中，使用开放缺口罚分为10. 〇,延伸缺口罚分为〇. 1的ClustalWV.1.83(slow)比对和使 用Gonnet相似性矩阵（MacVector?10. 0? 2,MacVectorInc.，2008)确定同一性。针对序列 的同一性比较序列的长度将取决于特定的序列。在不同实施方式中，通过从其N-末端至其 C-末端比较成熟蛋白的序列确定其同一性。在不同实施方式中，当将嵌合的人/非人序列 与人序列进行比较时，将所述嵌合的人/非人序列的人部分（而不是非人部分）用于进行 针对确定人序列与嵌合的人/非人序列的人部分之间的同一性水平目的的比较（例如将嵌 合人/小鼠蛋白的人胞外域与人蛋白的人胞外域进行比较）。
[0044] 术语"同源性"或"同源的"涉及序列例如核苷酸或氨基酸序列时指两条序列根据 最佳比对和比较，至少约75%的核苷酸或氨基酸、例如至少约80%的核苷酸或氨基酸、例 如至少约90-95 %的核苷酸或氨基酸、例如超过97 %的核苷酸或氨基酸是一致的。本领域 技术人员将理解对于最佳基因靶向所述靶向构建体应含有与内源性DNA序列具有同源性 的臂（"即同源臂；因此，同源重组可以发生在靶向构建体与被靶向的内源性序列之间。
[0045] 术语"可操作地连接"指并列的，其中这样描述的所述组分与允许其以其意向的方 式发挥功能相关。正因如此，编码蛋白的核酸序列可以与调控序列（例如，启动子、增强子、 沉默子序列等）可操作地连接以保持正确的转录调控。此外，本发明嵌合或人源化蛋白的 不同部分可以可操作地连接以保持合适的折叠、加工、靶向、表达，以及所述蛋白在细胞中 的其他功能性性质。除非另有说明，本发明嵌合或人源化蛋白的不同结构域彼此之间可操 作地连接。
[0046] 如本申请所用的术语"MHCII复合物"，"MHCII蛋白"等，包括MHCIIa多肽 和MHCIIP多肽之间的复合物。如本申请所用的术语"MHCIIa多肽"或"MHCIIP多 肽"（等），分别包括单独的MHCIIa多肽或单独的MHCIIP多肽。类似地，术语"HLA-DR4 复合物"、"HLA-DR4蛋白"、"H-2E复杂"、"H-2E"蛋白，等（例如，指其他MHCII等位基因的 类似的术语），指a和0多肽之间的复合物。典型地，术语"人MHC"和"HLA"可互换使用。
[0047] 关于基因取代的术语"取代"是指在内源基因座放置外源遗传物质，由此以直系同 源的或同源的核酸序列取代所有或一部分的内源基因。如以下实施例中所述，内源性MHC II基因座的核酸序列被包括编码人MHC IIa和0多肽部分的序列的核苷酸序列所取代； 具体地是编码MHC IIa和0多肽的胞外部分的序列。
[0048] 关于功能性多肽，如本申请所用的"功能性"是指一种多肽，其保留通常与天然蛋 白相关联的至少一种生物活性。例如，在本发明的一些实施方式中，在内源基因座（例如， 在内源非人MHCII基因座的取代）的取代导致不能表达功能性内源多肽的基因座。同样， 在本申请中所用的关于蛋白的功能性胞外域的术语"功能性"，是指保留其功能的胞外域， 例如，在MHCII的情况下，能够结合抗原，结合T细胞共同受体的能力等。在本发明的一些 实施方式中，在内源性MHC基因座的取代导致基因座不能表达内源性MHC的胞外域（例如， 功能性胞外域），而表达人MHC的胞外域（例如，功能性的胞外域）。
[0049] 基因修饰的MHCII动物
[0050] 在各个方面，本发明一般提供了基因修饰的非人动物，在其基因组中，其包括编码 人或人源化MHCII复合物的核苷酸序列；因而，所述动物表达人或人源化MHCII复合物 (例如，MHCIIa和0多肽）。
[0051] MHC基因被分为三类：1类，II类和III类，所有这些都是或者在人6号染色体或 者在小鼠17号染色体上编码的。图2和3分别显示了人类和小鼠的MHC类的相对结构的 示意图。多数MHC基因是多态的，实际上它们是小鼠和人基因组的最具多态性的基因。MHC 多态性被假定为在提供进化优势时非常重要；序列变化可导致肽结合的差异，其允许更好 的抗原呈递。一个例外是人HLA-DRa链及其小鼠同源物，Ea(即，H_2Ea)，它们是单态。
[0052] MHC II类复合物包括两个非共价连接的结构域：a链和0链，在本申请中也称作 a多肽和P多肽（图1)。蛋白质跨越细胞膜；因而它包括胞外域、跨膜结构域和胞质域。 所述a链的胞外部分包括a1和a2域并且所述P链的胞外部分包括P1和P2域。所 述a1和0 1域在细胞表面上形成肽结合裂隙。由于MHCII复合物的肽结合裂隙的三维 构型，理论上结合抗原的长度没有上限，但通常由MHCII递呈的肽在长度上介于13和17 个氨基酸之间。
[0053] 除了其与抗原肽相互作用，所述MHCII分子的肽结合裂隙与不变链（Ii)在MHC II复合物形成和肽获得过程中相互作用。所述a/PMHCII二聚体在内质网中组装并且和 Ii链结合，所述Ii链是负责控制肽结合和将MHCII靶向到内吞途径。在核内体中，Ii经 历蛋白水解，并且Ii的小片段，与II类结合的不变链肽（CLIP)，保留在肽结合裂隙处。在 核内体中，在HLA-DM(在人类中）的控制下，CLIP被抗原肽所替换。
[0054] MHCII与T细胞的共受体⑶4在a2和2域之间的连接处的疏水裂缝处相互作 用。WangandReinherz(2002)StructuralBasisofTCellRecognitionofPeptides BoundtoMHCMolecules，MolecularImmunology, 38:1039-49?当CD4 和T细胞受体与 和肽复合的相同的MHCII分子结合时，T细胞对抗原的灵敏度提高，并且它只需要低100 倍的抗原来激活。参见Janeway'sImmunobiology, 7thEd.,Murphyetal.eds.，Garland Science, 2008,其通过引用并入本申请。
[0055] 已经提出了MHCII类分子的跨膜和胞质域的大量功能。胞质域已被证明对细 胞内信号，运输到细胞膜，并且最终的抗原递呈十分重要。例如，T细胞杂交瘤对用在胞质 域处截断的MHCIIP链转染的抗原递呈细胞（APCs)的响应很低，并且B细胞分化的诱 导受到阻碍。参见，例如，Smileyetal. (1996)Truncationoftheclass110-chain cytoplasmicdomaininfluencesthelevelofclassII/invariantchain-derived peptidecomplexes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:241-44.II类分子的截断似乎削弱了 cAMP产生。已经假定缺失MHCII的胞质尾影响细胞内运输，从而阻止了复合物通过内吞 途径时与相关抗原相遇。Smiley等（同上）的研究表明，II类分子在胞质域的截断减少 CLIP/II类复合物的数量，假设这会影响CLIP的有效调节抗原呈递的能力。
[0056] 据推测，由于MHCII群集对T细胞受体（TCR)的触发十分重要，如果在胞质域处 截断的MHCII类分子不能与细胞骨架结合并从而聚集，则对T细胞的抗原呈递会受到影 口向。Ostrand-Rosenbergetal. (1991)AbrogationofTumorigenicitybyMHCClassII AntigenExpressionRequirestheCytoplasmicDomainoftheClassIIMolecule,J. Immunol. 147:2419-22。事实上，最近表明，在胞质域处截断的HLA-DR未能在低聚反应 后与细胞骨架相结合。ElFakhyetal. (2004)DelineationoftheHLA-DRRegion andtheResiduesInvolvedintheAssociationwiththeCytoskeleton,J.Biol. Chem. 279:18472-80。重要的是，肌动蛋白细胞骨架是会影响抗原呈递局部信号转导活性 的位点。除了与细胞骨架结合，最近的研究还表明，高达20%的HLA-DR分子构成性地驻留 在APCs的脂筏中，它们是富集胆固醇和鞘糖脂的微区，而且这样的定位对抗原呈递、免疫 突触的形成，以及MHCII-介导信号转导很重要。参见，例如，Dolan等.（2004)Invariant ChainandtheMHCIICytoplasmicDomainsRegulateLocalizationofMHCClassII MoleculestoLipidRaftsinTumorCell-BasedVaccines,J.Immunol. 172:907-14. Dolan等提示了MHCII的胞质域截断减少了MHCII向脂筏构成性地定位。
[0057] 另外，MHCII的胞质域，特别是链，包括通过泛素连接酶（膜结合的RING-CH I(MARCHI))发生泛素化的亮氨酸残基，所述MARCH控制内吞运输、内化和MHCII的降 解；并且已经证明，MARCH介导的泛素化因树突细胞成熟而停止后导致MHCII的水平在 细胞膜增加。Shinetal. (2006)SurfaceexpressionofMHCclassIIindendritic cellsiscontrolledbyregulatedubiquitination,Nature444:115-18；DeGassart etal. (2008)MHCclassIIstabilizationatthesurfaceofhumandendriticcells istheresultofmaturation-dependentMARCHIdown-regulation,Proc.Natl.Acad. Sci.USA105:3491-96.
[0058] MHCII的a和链的跨膜域彼此相互作用并且该相互作用对II类MHC复合 物的正确组装很重要。CossonandBonifacino(1992)RoleofTransmembraneDomain InteractionsintheAssemblyofClassIIMHCMolecules,Nature258:659-62?事实 上，如果MHCII类分子的a和链的跨膜域被IL-2受体的a链取代，则MHCII类分子 被留在ER，并且在细胞表面几乎检测不到。同上。通过诱变研究，在a和P跨膜域的保守 Gly残基被认为是负责在细胞表面的MHCII组装。同上。因此，跨膜和胞质域两者对MHC II复合物的正常功能是至关重要的。
[0059] 在各种实施方式中，本发明提供了一种转基因非人类动物（例如，小鼠、大鼠、兔 等），在其基因组中包括编码人或人源化MHCII复合物的核苷酸序列，例如，人或人源化 MHCIIa和/或0多肽。非人动物可以在其基因组中包括编码部分人和部分非人（例如， 表达嵌合的人/非人MHCII复合物的非人动物（例如，表达嵌合人/非人MHCIIa和0 多肽的非人动物））的MHCII复合物的核苷酸序列。在一个方面，所述非人动物只表达人或 人源化MHCII复合物，例如，嵌合的人/非人MHCII复合物，并不表达来自内源性MHCII 基因座的内源非人MHCII复合物。在一些实施方式中，所述动物不能表达来自内源性MHC II基因座的任何内源非人MHCII复合物，但只表达人或人源化MHCII复合物。在其他实 施方式中，所述动物保留编码功能性的内源小鼠MHCII多肽的核苷酸序列。在各种实施方 式中，转基因的非人类动物（例如，小鼠、大鼠、兔等）在其种系中包括编码人或人源化MHC II复合物的核苷酸序列，例如，人或人源化MHCIIa和/或0多肽。
[0060] 在一个实施方式中，本申请提供的一种非人动物，例如，啮齿动物，例如，大鼠或小 鼠，在其基因组中包括，例如，在内源性非人类MHCII基因座，编码人类MHCII多肽的核苷 酸序列。在另一个实施方式中，本申请提供了非人动物，例如，啮齿动物，例如，大鼠或小鼠， 在其基因组中包括，例如，在内源性MHCII基因座，编码嵌合的人/非人类MHCII多肽的 核苷酸序列。因此，本申请中还提供了 一种非人动物，在其基因组中包括，例如，在内源性非 人类MHCII基因座，编码人或嵌合的人/非人MHCII复合物的核苷酸序列。
[0061] 在一个方面，本申请提供了一种嵌合的人/非人MHCII复合物。在一个实施方式 中，所述嵌合的人/非人MHCII复合物包括嵌合的人/非人MHCIIa多肽和嵌合的人/ 非人MHCIIP多肽。在一个方面，嵌合的MHCIIa多肽的人类部分和/或嵌合MHCIIP 多肽的人类部分分别包括人MHCIIa多肽和/或人MHCIIP多肽的肽结合结构域。在一 个方面，所述嵌合的MHCIIa和/或0多肽的人类部分分别包括人MHCIIa和/或P 多肽的胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合的MHCIIa多肽的人类部分包括人MHCIIa 多肽a1域；在另一个实施方式中，所述嵌合的MHCIIa多肽的人类部分包括人MHCIIa 多肽的a1和a2域。在其它的实施方式中，所述嵌合的MHCIIP多肽的人类部分包括人 MHCIIP多肽的0 1域；在另一个实施方式中，所述嵌合的MHCIIP多肽的人类部分包括 人MHCII0多肽的M和0 2域。
[0062] 本申请描述的所述MHCIIa和多肽的人类部分可以通过HLA-DP，-DQ和-DR 基因座的任意一个来编码。在Shankarkumaretal. ((2004)TheHumanLeukocyte Antigen(HLA)System,Int.J.Hum.Genet. 4 (2) : 91-103)中描述了常用的HLA抗原和等位基 因的列表，通过引用并入本申请。Shankarkumar等也给出了应用于本领域的HLA命名的简 要说明。关于HLA命名法和各种HLA等位基因的其他信息可以在Holdsworth等.（2009) TheHLAdictionary2008:asummaryofHLA-A,-B,-C,-DRB1/3/4/5,andDQBlalleles andtheirassociationwithserologicallydefinedHLA-A,_B, _C,-DR,and-DQ antigens,TissueAntigens73:95-170,以及最近的更新Marsh等.（2010)Nomenclature forfactorsoftheHLAsystem, 2010,TissueAntigens75:291-455 中找到，二者通过引 用并入本申请。因此，人类的或人源化MHCII多肽可以来自本申请所描述的任何功能性人 HLA分子。
[0063] 在一个特定方面，本申请中所描述人源化MHCII复合物的人类部分是来自于人的 HLA-DR，例如，HLA-DR4或HLA-DR2。通常地，HLA-DRa链是单形态的，例如，HLA-DR复合物 的a链由HLA-DRA基因（例如，HLA-DRa1*01基因）编码。另一方面，所述HLA-DRP链是 多态的。因此，HLA-DR4包括由HLA-DRA基因编码的a链和由HLA-DRBl基因编码的P链 (例如，HLA-DRP1*04基因）。如下文所述，HLA-DR4是已知与众多自身免疫性疾病，例如， 风湿性关节炎，I型糖尿病，多发性硬化症等的发病率相关。HLA-DR2包括由HLA-DRA基因 编码的a链和由HLA-DRBl基因（如HLA-DRP1*02基因）编码的P链。HLA-DR2是已知 与众多疾病，例如，肺出血肾炎综合征，多发性硬化症等相关联。在本发明的一个实施方式 中，所述HLA-DRA等位基因为HLA-DRa*〇1等位基因，例如，HLA-DRa*01:01:01:01。在另 一个实施方式中，所述HLA-DRB等位基因为HLA-DRP1*04,例如，HLA-DRP1*04:01:01。在 另一个实施方式中，所述HLA-DRB等位基因是HLA-DRM*02，例如，HLA-DR 1501。
[0064] 在另一【具体实施方式】中，本申请描述的人源化MHCII复合物的人的部分是来自于 人HLA-DQ，例如，HLA-DQ2 和HLA-DQ8。HLA-DQ2 包括由HLA-DQA基因（例如，HLA-DQa1*05 基因）编码的a链。在一个实施方式中，HLA-DQa1*05基因是HLA-DQa1*0501。HLA-DQ2 还包括由HLA-DQB基因（例如，HLA-DQP1*02基因）编码的P链。HLA-DQ8包括由HLA-DQA 基因（例如，HLA-DQa1*0301基因）编码的a链。HLA-DQ8还包括由HLA-DQB基因（例 如，HLA-DQP1*0302基因）编码的P链。HLA-DQ2. 5和HLA-DQ8等位基因已知与此类疾病 如腹腔疾病和I型糖尿病相关。
[0065] 虽然