活化淋巴细胞特异性的检测方法

专利名称：活化淋巴细胞特异性的检测方法
技术领域：
本发明涉及同种异体或异种器官移植后，或机体受病毒、细菌如结核杆菌感染或接种各种疫苗后，检测体内活化淋巴细胞的特异性的方法。

背景技术：
免疫(immune)或免疫性(immunity)是生物识别和清除抗原性异物的一种生理性反应。引起免疫的抗原物质大多不是生物体自身的，而是外源性物质，它们进入生物体后能被机体的免疫系统迅速识别，并通过一系列免疫应答过程予以消灭，使机体恢复原来的平衡状态。
在进行器官移植时，供受体间的抗原性差异如主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen MHC)和次要组织相容性抗原(mH-antigen)的不同，就可刺激受体产生针对供体器官存在的与受体不同的抗原的特异性活化淋巴细胞，这些特异性活化淋巴细胞就会攻击供体器官产生排斥反应。当机体受病原微生物感染，如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型及庚型肝炎病毒、水痘和带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、冠状病毒、轮状病毒、柯萨基病毒、埃可病毒(ECHO)、埃博拉病毒、黄热病毒、腺病毒、森林脑炎病毒、风疹病毒、登革热病毒、流行性乙型脑炎病毒、狂犬病毒、SARS病毒、流行性感冒病毒(包括人、禽)流行性腮腺炎病毒、出血热病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、立克次体、流行性脑炎双球菌、伤寒或副伤寒杆菌、结核杆菌、白喉杆菌、百日咳杆菌、炭疽杆菌、布氏杆菌、鼠疫耶尔森菌、麻疯杆菌、非典型分枝杆菌、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、回归热螺旋体、衣原体、支原体、隐孢子虫、利什曼原虫、弓形虫、日本血吸虫、并殖吸虫、华支睾吸虫、姜片虫、丝虫、等感染时同样会刺激机体产生分别针对各种病原微生物的特异性活化淋巴细胞；在同一个机体中可能同时存在多种特异性的、分别针对多种不同抗原的活化淋巴细胞，如一个心脏移植后出现排斥反应的患者感染了疱疹病毒，那么在该患者体内，即有特异性针对供体器官主要组织相容性或次要组织相容性抗原的活化淋巴细胞，又有特异性针对疱疹病毒的活化淋巴细胞存在。
器官移植是治疗许多器官终末期疾病的唯一方法。在器官移植后，供受体间MHC和mH抗原的差异将引起排斥反应，排斥反应仍是目前影响心、肝、肾、骨髓等器官或细胞移植后，3年、5年、10年存活率的主要因素，而排斥反应的发生首先开始于淋巴细胞的活化。如果受者体内出现抗供体特异性活化淋巴细胞，则预示着机体可能启动了攻击供体器官的反应，提示人们尽早采取针对性的措施，如增加免疫抑制剂剂量或更换免疫抑制剂种类等，从而使供体器官在受体体内保持一个良好的功能状态，进而提高移植受者的生存质量和生存期限。
目前活检穿刺仍是世界上各移植中心诊断排斥反应的根本方法和唯一标准，但由于活检穿刺本身具有一定的危险性，不宜多做，而且费用昂贵，病人比较痛苦，不易为医生和病人所接受。而且一个移植器官如心、肝、肾等，即使发生排斥反应，其病变也不是均一的，而是有的部位有、有的部位无，有的轻、有的重。活检穿刺只能从器官的局部取材，容易误诊；另外活检病理观察，主要是看病理学改变，一旦出现病理学改变，也就表明器官已经受到了损害；为建立一个方便、快速、敏感的非侵入性的器官移植排斥反应诊断方法，国内外研究者做了大量工作，尝试了很多方法和标志物，结果均不理想。所以，提供一个方便、快速、准确、敏感的排斥反应非侵入性诊断方法，对提高移植患者的生存质量和延长移植器官的使用期限，具有重要意义；而且排斥反应的发生首先开始于淋巴细胞的活化，活化淋巴细胞的出现应早于病理改变。本发明主要是通过检测外周血中被MHC或mH抗原活化的特异性淋巴细胞来诊断排斥反应，所以本方法对排斥反应的诊断应早于移植器官的病理改变。另外，本方法简便易行，可自动操作，易标准化，克服了上述活检穿刺方法的缺陷，能对诊断排斥反应提供快速、准确、清楚的测试结果。所以该方法的应用对指导临床调整免疫抑制剂用量，延长移植物存活期限，提高移植患者生存质量，将会有极为重要的意义。
在病原微生物感染方面，如乙脑病毒、麻疹病毒、水痘病毒、结核杆菌等许多感染性疾病均有一个潜伏期，在这期间及发病早期大多只表现为非特异症状如发热等，无特异性表现，而这些疾病的诊断常常依赖于该病典型临床症状(特异性表现)的出现，但典型症状出现一般较晚；有些甚至一直没有典型症状，常导致误诊，延误病情，引起严重后果。
本发明应用在病原微生物感染诊断方面，可提供一个能在潜伏期或发病早期快速准确进行确诊的方法，对各种传染病早发现、早隔离、早治疗，避免传染和流行，也将具有重要意义。


发明内容
本发明适用于检测任何抗原刺激机体所产生的活化淋巴细胞的特异性。
本发明所使用的抗原为同种异体抗原，异种抗原或各种病原微生物的抗原。同种异体抗原或异种抗原样品可以是一种抗原也可以是来自一个个体或多个个体的混合抗原，其存在形式可以是以颗粒抗原的形式存在于人或动物细胞膜上或存在于霉菌、细菌的细胞膜或细胞壁上或存在于病毒包膜或衣壳上。也可以是以可溶性抗原的形式溶解在溶液中。
同种异体抗原是等位基因的直接或间接产物，该等位基因的产物可作为抗原被同一物种的另一成员所识别。该等位基因的产物不但有多肽，而且还有特异多糖和由等位基因编码的酶合成的脂类。本发明中所用的同种异体抗原属组织相容性抗原，包括主要组织相容性抗原(MHC)(在人类称为“HLA”，猪称为“SLA”，猴称为“MAMU”，黄狒狒为“PACY”，小鼠的为H2抗原，大鼠的为RT1抗原等)和次要组织相容性抗原(mH-antigen)两组。
异种抗原是指两物种间一物种具有而另一物种所不具有的、能被另一物种识别产生免疫应答的物质，如多肽、特异性多糖，脂类等。如将猪器官对人、猴、狒狒、黑猩猩等移植时，猪体内所具有而人、猴、狒狒、黑猩猩等体内所不具有的上述物质即为异种抗原。
病原微生物抗原可以是一种细菌或病毒的某一个特异性抗原，也可以是这种细菌或病毒的混合抗原(每一种细菌或病毒都表达许多种抗原)，其存在形式可以是经非离子去垢剂、脂溶剂或10％甲醛处理的细菌或病毒颗粒，也可以把细菌或病毒抗原表达在人或动物细胞株的细胞膜上，还可以是以可溶性抗原的形式溶解于溶液中。
本发明中的目的抗原是指被检测者体内可能含有其特异性活化淋巴细胞的、通过检测希望证实或排除的检测用抗原。
本发明中的无关抗原是指在被检测者体内不可能含有其特异性活化淋巴细胞，在检测中作为阴性对照的抗原。无关抗原根据检测目的不同而不同，可另外添加，也可在一个检测板内相互作为阴性对照抗原。
本发明所使用的抗原可以是颗粒性抗原，如携带某个或某些人类HLA抗原的细胞、细菌或病毒，或携带某个病毒或细菌抗原的细胞、细菌或病毒等；也可以是可溶性抗原，如同种异体或异种抗原分子或某个病毒或细菌的某个特异性蛋白分子。
本发明所使用的抗原可以是一种同种异体或异种抗原分子，也可以是多种或人类全部HLA及mH抗原分子的混合物；是一种病毒或细菌的特异性抗原，也可以是几种病毒或细菌的混合抗原。用单一抗原和混合抗原的区别在于结果提示诊断的精确性不同，如用同种异体抗原的混合抗原做检测，其阳性结果只能提示有同种异体抗原特异性活化的淋巴细胞，即机体已启动了攻击供体器官的排斥反应，而不能确定是哪一个抗原诱导了淋巴细胞的活化从而引起了排斥反应；而用各个单一抗原制成包含人类全部HLA和mH抗原的检测板检测，其结果阳性则可明确告诉我们机体中的活化淋巴细胞是由哪一个或哪几个同种异体抗原诱导活化的；对于病毒或细菌感染性疾病的诊断也是一样，如用呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒、流感病毒副流感病毒、麻疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒等的混合抗原检测，结果阳性，我们只能说患者被上述病毒中的一些病原体感染了而不能确定已被哪一种病毒感染的，而用单一某个病毒特异性的蛋白作抗原或相对单一地用某个病毒作抗原则可以确定是哪一种病毒感染。
本发明中所使用的抗原可通过如下方法得到 1.选定已配型器官移植受者多人，使这些人外周血B细胞膜上的HLA抗原组合包含人类全部的HLA-I类和II类抗原及其mH抗原。然后取这些人的外周血0.5ml放入含适量细胞培养基(如含10％新生牛或胎牛血清(GIBCO公司)的1640(GIBCO公司)或DMEM(GIBCO公司)或Eagle(GIBCO公司)培养基)的细胞培养瓶中，同时在各培养瓶中加入适量B958细胞株(ATCC公司有售)的细胞培养上清(该细胞株在培养过程中能产生EB病毒释放入培养液中)，其量以其所含EB病毒足以转化移植受者0.5ml外周血中的全部B细胞为其合适的量(一般每毫升50万个B958细胞培养三天后的上清约5-10ml即可)，然后把细胞培养瓶放37℃CO2孵箱中培养15天左右，每隔5天加培养液5-10ml，其培养时间长短以观察到培养瓶中出现呈团状悬浮生长的瘤细胞为准。出现团状悬浮生长的瘤细胞后，即可象培养普通细胞一样换液进行常规细胞培养，只是要求所有接触过这些细胞及B958细胞的物品及培养上清均要煮沸消毒，以杀灭EB病毒——虽然EB病毒分布很广，正常人鼻咽腔等部位都可有EB病毒存在，但这一步消毒仍是必须的预防措施。以上这些受者的外周血经上述处理就可建立各自的B细胞株，把这些细胞株通过克隆化、扩增培养、按常规细胞冻存保种、即可建立他们各自固定表达某几个HLA抗原或/和mH抗原的细胞系。
2.含人类HLA和mH抗原的细胞株还可通过以下基因工程方法得到选择一不表达人HLA或/和mH抗原的人类细胞株如U937(ATCC公司有售)、K562(ATCC公司有售)等作为抗原载体，通过分子生物学常规技术分别提取上述所选定的受者的外周血白细胞中的mRNA，通过反转录PCR扩增、剪切、拼接等常规基因工程技术构建分别能表达各种HLA抗原的表达载体，然后把这些表达载体转入U937或K562或其它不表达人HLA和mH抗原的细胞中令其表达，建立分别能表达各种HLA抗原的细胞株，即对人类全部HLA抗原分别进行表达，对每个HLA抗原都各自建立一个表达细胞株，使每个细胞株只表达一种HLA抗原，通过建立一百多个细胞株使它们包含人类全部的HLA抗原，把这些表达HLA抗原的细胞株，分别通过克隆化、细胞培养扩增，常规冻存保种。即可建立分别固定表达某个人类HLA或mH抗原的细胞系。
3.含人类HLA和mH抗原的细胞株还可通过以下方法得到 3.1选择已知表达或不表达人HLA或/和mH抗原的人类细胞株如Raji(ATCC公司有售)、U937(ATCC公司有售)、K562(ATCC公司有售)等作为瘤细胞株；选择某已知HLA抗原的人的外周血B细胞，参考文献(Abe等.J Immunol Methods，90111-123)，《体外培养的原理与技术》(薛庆善主编，科学出版社出版，2001年第一版)，《SELECTED METHODS INCELLUAR IMMUNOLOGY》(Edited by Barbara B.Mishell and Stanley M.Shiigi W.H.Freeman and Company，San Francisco，1980)和《简明免疫学技术》(朱正美 刘辉 主编科学出版社出版，2002年7月第一版)，添加一些细菌脂多糖(LPS)(SIGMA)(培养液中终浓度为2-25μg/ml)、用B细胞生长因子(BCGF)(自制，见3.2)、抗人IgM(Sigma公司)、美洲商陆(PWM)(Sigma公司)(培养液中终浓度为1-25μg/ml)和葡萄球菌A蛋白(Si gma公司)(培养液中终浓度为1/1000-1/10000)共同培养2-3周，然后参考《单克隆抗体技术》(徐志凯主编，陕西科学技术出版社出版，1992年1月第一版)，把Raji、U937或K562细胞与上述选择的、已经B细胞生长因子(BCGF)、抗人IgM、葡萄球菌A蛋白、细菌脂多糖和美洲商陆(PWM)刺激2-3周的、已知HLA抗原的人的单个核细胞进行融合，即可得到永生的、固定表达某几个HLA抗原的细胞株。通过该方法，即可得到表达各种不同组合HLA抗原的细胞株。从而就可建立各种细胞株，并使这些细胞株包含人类几乎全部的HLA抗原。
3.2建立B细胞株 1)制备含BCGF的培养上清液用含1％FCS(GIBCO公司)的RPMI 1640细胞培养液将淋巴细胞配成密度为2×106个/ml的悬液。加PHA(SIGMA公司产品)至终浓度2μg/ml，装入培养瓶。置饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养3~4天。收集培养物于离心管中，于4℃下以1500r/min离心10min。收集上清液，即为粗制BCGF。于-20℃保存。
2)淋巴细胞制备抽取已知HLA抗原患者的外周血，肝素(Sigma公司)抗凝，用淋巴细胞分离液(Sigma公司)分离其单个核细胞，用10％FCS的RPMI 1640培养液(GIBCO公司)配成密度为1×106个/ml的细胞悬液，放细胞培养瓶中培养4-8小时，晃动细胞培养瓶使细胞悬起，倒入离心管中1000r/min离心10min，沉淀为纯化的淋巴细胞。
3)用含10％FCS的RPM I1640培养液将淋巴细胞配成密度为1×106个/ml的悬液。加入抗人IgM F(ab)2片段(Sigma公司)至终浓度为20μg/ml、粗制BCGF至终浓度为10％和细菌脂多糖(LPS)(SIGMA公司产品、培养液中终浓度为2-25μg/ml)。
4)在24孔板中，每孔加细胞悬液1ml，置37度CO2培养箱中培养。每3~4d半量换液1次，即先从每孔中吸出0.5ml培养上清液弃去，再加入含20μg/ml抗人IgM F(ab)2、10％粗制BCGF和培养液中终浓度为2-25μg/ml细菌脂多糖(LPS)的新鲜培养液。培养约3~5周，当生长克隆较大时，将细胞转移至培养瓶中培养。即为建立的、含已知HLA抗原的B细胞株。
5)通过该方法既可制备 表达各种不同HLA抗原的B细胞株。并使这些细胞株包含人类几乎全部的HLA抗原。
4.含人类HLA抗原及mH抗原的细胞株还可通过下列方法得到，在人群中选择一些不与其它人有相同HLA抗原或在十几个HLA抗原中与其它人相同HLA抗原较少的个体，提取其外周血，按方法1的方法建立这些个体的B细胞株，然后以这些细胞株为载体，通过基因工程的方法(如方法2的方法)，把这些细胞株上未能包含的一些HLA或mH抗原也在这些细胞株上表达出来，从而使用较少的细胞株携带尽可能多的HLA抗原，最后达到用尽量少的细胞株表达出人类全部的HLA抗原和mH抗原。另外，按这一思路，选择表达HLA-II类抗原较多的Raji细胞株(ATCC公司有售)或Dandi细胞株(ATCC公司有售)作为抗原载体，只需建几个细胞株就可使细胞表面包含人类目前发现的全部18个DR抗原。
5.把通过上述方法或通过其它方法如直接从人或动物脾脏或外周血得到的表达人类全部HLA抗原的细胞或细胞株(培养、扩增后)，混合或分别用无菌双蒸水37℃温育0.5～2h，使细胞充分破碎，然后用低温高速离心机3000g～10000g 20分钟离心沉淀细胞膜，倒掉上清，把沉淀冻干备用，使用时用细胞培养基稀释即可得到单一的或混合的HLA颗粒抗原，实际上是脂质体上携带HLA抗原，其稀释浓度视实验要求而定。
6.本发明所使用的HLA抗原除上述的颗粒抗原外还可以是可溶性抗原，这些抗原可以通过如下方式得到方法2所构建的HLA抗原表达载体可以在培养的人细胞中表达也可以在原核细胞或其它真核细胞(如酵母菌)中表达，不论以什么方式表达的HLA抗原均可经10％甲醛固定洗涤后直接作为抗原使用，也可通过常规亲和层析方法(如用抗β2微球蛋白抗体、抗HLA一类抗原或二类抗原单态抗体制备亲和层析柱)或其它蛋白纯化技术进行纯化，得到HLA抗原分子纯品进行下一步实验用。
7.病原微生物特异性抗原的制备各种病原体如麻疹病毒、水痘病毒、结核杆菌等均可参考《体外培养的原理与技术》(薛庆善主编，科学出版社出版，2001年第一版)；《诊断与实验病毒学》(郑州大学出版社出版，2002年第一版，杨占秋、刘建军、肖红、丁晓华主编)；《医用实验病毒学》(杜平主编，人民军艺出版社出版，1985年第一版)；参考《现代结核病学》(人民军医出版社，2000年第一版，张敦熔主编)等资料，按各种微生物各自不同的生长繁殖特点在动物体内或体外培养，并按它们各自不同的方法使之纯化，从而得到这些病原体的纯品或相对纯品，这些相对纯化的病原体经用60CO照射、0.1-10％甲醛、戊二醛、非离子去垢剂或脂溶剂如乙醚、氯仿处理等方法使之灭活后即可作为抗原使用。各种病原微生物的特异性抗原还可以是通过基因工程表达的这些病原微生物的特异性抗原，这些抗原可以表达在人类或动物细胞上也可以表达在原核或真核细胞上，这些细胞可以直接作抗原用也可通过亲和层析或其它蛋白纯化技术把这些病原微生物特异性抗原纯化后使用。
8.本发明所使用的抗原还可以是异种抗原，如人类异种移植的合适供体猪(包括各种转基因猪，近交系猪等)的抗原，或小鼠抗原、大鼠抗原、豚鼠抗原等，其抗原也可用上述方法建立它们各自的细胞系，从而作为异种移植时的检测抗原。
本发明所使用抗原范围较广，所有外来的、能引起机体淋巴细胞特异性活化的物质均可用作本发明的抗原，从而检测机体是否存在被这些抗原特异性活化的淋巴细胞。
通过上述方法或其它方法得到的单一的或混合的抗原，颗粒性抗原或可溶性抗原，同种异体抗原或异种抗原，人类HLA抗原或小鼠、大鼠、猪等动物抗原或细菌、病毒等病原微生物抗原及人类使用的各种疫苗抗原，只要是能引起机体特异性淋巴细胞活化的抗原均可作为检测抗原，用以检测机体内是否存在抗原相应的特异性活化淋巴细胞。
通过上述方法得到的，表达在人类或动物细胞上的抗原或表达在细菌细胞壁或病毒包膜或衣壳上的抗原，需经丝裂霉素或经过0.1-10％甲醛或非离子去垢剂及脂溶剂如丙酮、二甲苯、氯仿等处理灭活后尚可作为检测抗原使用，特殊情况下亦可不经处理直接使用。经亲合层析或其它蛋白质纯化方法得到的较纯的纯化蛋白质抗原(可溶性抗原)及脂质体上吸附的目的抗原可直接作为检测抗原使用。
经无菌操作得到上述各种抗原后，即可把这些抗原分别或混合搭配(根据不同目的进行各种搭配)后，与用常规淋巴细胞分离液分离单个核细胞的方法得到的机体外周血单个核细胞一起培养。其稀释单个核细胞及抗原的培养液中，除常规细胞培养时需添加的小牛或胎牛血清(也可用商品化的无血清细胞培养液培养)外还需添加免疫抑制剂和/或抗癌药和细胞因子活性中和抗体和/或细胞增殖抑制性细胞因子。这些免疫抑制剂和抗癌药包括普乐可复(FK506)、环孢素系列如环孢霉素A、C、环磷酰胺、硫唑嘌呤、雷帕霉素、RS-61443(mycophenolate mofetil，MM，分子式为C24H11NCLO7)(是霉酚酸mycophenolicacid，MPA(分子式为C17H11O6)的一种酯类衍生物)、BQR(6-氟-2-3甲基-4-喹啉酸)、脱氧精胍菌素、人急性T淋巴细胞白血病细胞株JM分泌的免疫抑制因子、肾上腺皮质激素(如甲基强的松龙、强的松、氢化可的松、地塞米松等)、拓扑酶抑制剂[如喜树碱(CAM)、依托泊甙(VP-16)]、烷化剂[如顺铂、氮芥、美法兰、本丁酸氮芥、卡氮芥等]，抗代谢药[甲氨蝶呤、阿糖胞苷、胸苷酸合成酶抑制剂双氮四氢叶酸等]，维甲类化合物-维生素A衍生物[如全反式维甲酸、棕榈酸视黄质、4-N-羟基苯维甲氨]及其它一些潜在的具有诱导免疫抑制作用或诱导肿瘤细胞凋亡作用的药物。前面所述各种抗原的作用在于抑制其特异性活化淋巴细胞的活性或诱导其特异性活化淋巴细胞的凋亡，后面所述这些药物的作用在于使实验结果稳定、准确、敏感、阴阳性结果对比明显。
培养液中各种免疫抑制剂和抗癌药的使用剂量不尽相同，需根据各药的特点及生产厂家不同调整控制它们的浓度，一般在它们的说明书中最低血药维持浓度(谷值)的上下1000倍左右(其剂量范围大致为 0.001ng-100μg/ml)，如FK506的剂量范围为0.001ng-10μg/ml(最适使用范围0.01ng-100ng/ml)，环孢霉素A的剂量范围为0.01ng-10μg/ml(最适使用范围0.1ng-1μg/ml)，其使用浓度以该药能达到使检查结果，重复性好的最低浓度为其合适浓度。免疫抑制剂或抗癌药的选用，可根据情况选其中的一种单独使用或几种混合应用。
对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子的中和抗体，包括白介素1、2、4、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，干扰素(-α、β、w、γ)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)等所有对淋巴细胞、单核细胞等单个核细胞具有促进活化和增殖作用的细胞因子的中和抗体，及一些对淋巴细胞、单核细胞等单个核细胞具有诱导凋亡、抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)、干扰素γ、肿瘤坏死因子(TNF)等。
中和抗体这里是指对细胞因子生物学活性具有抑制作用的抗体。其意义在于对一些具有刺激细胞活化增殖作用的细胞因子的生物学活性进行抑制，使其不能发挥生物学作用。
这些中和抗体和抑制性细胞因子的作用在于协助特异性抗原对特异性活化淋巴细胞诱导特异性抑制，即和特异性抗原共同作用可抑制抗原特异性活化淋巴细胞及单核细胞等的细胞活性，由于不同细胞因子在其中的作用不同，不同单位生产的同一细胞因子或细胞因子中和抗体的活性单位或效价不同等原因，其培养液中的中和抗体的终浓度差别也很大，可在1μg～10mg/ml之间的任一浓度，以使检测结果最敏感、重复性最好时的浓度为其合适的浓度；抑制性细胞因子使用浓度以其活性单位计算，一般终浓度应在0.01～1000个活性单位/ml，(常常在0.1-50个活性单位/ml)，以使检测结果达到最敏感、准确时的浓度为其合适浓度。
上述免疫抑制剂、细胞因子活性中和抗体及具有抑制淋巴细胞或单核细胞活性的细胞因子种类均较多，其作用也较复杂，检测时可选择其中的一种或几种搭配使用，其各种组合不受限制，以能使检测敏感、准确、重复性好为标准。
上述通过各种方法得到的目的抗原、无关对照抗原及用淋巴细胞分离液分离的单个核细胞，用含合适浓度合理搭配的免疫抑制剂和抗癌药、细胞因子中和抗体或/和抑制性细胞因子的细胞培养液稀释至合适的浓度。
用携带目的抗原的细胞作抗原时，如方法1、2、3、4得到的抗原，抗原细胞的浓度约为0.01～10×106/ml，被检者单个核细胞浓度约为0.1-5×106/ml，优选前者为1-2×106/ml左右，后者为1-3×106/ml左右。若为可溶性纯化抗原，其特异性目的抗原的浓度(不包括非特异性蛋白)，约为0.1μg/ml-10mg/ml。方法5所得到的抗原的使用浓度，约为0.1-100×106个细胞破碎后的细胞膜稀释至1ml使用液，一般为1-10×106个细胞的细胞膜抗原稀释至1ml。方法6、7所得到的抗原一般以目的抗原计算，使用液配为0.1μg-10mg/ml。
把上述稀释至合适浓度的目的抗原和无关阴性对照抗原分别与待检的单个核细胞样品，滴入合适的细胞培养板中混合培养，每孔加抗原和待检细胞各100μl，放37℃的CO2孵箱内培养，在本发明方法所提供的细胞培养环境中，待检样品中的活化淋巴细胞在遇到其特异性抗原时，这些活化淋巴细胞的活性将被明显抑制，在细胞培养5～72小时，一般为24小时后对试验孔和无关抗原对照孔及不加抗原的单独待检单个核细胞孔的细胞活性进行检测，根据各孔细胞活性的变化，即可判定待检单个核细胞中有无已知抗原对应的活化淋巴细胞。其细胞活性的检测方法有两种，一种是直接法，一种是间接法前一种是直接给各孔添加某种物质，根据各孔细胞对这种物质的清除能力(阻止该物质如伊红、台盼兰、曙红进入细胞内的能力)或转化能力(如转化可溶性MTT为甲

类结晶的能力)等作为可检测信号来评价各孔细胞的活性；后一种是根据本方法的反应原理，选择合适的检测方法和可检测信号，如细胞活性的降低为细胞凋亡所致，则参考《细胞凋亡的分子医学》(胡野、凌志强、单小云编著，2002年8月军事医学科学出版社出版)，就使用细胞凋亡的各种判定方法作为可检测信号，根据凋亡细胞的多少，反推各孔细胞活性的变化。
本发明中的可检测信号是指通过某种方法，或添加某种物质，使实验孔中待检单个核细胞的反应变化结果直观地或通过仪器设备呈现出来的信号，也就是待检单个核细胞的反应变化结果的显示(展示)方式。本发明的可检测信号主要有以下几种 1、给各孔添加MTT，观察各组细胞转化可溶性MTT为甲

类结晶的量，从而了解各组细胞活性增强或减弱等变化的大小。
2、参考《细胞凋亡的分子医学》(胡野、凌志强、单小云编著，2002年8月军事医学科学出版社出版)，根据本发明方法的反应原理，通过苏木素-伊红染色法，甲基绿-派诺宁染色法，姬姆萨染色法，瑞氏染色法对各组细胞进行染色后放显微镜下直接观察，根据凋亡细胞的特征性变化，计数比较各组细胞发生凋亡的比率。
3、参考《细胞凋亡的分子医学》(胡野、凌志强、单小云编著，2002年8月军事医学科学出版社出版)，根据本发明方法的反应原理，通过用丫啶橙(Acridine orange)、碘化丙啶、溴化乙啶、罗丹名123、异硫氰酸荧光素(标记抗体)等标记各组细胞，根据凋亡细胞的特征性变化，在荧光显微镜下观察各组细胞发生凋亡的多少。
4、参考《细胞凋亡的分子医学》(胡野、凌志强、单小云编著，2002年8月军事医学科学出版社出版)，根据本发明方法的反应原理，利用抗组蛋白抗体和抗DNA抗体，通过细胞凋亡的酶联免疫分析方法，检测各组细胞由于细胞凋亡所形成的断裂的单链或双联DNA的多少，从而推测各组细胞发生凋亡的多少。
MTT方法和细胞凋亡检测方法之间相互的对应关系是MTT方法是利用活细胞具有转化可溶性MTT为蓝紫色甲

类结晶物质的原理(死细胞不具有这种能力)，检测各组细胞中活细胞的活性，活细胞越多、细胞活性越强可溶性MTT转化为蓝紫色甲

类结晶物质的量越多；细胞凋亡检测方法检测的是各组细胞的凋亡情况-即死细胞的多少；在试验中各组加入的待检活细胞是一定的，各组中待检细胞发生凋亡的多，则其中的活细胞就少，转化可溶性MTT为蓝紫色甲

类结晶物质的量就少，反之，则转化可溶性MTT为蓝紫色甲

类结晶物质的量就大。
通过以上分析，虽然本发明方法的试验结果可以通过多种方法和形式，转化成各种可检测信号，但本发明经过比较认为，四唑盐比色是其中最方便和敏感的试验结果显示方法。在细胞培养结束后给各孔加四唑盐(MTT 5mg/ml)10-20μl，继续放37℃的CO2孵箱内培养0.5-6h，一般为1-2h，其结果可以放倒置显微镜下直接观察各孔转化黄色可溶性MTT为蓝紫色甲

类结晶物质的量。也可以在培养结束后除去各孔的培养上清，然后每孔加二甲基亚砜(DMSO)100-150μl轻轻振荡5分钟，令甲

类结晶充分溶解后，用酶标仪在490nm-590nm之间选一具有最大吸光值的波长测各孔吸光值，一般用550nm，比较实验孔与阴性对照孔之间的差异，从而了解待测样品中有无已知目的抗原特异性活化淋巴细胞的存在，本发明的阴性对照孔还包括不加任何抗原的、只含有待检细胞的孔。

具体实施例方式 下述实施例是为了更好的解释本发明的目的，而不应被理解限制本 发明的范围。
实施例1 作为抗原的细胞的制备在心脏移植时，无菌操作取供体脾脏，用200目研磨网研磨供者脾细胞，用无血清1640培养液(GIBCO公司)1500rpm洗涤两次，去上清，沉淀用无血清1640培养液制成约1×108个细胞/ml的细胞悬液，用常规人淋巴细胞分离液(GIBCO公司)分离单个核细胞，2000rpm水平离心机离心20分钟，吸取分离液与1640培养液界面上的细胞层细胞移入另一无菌离心管，无血清1640培养液，1500rpm、1000rpm离心洗涤两次，去上清(若有红细胞则用37～40℃预温的0.83％NH4Cl溶液悬起，37～40℃水浴处理10分钟，然后再用无血清1640培养液1000rpm离心洗涤2次)，沉淀用含丝裂霉素(Sigma公司)25μg/ml的无血清1640培养液制成约1×107个细胞/ml的细胞悬液，37℃水浴作用30分钟，1000rpm离心10分钟弃上清，沉淀细胞用无血清1640培养液1000rpm离心洗3次，沉淀用细胞冻存液(按《实用单克隆抗体技术》徐志凯主编，陕西科学技术出版社，1992年第一版中的配方制备)制成约2×107个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管内，-70℃冰箱或液氮中冻存备用。
纯化白细胞介素-2中和单抗(第四军医大学免疫学教研室生产)，用PBS溶液配成4mg/ml，一次性针头滤器除菌分装，-20℃冻存备用；四氮唑盐(MTT，Sigma产品)用生理盐水制成5mg/ml的使用液，一次性针头滤器过滤除菌，分装，-20℃冻存备用。
待检活化淋巴细胞的制备心脏移植后不同时间(一般在心脏移植后3-5天即可有抗供体活化淋巴细胞产生，故在心脏移植3-5天后即可开始检测)，抽取受者静脉血5-10ml，按上述方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液离心洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清(GIBCO公司)的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。在制备活化淋巴细胞的同时，复苏冻存的供者脾细胞，然后用无血清1640培养液1000rpm离心洗涤一次，沉淀用上述含20％胎牛血清和免疫抑制剂的1640培养液制成2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。
分别把供、受体细胞，IL-2中和单抗按以下分组及用量加入96孔圆底细胞培养板中；A.受体细胞100μl+供体细胞100μl；B.受体细胞100μl+供体细胞100μl+IL-2中和单抗20μl；C.受体细胞100μl+IL-2中和单抗20μl+稀释细胞用的1640培养液100μl；D.受体细胞100μl+稀释细胞用的1640培养基100μl。每组设3个复孔。上述操作完成后把培养板放37℃的CO2孵箱内培养。
MTT显色法在上述细胞培养20-24h后每孔加入MTT 10μl，继续培养0.5-4h后可以于倒置显微镜下直接观察各孔黄色水溶性MTT转化为蓝紫色甲

类结晶物质的量，也可以先除去各孔培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长范围为490nm-590nm，最佳为550nm。
结果与混合淋巴细胞反应和预处理淋巴细胞分型试验正好相反，当受体体内有激活的抗供体淋巴细胞存在(活检证实有排斥反应发生)时，A组和B组反应明显减弱，尤其是B组细胞处理MTT的能力几乎被完全抑制，而C组和D组则差别不大均较强，或C组比D组稍减弱。
判定标准 一、倒置显微镜下直接观察有排斥反应发生时A、B两组与C、D两组相比，细胞活性明显减弱，尤其是B组，细胞活性可完全被抑制，A组细胞活性减弱的程度可能与排斥反应强弱有关，排斥反应越强减弱越明显，排斥反应弱时，A组与C、D组比活性减弱不明显；但只要有排斥反应，B组细胞活性就会比C组明显减弱。无排斥反应各组细胞活性无明显差别或C、B组均较弱，有时C更弱。无排斥反应但最近或目前正在发生细菌或病毒感染各组细胞活性均较强，各组之间亦无明显差别，或C组稍减弱。最近或目前正在发生细菌或病毒感染，同时有排斥反应发生A组或有减弱，B组的细胞活性比C组及A、D组的细胞活性明显减弱。D组的细胞活性很强。
二、酶标仪测各孔吸光值 细胞培养20-24小时后加MTT，每孔10μl，继续培养0.5-1.5小时后吸去每孔的培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为550nm，以只加150μl二甲基亚砜(DMSO)的无细胞孔为调零孔。以B组平均OD值小于70％C组平均OD值为阳性，等于70％-90％C组平均OD值为可疑阳性。
结果通过用本方法对15例心脏移植患者进行跟踪监测100余人次，活检对照56例次，本试验检测结果阳性29例次，其中活检证实18例次无症状排斥反应，其中4例次为III级排斥反应，5例次为II级排斥反应，9例次为I级排斥反应。另有11例次活检结果虽不正常但达不到I级排斥反应诊断标准。27例次本试验结果阴性者活检均为阴性。
表1 活检阳性 阴性 本实验结果 阳性 18 11 阴性 0 27 两种实验结果之间的一致性为80.3％，特异性为71％，敏感性100％。
说明本发明特异性较低的主要原因是因为其敏感性高，就上表中11例假阳性结果的活检片子看虽达不到I级排斥反应的诊断标准，但也不是完全正常，也许是活检本身如前所述反映情况不全面的原因，加上人看片子的评价标准不致所致。
测试结果说明对每个心脏移植患者进行动态监测，其监测结果与活检病理结果进行对照。
真阳性(TP)本方法为阳性，活检证实发生了I级以上排斥反应。
真阴性(TN)本方法为阴性，活检证实无排斥反应发生。
假阳性(FP)本方法为阳性，活检证实无排斥反应发生。
假阴性(FN)本方法为阴性，活检证实发生了I级以上排斥反应。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特异性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 排斥反应的发生首先开始于淋巴细胞的活化，活化淋巴细胞的出现应早于病理改变。本方法主要侧重于检测患者外周血中有无供体抗原特异性的活化淋巴细胞。本试验的结果可能早于活检病理改变，这将使我们有可能在移植器官受到损害，器官出现病理改变前发现并预测排斥反应的发生。这可能就是所谓的假阳性产生的原因。
实施例2 刺激抗原的制备参考《现代结核病学》(人民军医出版社，2000年第一版，张敦熔主编)一书，用国内外广泛使用的，已商品化的固体或液体培养基(例如国内外广泛使用的固体培养基Lowenstein-Jensen(L-J)，小川等的鸡蛋培养基和Middlebrook 7H10、7H11等琼脂培养基；液体培养基Middlebrook 7H9、Sauton等)，从结核病人上呼吸道分泌物中分离、培养、扩增结核杆菌，用生理盐水10000rpm低温离心洗涤一次，沉淀用4℃冷丙酮悬起，4℃处理30-60分钟，用生理盐水10000rpm低温离心洗涤二次，沉淀用10％甲醛悬起，4℃处理过夜，10000rpm低温离心20分钟，沉淀用无血清1640培养液10000rpm离心洗3次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK5060.125ng，甲基强的松龙5μg)制成约2×108个细菌/ml的细菌悬液，分装入冻存管内，-70℃冰箱或液氮中冻存备用。
纯化白细胞介素-2中和单抗及四氮唑盐的制备如实施例1。
待检活化淋巴细胞的制备抽取可疑结核病患者静脉血5-10ml，按实施例1的方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。在制备活化淋巴细胞的同时，复苏冻存的结核杆菌抗原，然后用上述含20％胎牛血清和免疫抑制剂的1640培养液制成的2×107个细菌/ml的细菌悬液备用。
分别把患者单个核细胞悬液、细菌悬液、IL-2中和单抗按以下分组及用量加入96孔圆底细胞培养板中；A.患者细胞100μl+细菌悬液100μl；B.患者细胞100μl+细菌悬液100μl+IL-2中和单抗35μl；C.患者细胞100μl+IL-2中和单抗35μl+稀释细胞用的1640培养液100μl；D.患者细胞100μl+稀释细胞用的1640培养基100μI。每组设3个复孔。上述操作完成后把培养板放37℃的CO2孵箱内培养。
MTT显色法在上述细胞培养20-24h后加入MTT每孔10μl，继续培养0.5-4h后可以于倒置显微镜下直接观察各孔黄色水溶性MTT转化为蓝紫色甲

类结晶物质的量，也可以先除去各孔培养液，每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为490nm、570nm、630nm。结果当受体体内有激活的抗结核杆菌特异性活化淋巴细胞存在时，A组和B组反应明显减弱，尤其是B组细胞处理MTT的能力几乎被完全抑制，而C组和D组则差别不大均很强，或C组比D组稍减弱。
判定标准 一、倒置显微镜下直接观察有结核杆菌感染A、B两组与C、D两组相比，细胞活性明显减弱，尤其是B组，细胞活性可完全被抑制，A组细胞活性减弱的程度可能与特异性活化淋巴细胞的多少有关，特异性活化淋巴细胞越多减弱越明显，否则A组与C、D组比活性减弱不明显；但只要有抗原特异性活化淋巴细胞，B组细胞活性就会比C组明显减弱。无结核杆菌感染各组细胞活性无明显差别或C、B组较弱无结核杆菌感染，但最近或目前正在发生其它细菌或病毒感染各组细胞活性均较强，各组之间亦无明显差别，或C组稍减弱。最近或目前正在发生细菌或病毒感染，同时有结核杆菌感染A组或有减弱，B组的细胞活性比C组及A、D组的细胞活性明显减弱。A、C、D组细胞活性均很强。
二、酶标仪测各孔吸光值 细胞培养20-24小时后加MTT，每孔10μl，继续培养1-2h后吸去每孔的培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为550nm，以只加150μl二甲基亚砜(DMSO)的无细胞孔为调零孔。以B组平均OD值小于60％C组平均OD值为阳性，等于60％-80％C组平均OD值为可疑阳性。
测试结果说明用本法对患者进行检测，其检测结果可与结核常用临床诊断方法的结果进行对照。
真阳性(TP)本方法为阳性，培养、PCR等方法中有一个为阳性 真阴性(TN)本方法为阴性，培养、PCR等方法均为阴性。
假阳性(FP)本方法为阳性，培养、PCR等方法均为阴性。
假阴性(FN)本方法为阴性，培养、PCR等方法中有一个为阳性。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特异性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 结核杆菌进入机体后，首先活化体内的淋巴细胞，活化淋巴细胞的出现应早于临床症状的出现。本方法主要侧重于检测患者外周血中有无结核杆菌抗原特异性的活化淋巴细胞。本试验的结果可能有利于结核病的早发现、早隔离、早治疗。
实施例3 排斥反应监测抗原板的制备通过用前述抗原制备方法1，4所得到的，分别表达不同同种异体抗原的细胞系(例如Raji细胞)，通过培养扩增后，用无血清1640培养液1500rpm洗涤两次，去上清，沉淀用10％甲醛或多聚甲醛溶液，制成约1×108个细胞/ml的细胞悬液，4℃处理过夜后，用无血清1640培养液，1000rpm离心洗涤3次，去上清，沉淀用细胞冻存液(见实施例1)，制成约2×107个细胞/ml的细胞悬液，然后分别把这些表达不同同种异体抗原的细胞加入96孔U形底或圆底细胞培养板各孔中，每孔10μl，使培养板中的细胞包含人类大部甚至全部的同种异体抗原。各孔包含哪一个或那几个同种异体抗原都是已知的，不表达人类同种异体抗原的细胞如U973，K562等作为阴性对照细胞；另设3个只加待检细胞的孔亦作阴性对照。加入抗原细胞的细胞培养板即可做为排斥反应监测抗原板，-70℃冰箱或液氮中冻存备用。
纯化白细胞介素-2中和单抗及四氮唑盐的制备如实施例1。
待检活化淋巴细胞的制备器官移植后不同时间，抽取受者静脉血25ml，按上述方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.0625ng，甲基强的松龙2.5μg，纯化白细胞介素-2中和单抗约60μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。
把待检单个核细胞悬液分别加入上述已制备好的排斥反应监测抗原板各孔中，每孔100μl，操作完成后把培养板放37℃的CO2孵箱内培养。
MTT显色法在上述细胞培养20-24h后加入MTT每孔10μl，继续培养0.5-4h后可以于倒置显微镜下直接观察各孔黄色水溶性MTT转化为蓝紫色甲

类结晶物质的量，也可以先除去各孔培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为490nm-630nm。
判定标准 一、倒置显微镜下直接观察 已知患者供体同种异体抗原时，首先找出含供者抗原的孔中处理MTT的能力明显减弱的孔，然后再找出不含该患者供体同种异体抗原的孔中处理MTT的能力最弱的孔与之比较，若前者比后者处理MTT的能力明显减弱则说明有排斥反应发生；否则则无排斥反应发生。
不知患者供体同种异体抗原时，首先找出含同种异体抗原的孔中处理MTT的能力明显减弱的孔，然后与阴性对照孔中处理MTT的能力最弱的孔进行比较，若前者比后者处理MTT的能力明显减弱则说明有排斥反应发生；否则则无排斥反应发生。
二、酶标仪测各孔吸光值 细胞培养20-24小时后加MTT，每孔10μl，继续培养1-2h后吸去每孔的培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为490nm，以只加150μl二甲基亚砜(DMSO)的无细胞孔为调零孔。以含抗原孔中有单孔OD值小于阴性对照孔中最低OD值孔的60％时为阳性，等于阴性对照孔中最低OD值孔的60％-80％为可疑阳性。
结果通过对15例心脏移植患者进行跟踪监测100余人次，发现14例次无症状排斥反应，活检证实其中4例次为III级排斥反应，2例次为II级排斥反应，8例次为I级排斥反应。
测试结果说明对每个心脏移植患者进行动态监测，其监测结果与活检病理结果进行对照。
真阳性(TP)本方法为阳性，活检证实发生了I级以上排斥反应。
真阴性(TN)本方法为阴性，活检证实无排斥反应发生。
假阳性(FP)本方法为阳性，活检证实无排斥反应发生。
假阴性(FN)本方法为阴性，活检证实发生了I级以上排斥反应。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特异性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 实施例4 病原微生物抗原板的制备参考《体外培养的原理与技术》(薛庆善主编，科学出版社出版，2001年第一版)；《诊断与实验病毒学》(郑州大学出版社出版，2002年第一版，杨占秋、刘建军、肖红、丁晓华主编)；《医用实验病毒学》(杜平主编，人民军艺出版社出版，1985年第一版)等资料，按其上描述的各种病原微生物的培养、扩增及提纯方法，分别制备、纯化各种细菌和病毒的特异性抗原，60Co照射灭火其中可能存在的活细菌或活病毒，然后把这些不同的细菌或病毒的特异性抗原用含10％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.0125ng，甲基强的松龙0.5μg，纯化白细胞介素-2中和单抗约90μg)稀释至含目的抗原5mg/ml，然后分别把这些不同病原微生物的特异性抗原加入96孔平底细胞培养板各孔中，每孔100μl，使培养板中包含几种甚至几十种致病微生物的特异性抗原。各孔包含哪一个致病微生物的特异性抗原都是已知的，非致病微生物抗原如大肠杆菌等的抗原或其蛋白质抗原如牛血清白蛋白等可以作为阴性对照；加入致病微生物的特异性抗原的细胞培养板即可做为病原微生物感染的检测抗原板，-70℃冰箱中冻存备用。
纯化白细胞介素-2中和单抗及四氮唑盐的制备如实施例1。
待检活化淋巴细胞的制备抽取患者静脉血25ml，按上述方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.0125ng，甲基强的松龙0.5μg，纯化白细胞介素-2中和单抗约90μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。
把待检单个核细胞悬液分别加入上述已制备好的病原微生物感染检测抗原板各孔中，每孔100μl，操作完成后把培养板放37℃的CO2孵箱内培养。
MTT显色法在上述细胞培养4-20h后加入MTT每孔20μl，继续培养0.5-4h后可以于倒置显微镜下直接观察各孔黄色水溶性MTT转化为蓝紫色甲

类结晶物质的量，也可以先除去各孔培养液，每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为490nm、550nm、630nm。结果发现，当机体被某种病原微生物感染时，检测板中含相应病原微生物抗原的孔内的细胞处理MTT的能力明显减弱，甚至被完全抑制。
判定标准 一、倒置显微镜下直接观察 首先找出含病原微生物抗原的孔中处理MTT的能力明显减弱的孔，然后与阴性对照孔中处理MTT的能力最弱的孔进行比较，若前者比后者处理MTT的能力明显减弱则说明有该病原微生物感染；否则则无该病原微生物感染。
二、酶标仪测各孔吸光值 细胞培养20-24小时后加MTT，每孔10μl，继续培养1-2h后吸去每孔的培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为550nm，以只加150μl二甲基亚砜(DMSO)的无细胞孔为调零孔。以含病原微生物抗原孔中有单孔OD值小于阴性对照孔中最低OD值孔的70％时为阳性，等于阴性对照孔中最低OD值孔的70％-90％为可疑阳性。
测试结果说明结果阳性，说明体内有该孔抗原对应的特异性活化淋巴细胞存在，即机体是被该特异性抗原对应的病原微生物感染了。该结果可与病原微生物感染检测的其它方法，如ELISA，PCR等方法进行对照。
真阳性(TP)本方法为阳性，ELISA、PCR等方法中有一个为阳性。
真阴性(TN)本方法为阴性，ELISA、PCR等方法均为阴性。
假阳性(FP)本方法为阳性，ELISA、PCR等方法均为阴性。
假阴性(FN)本方法为阴性，ELISA、PCR等方法中有一个为阳性。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特异性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 病原微生物进入机体后，首先活化体内的淋巴细胞，活化淋巴细胞的出现应早于临床症状的出现；本方法主要侧重于检测患者外周血中有无病原微生物抗原特异性的活化淋巴细胞；本试验的结果可能有利于传染病的早发现、早隔离、早治疗，避免疾病的传播和流行。
实施例5 纯化白细胞介素-15中和单抗(第四军医大学免疫学教研室生产)，用PBS溶液配成8mg/ml，一次性针头滤器除菌分装，-20℃冻存备用。
除了用白细胞介素-15中和单抗代替白细胞介素-2中和单抗，以及用20μg氢化可的松代替5μg甲基强的松龙以外，重复实施例1的操作。
判定标准同实施例1。
结果与实施例1比较无明显差别。
实施例6 除了用强的松15μg代替5μg甲基强的松龙以外，重复实施例1的操作。
结果与实施例1对照无明显差别。
实施例7 除了用实施例5中的白细胞介素-15中和单抗代替白细胞介素-2中和单抗，以及用每ml含125ng雷帕霉素和20μg地塞米松的含20％胎牛血清的1640培养液代替实施例1中的含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg)以外，重复实施例1的操作。
判定标准同实施例1。
结果与实施例1比较无明显差别。
实施例8 除了用实施例5中的白细胞介素-15代替白细胞介素-2，以及用每ml含12.5ng脱氧精胍菌素和5μg甲强龙的含20％胎牛血清的1640培养液代替实施例1中的含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg)以外，重复实施例1的操作。
判定标准同实施例1。
结果与实施例1比较无明显差别。
实施例9 排斥反应检测抗原板的制备 1.膜抗原的制备在心脏移植时，无菌操作取供体脾脏，用200目研磨网研磨供者脾细胞，用无血清1640培养液1500rpm洗涤两次，去上清，沉淀用无血清1640培养液制成约1×108个细胞/ml的细胞悬液，用常规人淋巴细胞分离液分离单个核细胞，2000rpm水平离心机离心20分钟，吸取分离液与1640培养液界面上的细胞层细胞移入另一无菌离心管，无血清1640培养液、1500rpm、1000rpm离心洗涤两次，去上清(若有红细胞则用37～40℃预温的0.83％NH4Cl溶液悬起，37～40℃水浴处理10分钟，然后再用无血清1640培养液1000rpm洗涤2次)，沉淀用灭菌蒸馏水制成约1×108个细胞/ml的细胞悬液，37℃水浴作用60分钟，10000rpm离心10分钟弃上清，沉淀细胞用二甲苯(乙醚、氯仿亦可)5-10ml悬起，充分震荡5分钟，溶解细胞膜上的脂质，然后加和上述灭菌蒸馏水等量的无血清1640培养液，在充分振摇5分钟，1000rpm离心5分钟，吸除上层二甲苯，另加新的二甲苯5-10ml，在充分振摇5分钟，1000rpm离心5分钟，吸除上层二甲苯，混匀下层水相的膜蛋白，分装入冻存管内，每管1ml，冷冻干燥机内冻干，-70℃冰箱冻存备用。
2.排斥反应检测抗原板的制备①取48或96孔可包抗原的细胞培养板或可用于细胞培养的酶标板和抗人HLA I类分子单态抗体或β2微球蛋白抗体及抗人HLA II类抗原单态抗体(抗体均为第四军医大学免疫学教研室生产，或晶美公司生产)；②用ELISA包被液分别稀释上述抗体至4mg/ml，然后加入上述酶标板或细胞培养板中，100μl/孔，4℃过夜(一般A、C、E、G排左边六孔加HLA I类分子单态抗体或β2微球蛋白抗体，B、D、F、H排左边六孔加抗人HLA II类抗原单态抗体)，第二天吸去包被液，无菌生理盐水洗涤三次；③取上述冻干的膜蛋白，每管加无菌生理盐水1ml混匀，上述包被抗体的孔每孔加0.1ml 4℃过夜，第二天吸去上清液，无菌生理盐水洗涤三次；分别含供体HLA I类抗原和HLA II类抗原的检测板就制备完成了；④板子除去洗涤液后晾干，-70℃冻存备用 3.纯化白细胞介素-2中和单抗及四氮唑盐如实施例1所述制备。
4.待检活化淋巴细胞的制备心脏移植一周后定期抽取受者静脉血5-10ml，按上述方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。在制备活化淋巴细胞的同时，取上述制备好的分别含供体HLA I类抗原和HLAII类抗原的检测板各一条(一条有6孔包了HLA I类抗原，6孔未包抗原；另一条有6孔包了HLA II类抗原，6孔未包抗原)，室温下预温待用。
分别把受体细胞，IL-2中和单抗按以下分组及用量加入96孔或48孔上述已制备好的排斥反应抗原检测板中；A.包HLA抗原孔+受体细胞100μl；B.包HLA抗原孔+受体细胞100μl+IL-2中和单抗45μl；C.未包HLA抗原孔+受体细胞100μl+IL-2中和单抗45μl；D.未包HLA抗原孔+受体细胞100μl；HLA I类抗原、II类抗原检测板均按以上分组加。以上各孔加稀释细胞用的1640培养基100μl。每组设3个复孔。上述操作完成后把培养板放37℃的CO2孵箱内培养。
MTT显色法同实施例1。
判定标准同实施例1。
由HLA I类抗原引起的排斥反应，则含I类抗原的B组反应明显减弱，而由HLA II类抗原引起的排斥反应，则含II类抗原的B组反应明显减弱；含供体HLA I类抗原和HLA II类抗原的检测板条B组的反应均明显减弱时，则说明供体的HLA I类抗原和II类抗原均参与了排斥反应。
实施例10 1.病毒检测抗原的制备参考《体外培养的原理与技术》(薛庆善主编，科学出版社出版，2001年第一版)；《诊断与实验病毒学》(郑州大学出版社出版，2002年第一版，杨占秋、刘建军、肖红、丁晓华主编)；《医用实验病毒学》(杜平主编，人民军艺出版社出版，1985年第一版)等资料，对麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型及庚型肝炎病毒、水痘和带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、冠状病毒、轮状病毒、柯萨基病毒、埃可病毒(ECHO)、黄热病毒、腺病毒、森林脑炎病毒、风疹病毒、登革热病毒、流行性乙型脑炎病毒、狂犬病毒、SARS病毒、流行性感冒病毒(包括人、禽)流行性腮腺炎病毒、出血热病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒等，按他们各自的生长繁殖特点在体内或体外培养，并按它们各自不同的方法使之纯化从而得到这些病原体的纯品或相对纯品，这些相对纯化的病原体经用60CO照射、0.1-10％甲醛、超声、非离子去垢剂或脂溶剂如乙醚、氯仿处理等方法使之灭活后，用生理盐水稀释至10mg/ml病毒蛋白，分装入冻存管内，1ml/管冻干，-70℃冰箱冻存备用。
2.病毒检测抗原板的制备①购买上述各种病毒的特异性抗体(晶美公司产品)，用ELISA包被液分别稀释至4mg/ml；②取48或96孔可包抗原的细胞培养板或可用于细胞培养的酶标板，然后把上述用包被液稀释好的各种特异性抗体分别加至上述酶标板或细胞培养板中，每种特异性抗体设三个复空，100μl/孔(留三个空白孔不包抗体)，4℃过夜；第二天吸去包被液，无菌生理盐水洗涤三次；③取上述冻干的各种病毒的蛋白质，每管加无菌蒸馏水1ml混匀，分别加至对应的、包被相应病毒特异性抗体的孔中，每孔加0.1ml，4℃过夜，第二天吸去上清液，无菌生理盐水洗涤三次；包含有上述各种病毒抗原的检测板就制备完成了；④板子除去洗涤液后晾干，-70℃冻存备用 3.纯化白细胞介素-2中和单抗及四氮唑盐如实施例1所述制备。
4.待检活化淋巴细胞的制备抽取待检患者静脉血5-10ml，按上述方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg，白细胞介素-2中和单抗75μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。在制备活化淋巴细胞的同时，取出病毒检测抗原板预温。
5.把上述已稀释好的患者待检淋巴细胞分别加入上述已制备好的病毒检测抗原板各孔中，100μl/孔，然后再加稀释细胞用的1640培养基100μl/孔。上述操作完成后把培养板放37℃CO2孵箱内培养。
MTT显色法在上述细胞培养20-24h后每孔加入MTT 10μl，继续培养0.5-4h后可以于倒置显微镜下直接观察各孔黄色水溶性MTT转化为蓝紫色甲

类结晶物质的量，也可以先除去各孔培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长范围为490nm-590nm，最佳为550nm。
一、倒置显微镜下直接观察 观察含病毒抗原的各孔转化黄色可溶性MTT为不溶性甲

类结晶物质的量，与不含病毒抗原的空白孔比较有无明显减少，若含某病毒抗原的孔转化黄色可溶性MTT为不溶性甲

类结晶物质的量与不含病毒抗原的空白对照孔比较有明显减少，则说明患者有该病毒感染，否则则说明无该病毒感染。
二、酶标仪测各孔吸光值 细胞培养20-24小时后加MTT，每孔10μl，继续培养0.5-1.5小时后吸去每孔的培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲

类结晶物质充分溶解后，用酶标仪测各孔吸光值，参考波长为550nm，以只加150μl二甲基亚砜(DMSO)的无细胞孔为调零孔。以各病毒的三孔平均OD值小于70％空白孔三孔的平均OD值为阳性，等于70％-90％空白孔三孔的平均OD值为可疑阳性。
实施例11 排斥反应监测抗原板的制备通过用前述抗原制备方法2所得到的，分别表达不同同种异体抗原的细胞系(例如只表达DR15的细胞系(瑞斯奇生物工程公司生产))，通过培养扩增后，用无血清1640培养液1500rpm洗涤两次，去上清，沉淀用10％甲醛或多聚甲醛溶液，制成约1×108个细胞/ml的细胞悬液，4度处理过夜后，用无血清1640培养液，1000rpm离心洗涤3次，去上清，沉淀用细胞冻存液，制成约2×107个细胞/ml的细胞悬液，然后分别把这些表达不同同种异体抗原的细胞加入96孔U形底或圆底细胞培养板各孔中，每孔10μl，每孔只含一种同种异体抗原，各孔组合起来，使培养板中的细胞包含人类大部甚至全部的同种异体抗原。各孔包含哪一个同种异体抗原都是已知的，不表达人类同种异体抗原的细胞如U973，K562等作为阴性对照细胞；另设3个只加待检细胞的孔亦作阴性对照。加入抗原细胞的细胞培养板即可做为排斥反应监测抗原板，-70℃冰箱或液氮中冻存备用。
纯化白细胞介素-2中和单抗及四氮唑盐如实施例1所述制备。
待检活化淋巴细胞的制备器官移植一周后定期抽取受者静脉血25ml，按上述方法分离单个核细胞，用无血清1640培养液洗涤2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培养液(其中每ml含FK506 0.125ng，甲基强的松龙5μg，纯化白细胞介素-2中和单抗约100μg)，制成约2×106个细胞/ml的细胞悬液备用。
把待检单个核细胞悬液分别加入上述已制备好的排斥反应监测抗原板各孔中，每孔100μl，然后再补上述细胞稀释用培养液每孔100μl，操作完成后把培养板放37℃的CO2孵箱内培养。
MTT显色法同上。
判定标准 一、倒置显微镜下直接观察 已知患者供体同种异体抗原时，首先找出含供者抗原的孔中处理MTT的能力明显减弱的孔，然后再找出不含该患者供体同种异体抗原的孔中处理MTT的能力最弱的孔与之比较，若前者比后者处理MTT的能力明显减弱则说明有排斥反应发生；否则则无排斥反应发生。
不知患者供体同种异体抗原时，首先找出含同种异体抗原的孔中处理MTT的能力明显减弱的孔，然后与阴性对照孔中处理MTT的能力最弱的孔进行比较，若前者比后者处理MTT的能力明显减弱则说明有排斥反应发生；否则则无排斥反应发生。
二、酶标仪测各孔吸光值 细胞培养20-24小时后加MTT，每孔10μl，继续培养1-2h后吸去每孔的培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻震荡5分钟，使甲以只加150μl二甲基亚砜(DMSO)的无细胞孔为调零孔。以含抗原孔中有单孔OD值小于阴性对照孔中平均OD值的70％时为阳性，等于阴性对照孔中平均OD值孔的70％-90％为可疑阳性。
测试结果说明对每个心脏移植患者进行动态监测，其监测结果与活检病理结果进行对照。本方法可以提示排斥反应是由哪一个同种异体抗原引起的。
实施例12 除了把白细胞介素-15中和单抗和白细胞介素-2中和单抗联合应用以外，重复实施例1的操作。
结果与实施例1对照无明显差别。
权利要求
1、一种检测机体活化淋巴细胞特异性的方法，此方法包括
1)制备检测用抗原，并用培养基稀释；所述抗原能使机体的淋巴细胞活化；所述培养基除包含常规细胞培养所需成分外，还添加了免疫抑制剂和/或抗肿瘤药和对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子的中和抗体和/或对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子；
2)用所述培养基制备包含待检活化淋巴细胞的单个核细胞；
3)将所述检测用抗原、含待检活化淋巴细胞的单个核细胞加入细胞培养板中一起培养；
4)通过比较试验孔与阴性对照孔的可检测信号的差异，来确定检测样品中是否存在抗原特异的活化淋巴细胞。
2、权利要求1的方法，其中所述抗原选自人主要组织相容性抗原(HLA)，同种异体抗原，异种抗原，病毒抗原和细菌抗原。
3、权利要求2的方法，其中所述抗原可以是颗粒抗原，也可以是可溶性抗原；其中所述人主要组织相容性抗原是HLA I类抗原或II类抗原中的一种，也可以是多种HLA I类和II类抗原的混合物。
4、权利要求1的方法，其特征在于，基于所述培养基的量，所述免疫抑制剂或抗肿瘤药的用量为0.001ng-100μg/ml，所述对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子的中和抗体的用量为1μg-10mg/ml，所述对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子的用量为0.01-1000个活性单位/ml。
5、权利要求1的方法，其特征在于，所述可检测信号是指能反映各孔细胞活性变化的信号。
6、权利要求4的方法，其中所述免疫抑制剂选自普乐可复，环孢素，环磷酰胺，硫唑嘌呤，雷帕霉素，RS-61443，BQR，人急性T淋巴细胞白血病细胞株JM分泌的免疫抑制因子，脱氧精胍菌素和肾上腺皮质激素；所述抗肿瘤药选自拓扑酶抑制剂、烷化剂，抗代谢药，维甲类化合物-维生素A衍生物及其它一些潜在的具有诱导免疫抑制作用或诱导肿瘤细胞凋亡作用的药物。
7、权利要求6的方法，其特征在于，所述免疫抑制剂和抗癌药可单独使用或联合使用。
8、权利要求6的方法，其中所述肾上腺皮质激素选自甲基强的松龙，强的松，氢化可的松和地塞米松等。
9、权利要求6的方法，其中所述环孢素选自环孢霉素A和环孢霉素C。
10、权利要求4的方法，其中所述对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子选自白细胞介素1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，α-干扰素，β-干扰素，ω-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，干细胞因子，血小板生成素。
11、权利要求4的方法，其中所述对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子选自白细胞介素2、4、10，转化生长因子β。
12、一种用于检测活化淋巴细胞特异性的培养基，其特征在于，除包含常规细胞培养所需成分外，还添加了免疫抑制剂和/或抗癌药和对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子的中和抗体和/或对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子。
13、权利要求12的培养基，其特征在于，基于所述培养基的量，所述免疫抑制剂的用量为0.001ng-100μg/ml。
14、权利要求12的培养基，其特征在于，基于所述培养基的量，所述对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子的中和抗体的用量为1μg-10mg/ml。
15、权利要求12的培养基，其特征在于，基于所述培养基的量，所述对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子的用量为0.01-1000个活性单位/ml。
16、权利要求14的培养基，其特征在于所述的细胞因子中和抗体可单独使用或联合使用。
17、权利要求14和15的培养基，其中所述细胞因子中和抗体和对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子可以分别使用，也可联合使用。
18、权利要求13的培养基，其中所述免疫抑制剂选自普乐可复，环孢素，环磷酰胺，硫唑嘌呤，雷帕霉素，RS-61443，BQR，脱氧精胍菌素和肾上腺皮质激素；所述抗肿瘤药选自拓扑酶抑制剂、烷化剂，抗代谢药，维甲类化合物-维生素A衍生物及其它一些潜在的具有诱导免疫抑制作用或诱导肿瘤细胞凋亡作用的药物。
19、权利要求18的培养基，其中所述免疫抑制剂和抗肿瘤药可单独使用，或联合使用。
20、权利要求18的培养基，其中所述肾上腺皮质激素选自甲基强的松龙，强的松，氢化可的松和地塞米松。
21、权利要求18的培养基，其中所述环孢素选自环孢霉素A和环孢霉素C。
22、权利要求14的培养基，其中所述对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子选自白细胞介素1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，α-干扰素，β-干扰素，ω-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，干细胞因子，血小板生成素。
23、权利要求15的培养基，其中所述对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子选自白细胞介素2、4、10，转化生长因子β、肿瘤坏死因子。
全文摘要
本发明提供了一种检测活化淋巴细胞特异性的方法，应用本方法可鉴定器官移植后、病原微生物感染后或疫苗接种后，受者或患者体内活化淋巴细胞的特异性。本方法的建立，不但可以及时诊断器官移植的排斥反应，指导临床上的合理用药，而且对许多感染性疾病均可及时诊断，及早隔离治疗，避免传播和流行，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N33/569GK1627074SQ20031011987
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者胡军 申请人:胡军