专利名称：筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞表位方法
技术领域：
本发明属生物技术的细胞生物学和免疫学等领域，涉及应用表达乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus, HBV)蛋白的细胞作为靶细胞，以候选的表位肽包被人工抗原提呈细胞(artificial antigen-presenting cells, aAPC)体外诱导 HBV 特异性细胞毒性 T 淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)作为效应细胞，观察效应细胞杀伤靶细胞的效果，以筛选和鉴定HBV特异性CTL表位。
背景技术：
慢性乙型肝炎病毒感染的治疗仍然是医学界面临的重大难题，目前抗HBV治疗的药物还不能彻底清除病毒，如何有效清除HBV依然是乙型肝炎治疗研究的热点。(I)HBV特异性CTL是机体清除HBV的重要因素。研究多克隆、多特异性、强应答的特异性CTL的制备方法，对慢性乙型肝炎的治疗具有重要意义。已有研究表明，HBV特异性CTL是机体清除HBV的重要因素急性乙型肝炎患者清除HBV主要由CTL介导，CTL可通过致肝细胞溶解和/或非溶解两条途径清除肝细胞内的 HBV(尤其是HBV cccDNA)，发挥抗病毒效应。急性乙型肝炎患者体内的CTL常为多克隆、多特异性、强应答及高IFN-γ分泌的。相反慢性乙型肝炎患者的HBV持续感染与宿主T细胞免疫应答不足相关。研究发现，慢性乙型肝炎患者体内抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)的抗原提呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信息传递给机体的免疫系统，因此慢性乙型肝炎患者体内的特异性CTL常表现为寡特异性、弱应答。由此可见，过继输入足够量的多克隆、多特异性、强应答的特异性CTL来清除病毒，可与目前抗病毒治疗相互补充，解决不能彻底清除肝细胞内病毒的问题。(2) HBV特异性CTL表位研究的现状CTL表位是诱导特异性CTL克隆性增殖、分化和发挥效应的最重要的激发因素，近年来倍受重视。目前，HBV特异性CTL表位的研究已经较多。但HBV特异性CTL表位研究也存在一定的问题①、未使用覆盖HBV抗原系统全序列的合成肽，可能遗漏部分重要信息；②、只选择与HLA(人类白细胞抗原)分子呈高亲和性结合的肽段进行分析，可能会遗漏亲和力不高却具有较强免疫原性的肽段；③、大多数的研究只是利用有限的常用的表位对不同临床类型乙型肝炎患者的CTL免疫进行分析，而目前临床上有大量的变异病毒出现，这些表位的序列也发生改变，因此这些表位不能用于很多感染变异病毒的患者的研究；④、几乎没有一种HLA限制性HBV CTL表位是由我国报道的， 而我国的HBV基因型和欧美国家的HBV基因型有很大差异。因此，全面、精确地对HLA限制性表位进行研究是十分必要和迫切的。表位研究方法学存在的问题以往研究是应用克隆技术通过逐步缩小筛查范围来确定免疫表位，并且是应用动物(或人体)实验来鉴定，耗时、耗力、收效低。随着对HLA认识的加深，现可根据不同HLA分子的表位结合基序，通过生物信息学预测某种抗原中可能存在的表位，但是必须结合现代实验技术进行鉴定。
人工抗原提呈细胞(artificialantigen-presenting cells, aAPC)是用人工的方法模拟抗原提呈细胞(APC)的功能——T淋巴细胞活化信号，可在体外活化特异性T淋巴细胞。目前常用的方法是在磁珠表面交联抗CD^单克隆抗体(mAb)和MHC I_Ig 抗原肽复合物，该磁珠可以诱导活化抗原肽特异性的CTL。aAPC具有较高的可操控性，可人为控制MHC抗原肽复合物，从而实现对⑶8+T淋巴细胞活化的调控，并有活化条件较均一，质量易控制，T细胞活化增殖周期短等优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种体外筛选和鉴定HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞表位的方法，采用该方法可以用于大规模的CTL表位的筛选和鉴定。为了解决上述技术问题，本发明提供一种体外筛选和鉴定HBV特异性细胞毒性T 淋巴细胞表位的方法，包括以下步骤1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC 采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法将MHC I-Ig和抗CD^mAb 包被在磁珠上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC ；2)、表位肽负载aAPC MHC I-Ig和抗CD^mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为20 40 μ g/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4 8X 108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC;负载的表位肽的序列是:Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val ；3)、负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL 分离HLA-A*0201正常人外周血PBMC细胞，以MACS技术分选获得⑶8+T细胞；将 ⑶8+T细胞与负载抗原肽的aAPC在培养基中37°C、5% CO2培养刺激3 4周，所述培养基 % OpTmiζer T-Cell Expansion SFM serum free ；再以磁铁吸附分离抗原特异性CTL ；以负载无关肽的aAPC为阴性对照；对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量；4)、以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞研究上述步骤3)所得的HBV抗原特异性 CTL抗HBV的功能以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞，该靶细胞是H印G2. 2. 15细胞；分别进行CTL 杀伤实验、测定HBV表面抗原及其测定HBV相关基因DNA。作为本发明的筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法的改进 利用MTT法进行CTL杀伤实验，利用时间分辨免疫荧光分析法测定HBV表面抗原，利用实时荧光定量PCR测定HBV相关基因DNA。由于aAPC具有较高的可操控性，可人为控制MHC抗原肽复合物，从而实现对CD8+T 淋巴细胞活化的调控，并有活化条件较均一，质量易控制，T细胞活化增殖周期短等优点。因此，可以把通过生物信息学方法预测并合成的表位肽结合在aAPC上，通过观察其活化CD8+T 淋巴细胞的功能，鉴定该表位诱导特异性CTL的活性。本发明的方法是在细胞水平进行研究，实现在细胞水平的高通量筛选表位，从而有可能筛选到未被发现的高免疫原性的表位， 并且避免了繁琐的动物(或人体)免疫等传统的表位研究方法，因此非常适用于大规模的CTL表位的筛选和鉴定，这种筛选方法尚未见报道，可为其他同类研究提供技术平台，方法学上具有明显的创新性，并具有重要的科学意义和社会效益。针对现有特异性CTL表位的筛选和鉴定的方法是应用动物(或人体)实验来实现的缺点，发明人设计了本发明的体外筛选和鉴定HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞表位的方法。本发明是基于MHC I-Ig分子和抗CD^mAb构建的人工抗原提呈细胞(aAPC)，负载需要筛选和鉴定的不同HBV抗原肽，在体外高效、特异地活化多克隆、多特异性、强应答的HBV特异性CTL，以表达HBV抗原的细胞为靶细胞，通过对靶细胞的杀伤活性的观察，形成一种体外筛选和鉴定HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞表位的新方法，为抗乙型肝炎病毒治疗新技术的研究以及乙型肝炎发病的免疫机制研究提供技术手段。本发明的方法是把通过生物信息学方法预测并合成的表位肽结合在aAPC上，通过观察其活化CD8+T淋巴细胞的功能，鉴定该表位诱导特异性CTL的活性。本方法是在细胞水平进行研究，实现在细胞水平的高通量筛选表位，从而有可能筛选到未被发现的高免疫原性的表位，并且避免了繁琐的动物(或人体)免疫等传统的表位研究方法，因此非常适用于大规模的CTL表位的筛选和鉴定，这种筛选方法尚未见报道，可为其他同类研究提供技术平台，方法学上具有明显的创新性，并具有重要的科学意义和社会效益。CTL表位是诱导特异性CTL克隆性增殖、分化和发挥效应的最重要的激发因素，近年来倍受重视。但是以往研究是应用克隆技术通过逐步缩小筛查范围来确定免疫表位，并且是应用动物(或人体)实验来鉴定，耗时、耗力、收效低。
具体实施例方式1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC 采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法将MHC I-Ig和抗CD^mAb 包被在磁珠(Dynabeads M-450，购自invitrogen)上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC ；具体方法灭菌的0. IM硼酸盐缓冲液洗涤磁珠两次，使磁珠与1 1混合的 HLA-A2-Ig和anti-Q^8mAb9. 3(抗⑶观的单克隆抗体，购买)在旋转器上4°C孵育Mh。用洗磁珠缓冲液洗涤两次，再在含有洗磁珠缓冲液中孵育Mh，然后弃去洗液，加入新鲜的缓冲液。制备的aAPC最后每个磁珠含有0. 9X105分子的HLA-A2-Ig和1. 9X 105anti-Q^8mAb 9. 3分子。制备好的磁珠4°C可保存3个月。幻表位肽负载aAPC:MHC I-Ig和抗CD^mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为20 40 μ g/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4 8X 108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC;负载的表位肽的序列是FLPSDFFPSV；S卩Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val(SEQ ID NO :1)。3)负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL 分离HLA-A*0201正常人外周血PBMC细胞，以MACS技术分选获得⑶8+T细胞(德国milteny公司产品“CD8+T Cell Isolation Kit”，按试剂盒说明书操作)；将 ⑶8+T细胞与负载抗原肽的aAPC在培养基中37°C，5% C02培养刺激3 4周，所述培养基为 OpTmizer T-Cell Expansion SFM serum free (Gibco,2% heated inactivated humanserum(Gibco)，100-200IU IL-2 ；再以磁铁(DynaMag-2，Dynabeads)吸附分离抗原特异性CTL ；以负载无关肽的aAPC为阴性对照。对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量荧光素标记的链亲和素(购买)与4个生物素标记的MHC-肽复合物(委托商业公司合成)结合形成四聚体 (Tetramer)，得MHC-肽四聚体；MHC-肽四聚体与抗原特异性CTL上的TCR结合后，通过流式细胞仪进行检测。4)、以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞研究步骤3)所得的HBV抗原特异性CTL抗 HBV的功能以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞，该靶细胞是H印G2. 2. 15细胞0fepG2. 2. 15系 HCC细胞H印G2转导了 HBV表达质粒，可检测到HBsAg、HBeAg, HBV DNA和Dane颗粒，并可检测到HBV cccDNA, HLA_A*0201限制性，可作为特异性CTL的靶细胞)。①、CTL杀伤实验用MTT法按效靶比20 1将抗原特异性CTL(效应细胞)和H印G2. 2. 15细胞(靶细胞) 加入RT-CES专用96孔板中，靶细胞每孔1 X IO3个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3 复孔，每孔200ul。37°C,5% CO2孵育48h后，加入MTT 0. 2mg/孔，继续培养4-6小时，去上清，加入DMSO IOOul/孔，显色，酶标仪于波长570nm下读数。按以下公式计算杀伤率。同时以无关肽诱导的CTL作为阴性对照。判断的标准是48小时后杀伤率较对照组高20%以上，阴性对照为10%，实验组为30%以上。杀伤率=(1-(试验孔A值-效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值)*100%。②、时间分辨免疫荧光分析法测定HBV表面抗原按效靶比20 1将抗原特异性CTL(效应细胞)和H印G2. 2. 15细胞(靶细胞) 加入普通96孔培养板中，37°C，5% CO2孵育4 后，收集培养上清和细胞。培养上清用于检测HBV表面抗原表达量，按照时间分辨免疫荧光分析法HBsAg实际盒说明书操作。判断的标准是48小时后细胞培养上清内HBsAg较对照组下降30%以上，阴性对照为8ng/ml，实验组为5. 5ng/ml。③、实时荧光定量PCR测定HBV相关基因DNA 上述收集的细胞提取细胞DNA后，实时荧光定量PCR对HBV DNA进行动态监测。判断的标准是48小时后细胞内HBV DNA的拷贝数较对照组下降30%以上，阴性对照为3X IO5 个拷贝/ml，实验组为2. IXlO5个拷贝/ml。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法，其特征是包括以下步骤1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法将MHC I-Ig和抗CD^mAb包被在磁珠上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC ；2)、表位肽负载aAPCMHC I-Ig和抗CD^mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为 20 40 μ g/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4 8X 108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC;负载的表位肽的序列是:Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val ；3)、负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL分离HLA-A*0201正常人外周血PBMC细胞，以MACS技术分选获得⑶8+T细胞；将⑶8+T 细胞与负载抗原肽的aAPC在培养基中37°C、5% CO2培养刺激3 4周，所述培养基为 OpTmiζer T-Cell Expansion SFM serum free ；再以磁铁吸附分离抗原特异性CTL ；以负载无关肽的aAPC为阴性对照；对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量；4)、以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞研究上述步骤3)所得的HBV抗原特异性CTL抗 HBV的功能以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞，该靶细胞是H印G2. 2. 15细胞；分别进行CTL杀伤实验、测定HBV表面抗原及其测定HBV相关基因DNA。
2.根据权利要求1所述的筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法， 其特征是利用MTT法进行CTL杀伤实验，利用时间分辨免疫荧光分析法测定HBV表面抗原，利用实时荧光定量PCR测定HBV相关基因DNA。
全文摘要
本发明公开了一种筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法，包括以下步骤1)制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC；2)表位肽负载aAPC；3)负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL；4)以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞研究上述步骤3)所得的HBV抗原特异性CTL抗HBV的功能以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞，该靶细胞是HepG2.2.15细胞；分别进行CTL杀伤实验、测定HBV表面抗原及测定HBV相关基因DNA。采用该方法可以用于大规模的CTL表位的筛选和鉴定。
文档编号G01N33/554GK102183640SQ20111003365
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者朱海红 申请人:浙江大学