用于癌症治疗的免疫刺激性hiv tat衍生多肽的制作方法
【专利说明】用于癌症治疗的免疫刺激性HIV TAT衍生多肽
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请基于35USC§119 (e)要求2013年10月4日提交的美国临时专利专利申请61 / 887,166的权益，所述专利申请的全部内容通过引用并入本文中。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于癌症的基于免疫的治疗剂领域。
[0004] 罝量
[0005] 免疫检查点代表导致对癌症的有效免疫应答被抑制的抑制性分子，其可导致肿瘤 逃逸。免疫检查点分子例如细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA_4)和程序性细胞死亡l(ro-l) 以及程序性细胞死亡配体I(PD-Ll)被认为促进伴随癌症进展的免疫功能紊乱且它们的治 疗性阻断已显示出临床益处。特别地，肿瘤ro-Li和ro-i参与浸润细胞毒性τ淋巴细胞(CTL) 被认为通过诱导T-细胞不应、耗竭和程序性细胞死亡而成为肿瘤逃逸和免疫抵抗背后的重 要机制。理解免疫应答期间免疫检查点分子的操作是设计人类癌症的有效免疫疗法的重要 策略。
[0006] 人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式激活因子(Tat)是可变的RNA结合肽，其提高病毒 RNA转录并且可以引起T4细胞和巨噬细胞的凋亡，还可能刺激α干扰素的过量生产。然而，从 经HIV感染的长期无进展者(LTNP)中分离的Tat蛋白与在由于HIV感染已经发展成获得性免 疫缺陷综合症(AIDS)的患者中发现的Tat不同。在LTNP中发现的Tat蛋白能够反式激活病毒 RNA;然而，这种免疫刺激性Tat不诱导T4细胞或巨噬细胞的凋亡且无免疫抑制性。在感染猴 物种的慢病毒中发现的免疫刺激性Tat的变体也不导致免疫缺陷的发展且流行性感染指导 单核细胞分化为刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的树突细胞(DC)。因此，免疫刺激性 Tat可用于刺激对人类癌症的免疫应答。
[0007]癌症和慢性感染是对基于免疫的治疗应答的常见人类疾病的最突出的例子。尽管 感染是要通过免疫来控制的首要疾病，但是人类中的临床试验已经确定了免疫应答尤其是 免疫系统的CTL臂能够使一些人类黑色素瘤和肾癌消退。这些观察结果被下述发现扩展:一 类特别的抗原呈递细胞(APC)DC特别有效地引起针对癌症和其它疾病的CTL活性。靶向和激 活DC的技术已经导致针对由人类乳头状瘤病毒(HPV)感染引起的人类宫颈前恶性肿瘤和人 类肺癌的一些早期成功。与目前针对癌症使用的化学治疗药物相反，激发针对癌症的CTL应 答的药剂由于免疫应答的巨大特异性而伴随着极少的副作用。
[0008]开发治疗癌症的免疫治疗药物的努力被下述技术困难阻碍:靶向和激活DC，从而 将所需的进入信号递送并维持至CTL。诱导CTL应答的抗原靶向在下述范围内是一种挑战： 天然加工需要抗原进入细胞的细胞质，从而结合免疫系统的主要组织相容性复合物(MHC) I 类抗原，这是CTL激活的必要条件，因为激活CTL上T细胞受体的配体是抗原和MHC I类的复 合物。在几乎所有情况下，蛋白质抗原甚至在它们与DC辅助激活因子偶联时排他地进入取 代性的MHC II类抗原呈递途径，其排除CTL刺激。这可以部分通过基于肽的技术来克服，因 为肽结合已经位于DC表面上的MHC I类。然而，该技术是非特异性的，并且大部分肽是差的 DC激活因子，这限制了它们作为人类癌症治疗的功效。
[0009] 已知有限的一组生物蛋白质刺激CTL应答。人免疫缺陷病毒I(HIV-I)转录反式激 活因子(Tat)的变体和衍生物能够刺激该CTL应答。目前已知直接引发CTL应答的其它生物 品以热休克蛋白（HSP)为基础，或者以某些细菌的外壳蛋白为基础。在与HPV感染相关的某 些生殖器瘤的治疗中，热休克蛋白显示有限的功效。
[0010] 发明概述
[0011] 本文公开了用作癌症治疗剂的人类免疫缺陷病毒(HIV)转录反式激活因子(Tat) 蛋白的衍生物。人工的免疫刺激性Tat衍生多肽具有治疗癌症的潜力。
[0012] 在一个实施方式中，提供了转录反式激活因子(Tat)衍生多肽，其具有氨基酸序 列，所述氨基酸序列以以下顺序包含：（i)来自人类免疫缺陷病毒(HIV)或者猴免疫缺陷病 毒(SIV)Tat蛋白的转录因子(TF)结构域序列，（ii)来自SIV、HIV或防御素(defensin)的富 半胱氨酸结构域序列，和(i i i)来自HIV或SIV Tat蛋白的C末端结构域序列。
[0013] 本文还公开了包含本文所公开的Tat衍生多肽的药物组合物。
[0014] 在Tat衍生多肽的一个实施方式中，HIV是HIV-I或HIV-2。在另一个实施方式中， HIV-ITat来自长期无进展者。在另一个实施方式中，SIV来自选自表2的宿主。在另一个实施 方式中，防御素是α_防御素或β_防御素。在另一个实施方式中，Tat衍生多肽还包含来自 HIV-I或HIV-2Tat的富精氨酸结构域。
[0015] 在Tat衍生多肽的另一个实施方式中，TF结构域中至少一个氨基酸被缺失或者被 丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。在另 一个实施方式中，至少一个被取代的氨基酸是脯氨酸。
[0016] 在某些实施方式中，TF结构域包含SEQ ID NOs:96-123之一的氨基酸序列。在另一 些实施方式中，富半胱氨酸结构域包含SEQ ID NOs :124-132之一的氨基酸序列。在另一些 实施方式中，C末端结构域包含SEQ ID NOs:133-150之一的氨基酸序列。
[0017] 在另一个实施方式中，Tat衍生多肽与SEQ ID NOs 5-95之一的序列同一性高于 85%。在另一个实施方式中，Tat衍生多肽不是SEQ ID NOs:2、3或4之一。
[0018] 本文还公开了治疗癌症的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者施用治疗有 效量的本文所公开的Tat衍生多肽或药物组合物;和在所述受试者中引起癌症生长的停止 或癌症的消退。
[0019] 本文还公开了治疗有效量的Tat衍生多肽或药物组合物治疗有此需要的受试者中 的癌症的用途，从而在所述受试者中引起癌症生长的停止或癌症的消退。
[0020] 本文还公开了降低患有癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，所述方法包括：向有 此需要的受试者施用治疗有效量的本文所公开的Tat衍生多肽或药物组合物;和在所述受 试者中引起癌症的消退。
[0021] 本文还公开了治疗有效量的Tat衍生多肽或药物组合物降低患有癌症的受试者中 的肿瘤负荷的用途，从而在所述受试者中引起癌症的消退。
[0022] 本文还公开了抑制患有癌症的受试者中的抗肿瘤免疫应答的阻抑的方法，所述方 法包括：向受试者施用治疗有效量的本文所公开的Tat衍生多肽或药物组合物;其中所述施 用在所述受试者中引起癌症生长的降低或抑制或者癌症的消退。
[0023] 本文还公开了治疗有效量的Tat衍生多肽或药物组合物抑制患有癌症的受试者中 的抗肿瘤免疫应答的阻抑的用途，其中Tat衍生多肽的施用在所述受试者中引起癌症生长 的降低或抑制或者癌症的消退。
[0024] 本文还公开了治疗患有癌症的受试者中的表达PD-Ll的肿瘤的方法，所述方法包 括:施用治疗有效量的本文所公开的Tat衍生多肽或药物组合物;其中所述施用在所述受试 者中引起癌症生长的降低或抑制或者癌症的消退。
[0025] 本文还公开了治疗有效量的Tat衍生多肽或药物组合物治疗患有癌症的受试者中 的表达H)-L1的肿瘤的用途，其中Tat衍生多肽的施用在所述受试者中引起癌症生长的降低 或抑制或者癌症的消退。
[0026]在所述方法或用途的一个实施方式中，Tat衍生多肽与SEQ ID NOs 5-95之一的序 列同一性高于85%。
[0027]在所述方法或用途的一个实施方式中，Tat衍生多肽以多剂施用。在所述方法或用 途的另一个实施方式中，施用包括重复性施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中 施用多剂的Tat衍生多肽，之后是休息期，并且其中所述循环被重复多次。在所述方法或用 途的另一个实施方式中，施用包括重复性施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中 施用多剂的Tat衍生多肽，之后在确定的时间段中施用单剂或多剂的治疗剂，并且其中所 述循环被重复多次。在所述方法或用途的另一个实施方式中，治疗剂是环磷酰胺。
[0028] 在所述方法或用途的另一个实施方式中，癌症是肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、 星形细胞瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、 宫颈癌、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、促纤维增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、 食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤 (GIST)、妊娠滋养细胞瘤、胶质瘤、胃类癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽 癌、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨 球蛋白血症、髓母细胞瘤、黑色素瘤、默克细胞癌、间皮瘤、嘴癌、多发性骨髓瘤/浆细胞肿 瘤、蕈样肉芽肿、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口癌、口咽癌、卵巢癌、卵巢上皮 癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果腺星形细胞瘤、松果腺生殖细胞 瘤、成松果腺细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细 胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里(S6zary)综合征、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾 丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨 球蛋白血症（Wa丨denstrommacroglobulinemia)或韦尔姆斯氏瘤。
[0029] 在所述方法或用途的另一个实施方式中，至少一种来自受试者的治疗前肿瘤含有 至少5%的表达PD-Ll的细胞、5%-20%的表达I 3D-Ll的细胞、5%-15%的表达I3D-Ll的细胞 或5%-10%的表达I3D-Ll的细胞。 附图简介
[0030] 图1描述了用Tat衍生物对人类单核细胞的刺激。
[0031] 图2描述了用Tat衍生物刺激人类单核细胞的剂量应答曲线。
[0032]图3A和3B描述了Tat衍生物对4T1肿瘤体外生长的疗效。在注射肿瘤细胞后第0、7、 14和21 天，用Nani-Pl或Nani-P2(400ng，皮下[SC])(图3A)(图3A)或Nani-P3(400ng或2yg， SC)(图3B)处理注射了 I X IO4个4T1肿瘤细胞的BALB/c小鼠。对照组用I3BS处理。数据表示平 均肿瘤体积;棒土 SE。每组含有IO只小鼠。从第15天起，对照组和用Nani-P1或Nani-P2处理 的组之间的差异显著(P〈〇.〇5#)。从第22天开始，对照和Nani-P2或Nani-P2之间的差异高 度显著化〈0.01**)。他1^-?3(任一剂量)和对照之间无差异。
[0033]图4描述了经纯化的Nani_P2对4T1乳腺肿瘤体内生长影响的剂量应答曲线。对每 组十只BALB/c小鼠的四个组植入IX IO4个4T1细胞。三个组经21天在左侧被分别给予每只 小鼠四次〇.4ng、4ng和40ng的递增剂量。第四组对照组在左侧注射PBS。数据表示平均肿瘤 体积。对照组和〇.4ng剂量之间的差异显著(P〈0.5*)，对照组和4ng或40ng Nani-P2处理组 之间的差异高度显著(ρ〈〇· 1**，ρ〈〇·〇1**)。
[0034] 图5Α和5Β描述了用Nani-P2处理带有4Τ1乳腺肿瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活曲 线。第0天在乳腺垫(mammary pad)中对小鼠 SC注射I X IO4个4T1细胞。第0天用SC施用的四 次剂量的Nani-P2(40ng)开始处理。第42天，处理组具有超过对照的统计学显著更好的存活 (**)(图5A)。在一组中，治疗被延迟至第13天，此时一系列三次剂量的Nani-P2(40ng)被每 周静脉内（IV)施用、SC施用进引流淋巴结中或瘤内（IT)施用（图5B)。第47天IV Nani-P2的 存活益处(survival benefit)是高度统计学显著的（**)，同时SC Nani-P2的存活益处也是 统计学显著的(*)。
[0035] 图6A和6B描述了 TS/A和SMl乳腺癌模型中Nani-P2的抗肿瘤活性。对小鼠 SC植入1 \105个了3/^乳腺癌细胞（图64)，并用递增剂量的30似11卜?2(0.41^、41^和40即)处理。即 使在最低剂量时，原发性的抗癌差异也是高度显著的（P〈〇. 01**)，同时40ng剂量也是高度 显著的（P〈〇. 01#*)。图6B描述了SC植入2 X IO5个SMl乳腺癌细胞并在第0、7、14和21天用 Nani-P2(40ng)SC处理的小鼠。对照和用Nani-P2处理的SMl动物之间的原发性肿瘤生长差 异是高度统计学显著的(P〈〇.01***)。
[0036]图7描述了来自带有4T1乳腺肿瘤的小鼠脾细胞的INF- γ生产。对BALB/c小鼠 SC注 射I X IO4个4T1细胞。对照动物每周接受PBS注射，而Nani-P2处理包括每周一次的SC注射 (40ng)，从第0天开始持续4周。第33天当对照小鼠处于末期时，将小鼠处死，收获脾并作为 单细胞悬浮液冷冻，直至测定时。将脾细胞(2 X IO5个)和I X IO4个丝裂霉素 C处理(50μg/ml， 30分钟）的4T1刺激细胞(S)涂布在96孔平