一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法，包括：采用能够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。本发明还公开了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法的应用。本发明能够在保持细胞结构和功能完整性的前提下同时对多个指标进行检测，具有快速、高通量、低成本、高准确性的特点。
【专利说明】
一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物毒性检测领域，具体涉及一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒 性检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 中草药在我国应用于临床已有2000多年的历史，但其毒副作用的研究才刚刚起 步，药物毒性是在中药研发及临床使用过程中经常出现的不良反应。由于人们对中药安全 性问题认识存在不足，自行、长期、大量、盲目服用中草药导致的中药药源性损伤近期逐年 增多，肾脏因其所司功能和独特的血液循环特点是不良反应极易伤及的器官。对于药物早 期肾毒性的研究主要以动物或人与动物的肾脏细胞为实验模型。然而传统的动物毒理实验 存在时间长、成本高、通量低、动物使用量大、动物个体差异大、受实验伦理学制约等缺点。 常用的肾毒性细胞模型检测方法有MTT法、细胞周期检测、线粒体膜电位检测、细胞凋亡检 测等，这些方法指标单一，灵敏度低，难以适应中药成分复杂的特点。高内涵检测技术可以 在保持细胞结构和功能完整性的如提下同时对多个指标进彳丁检测，具有快速、尚通量、低成 本、高准确性的优势，且已成功应用于肝毒性、心脏毒性、神经毒性及遗传毒性评价，对早期 发现药物毒性，减少药物研发成本具有极大的价值。
[0003] 目前，尚无将高内涵检测技术应用于肾脏毒性评价的相关文献报道，针对与此，将 高内涵检测手段运用于肾毒性药物的检测，评价药物是否具有肾毒性，并尝试将此方法用 于文献查阅到的多种具有潜在肾毒性的中药单体成分检测，以验证方法的灵敏度和准确 性，从而为更为快速、经济有效的评价中药安全性提供更多的可能。
【发明内容】
[0004] 基于上述现有技术中存在的问题，本发明设计开发了一种基于细胞表型的高内涵 多指标肾毒性的检测方法，目的是通过高内涵检测技术应用于肾毒性的评价，在保持细胞 结构和功能完整的如提下同时对多个指标进彳丁检测，具有快速、尚通量、低成本、尚准确性 的特点。
[0005] 本发明还设计开发了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性的检测方法的应 用，从而为更为快速、准确、经济、有效的评价中药安全性提供更多的可能。
[0006] 本发明提供的技术方案为：
[0007] -种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，包括:采用能够对细胞核或 线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛选系统作 为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析，得出所述 待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。
[0008] 优选的是，所述待测药物包括：马兜铃酸A、环孢素 A和顺铂，计算检测浓度为0.01-lOOymol/L范围内对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响。
[0009]优选的是，所述待测药物样本用MEM基础培养基溶解稀释至O.Olwnol/L，配置于离 心管中，铝箱避光-20 °C密封保存。
[0010]优选的是，所述细胞为HEK293细胞，其用含10%胎牛血清、1%青链霉素的MEM培养 基培养，细胞在37 °C、5 % C02培养箱培养，每三天传代一次。
[0011 ] 优选的是，所述焚光分子探针为Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM或 Rhodaminel23〇
[0012] 优选的是，在所述成像分析时，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM 和/或Rhodamine 123通道进行活细胞成像。
[0013]优选的是，检测所述药物对所述细胞的影响时，计算细胞数量、细胞核面积、细胞 核圆度、线粒体质量和线粒体膜电位指标，考察药物对细胞的影响。
[0014] 优选的是，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括:细胞接种于孔板之 后，收集对数生长期细胞，以1 X 104个/mL浓度加入培养板，100yL/孔，37 °C，5 % C02培养箱中 培养24h后加入用MEM基础培养基稀释的所述待测药物，37 °C避光，5 % C02培养24小时后，加 入含Hoechst 33342和Mitotracker Deep Red FM的MEM基础培养基50yL/孔，37°C避光，5% C〇2培养30min，再加入含Rhodamine 123的MEM基础培养基100yL/孔，37 °C避光，5 %⑶2培养 30min，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道进行活细 胞成像，对图像进行采集，计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量、线粒体膜 电位5个指标的IC 5Q值检测对细胞的影响。
[0015] -种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法的应用，用于具有肾毒性中药 单体的筛选。
[0016] 优选的是，对所述中药单体对细胞的影响检测选择细胞数量、细胞核面积、细胞核 圆度、线粒体质量和线粒体膜电位5个指标的IC 5〇值。
[0017] 本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：
[0018] 在发明中通过高内涵多指标肾毒性检测方法的建立过程中，分别选择了马兜铃酸 A、环孢素 A和顺铂三种机理不同且临床有不同用途但都以其严重的肾脏毒性而使用受限的 药物及通过本方法对2种具有肾毒性报道但机理尚不明确的中药单体进行检测，本发明所 测得的阳性药半数致死量与文献报道接近，并且单体筛选检测浓度低，效果明显，证明基于 多指标高内涵所建立的肾毒性检测方法相较其他传统方法而言，具有检测更灵敏、结果更 准确、评价指标更加全面并且操作更方便的优势，并且在保持细胞结构和功能完整性的前 提下，可以同时对细胞核和线粒体的形态和功能等多个指标进行精确的检测及分析，也不 受不同药物对肾脏毒性的不同损害机理的限制，为中药及其单体成分肾毒性研究做出初步 判断，可成功应用于中药单体成分及中药新药的毒性评价与筛选。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所述3种阳性待测药物的高内涵代表图像。
[0020] 图2a为3种阳性药对细胞存活率变化情况的量效关系曲线，数据表示为:mean ± SEM，n = 4 〇
[0021] 图2b为3种阳性药对线粒体质量变化情况的量效关系曲线，数据表示为:mean± SEM，n = 4 〇
[0022]图2c为3种阳性药对线粒体膜电位变化情况的量效关系曲线，数据表示为:mean土 SEM，n = 4 〇
[0023]图2d为3种阳性药对细胞核面积变化情况的量效关系曲线，数据表示为:mean± SEM，n = 4 〇
[0024] 图2e为3种阳性药对细胞核圆度变化情况的量效关系曲线，数据表示为:mean± SEM，n = 4 〇
[0025] 图3为雷公藤甲素和斑蝥素的高内涵代表图像。
[0026] 图4a为雷公藤甲素和斑蝥素对存活率变化情况的量效关系曲线，数据表示为： mean 土 SEM，n = 3〇
[0027] 图4b为雷公藤甲素和斑蝥素对线粒体质量变化情况的量效关系曲线，数据表示 为：mean 土 SEM，n = 3〇
[0028] 图4c为雷公藤甲素和斑蝥素线粒体膜电位变化情况的量效关系曲线，数据表示 为：mean 土 SEM，n = 3〇
[0029] 图4d为雷公藤甲素和斑蝥素细胞核面积变化情况的量效关系曲线，数据表示为： mean 土 SEM，n = 3〇
[0030] 图4e为雷公藤甲素和斑蝥素细胞核圆度变化情况的量效关系曲线，数据表示为： mean 土 SEM，n = 3〇
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0032] 本发明提供了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，包括:采用能 够对细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内 涵筛选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分 析，得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影 响。
[0033] 在另一种实施例中，所述待测药物包括：马兜铃酸A、环孢素 A和顺铂，计算检测浓 度为0.0 l-lOOMiol/L范围内对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响。
[0034] 在另一种实施例中，所述待测药物样本用MEM基础培养基溶解稀释至O.Olwnol/L， 配置于离心管中，铝箱避光_20°C密封保存。
[0035]在另一种实施例中，所述细胞为HEK293细胞，其用含10 %胎牛血清、1 %青链霉素 的MEM培养基培养，细胞在37 °C、5 % C02培养箱培养，每三天传代一次。
[0036] 在另一种实施例中，所述焚光分子探针为Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM或Rhodamine123 〇
[0037] 在另一种实施例中，在所述成像分析时，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道进行活细胞成像。
[0038] 在另一种实施例中，检测所述药物对所述细胞的影响时，计算细胞数量、细胞核面 积、细胞核圆度、线粒体质量和线粒体膜电位指标，考察药物对细胞的影响。
[0039] 在另一种实施例中，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括:细胞接种 于孔板之后，收集对数生长期细胞，以1 x 104个/mL浓度加入培养板，lOOyL/孔，37 °C，5 % C〇2 培养箱中培养24h后加入用MEM基础培养基稀释的所述待测药物，37°C避光，5%C02培养24 小时后，加入含Hoechst33342和Mitotracker Deep Red FM的MEM基础培养基50yL/孔，37°C 避光，5 % C02培养30min，再加入含Rhodamine 123的MEM基础培养基1 OOyL/孔，37 °C避光，5 % C〇2培养30min，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道 进行活细胞成像，对图像进行采集，计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量、 线粒体膜电位5个指标的IC 5Q值检测对细胞的影响。
[0040] 本发明还提供了一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法的应用，用于 具有肾毒性中药单体的筛选。
[0041] 在另一种实施例中，对所述中药单体对细胞的影响检测选择细胞数量、细胞核面 积、细胞核圆度、线粒体质量和线粒体膜电位5个指标的IC 5Q值。实施例
[0042] 1材料与方法
[0043] 1.1实验材料与仪器
[0044] 表1.实验材料
[0049] 1.2实验方法
[0050] 1 ? 2 ? 1HEK293细胞培养
[00511根据中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库推荐细胞培养条件，HEK293细 胞用含10%FBS、1 %青链霉素的MEM培养基培养，细胞在37°C，5 %C02培养箱培养，每三天传 代一次。
[0052] 1.2.2细胞传代
[0053] 细胞隔天传代，传代时弃去原培基，4mL FBS漂洗2次，加入3mL胰蛋白酶，37 °C消化 lmin;轻拍瓶壁使细胞脱落，加入3mL全培养基终止消化;倒入无菌离心管，1000r离心3min; 弃上清液，加入3mL全培养基重悬均匀后，取lmL细胞悬液加入75cm2培养瓶，补加10mL全培 养基，放入37 °C，5 % C〇2培养箱中培养。
[0054] 1.2.3样品配置
[0055]马兜铃酸A (AA)、环孢素 A(CsA)、顺铂(CDDP)分别用含MEM基础培养基溶解并逐级 稀释至实验所需浓度;根据文献报道，AA、CsA、CDDP的EC5Q分别为20μg/ml，5~50WI1O1/L，10-50wnol/L，因此，选择根据药物EC 5Q浓度选择0.01-100_〇1/L作为阳性药实验浓度;根据文 献查阅，选定斑蝥素及雷公藤甲素有关于肾毒性报道的中药单体成分进行毒性筛选，所有 样本用MEM基础培养基溶解稀释至O.Olwnol/L，配置于EP管中，铝箱避光-20°C密封保存待 用。
[0056] 1.2.4高内涵多指标肾毒性检测方法的建立与优化
[0057]在96孔黑色透底细胞培养板中每孔加入0. lmg ? ml^D-型多聚赖氨酸溶液50yL;包 被过夜后吸出剩余液体，无菌FBS溶液漂洗3次;收集对数生长期细胞，以1 X 104个/mL浓度 加入培养板，1〇〇此/孔;37°C，5 %C〇2培养箱中培养24h;弃去培养基，分别加入用MEM基础培 养基稀释的待测药物1〇〇此/孔，37°C避光，5%⑶ 2培养24h;加入含浓度为1.67yg ? ml/1的 11〇6(*8七33342以及浓度为0.08虚〇1/1的組七(^瓜〇1^1〇66口1^(1?]\1的]^]\1基础培养基50此/ 孔，37 °C避光，5 % C02培养30min;弃去培养基，加入含1 ? 26yg ? mL-1的Rhodamine 123的MEM基 础培养基1〇〇此/孔，37 °C避光，5 %⑶2培养30min;弃去培养基，MEM培养基100此/孔漂洗1 次；高内涵筛选系统选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和Rhodamine 123 3个 通道进行活细胞成像。
[0058] 选择计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量、线粒体膜电位5个指 标，考察药物对细胞的影响。
[0059] 1.2.5统计方法
[0060] 作为一种优选，高内涵拍摄图像用Harmony 3.0软件计算为量化数据，采用SPSS 17.0数据统计软件，对数据进行正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析，分析方法为 LSD，以P<0.05为具有显著差异，以P<0.01为具有极显著差异。
[0061 ] 2实验结果
[0062] 2.1阳性药高内涵实验结果
[0063] 2.1.1阳性药高内涵图像采集结果
[0064] 3种阳性药高内涵图像采集结果如图1所示;其中，图a、e、i、m为空白组细胞图像， 图b、f、j、n为马兜铃酸A组细胞图像，图c、g、k、〇为环孢素 A组细胞图像，d、h、1、p为顺铂组细 胞图像，从图片中可观察到三个阳性药的细胞数量（图bed)明显少于空白对照组（图a)，且 从放大的n、o、p图中可看到细胞核形态的明显改变，其中〇图可见明显的细胞皱缩。
[0065] 2.1.2阳性药对所测各指标量效关系结果
[0066] 3种阳性药对各指标的量效关系曲线如图2所示，其中，图a为细胞存活率变化情 况，图b为线粒体质量变化情况，图c为线粒体膜电位变化情况，图d为细胞核面积变化情况， 图e为细胞核圆度变化情况;从图2a~2e中可看出，各阳性药对细胞存活率的IC 5Q分别为马 兜铃酸A 6.474yM、环孢素 A61.90yM、顺铂8.288yM(图2a);引起线粒体质量增高的IC5〇值为 马兜铃酸Al.420yM、环孢素 A 33.68yM、顺铂4.029yM(图2b);引起线粒体膜电位下降的IC50 值为马兜铃酸A 8.861yM、环孢素 A 12.03yM、顺铂25.51yM(图2c);引起细胞核面积下降的 IC5Q值为马兜铃酸A 145.8虚、环孢素 A 30.17虚、顺铂3.447 X 106虚(图2d);引起细胞核圆 度变化的IC5Q值分别为马兜铃酸A7.326yM、环孢素 A 13.81yM、顺铂5.132yM(图2e);其中，除 AA和CDDP的细胞核面积IC5Q值与相应的其它指标值相比较大以外，其余各指标IC5Q值均较 接近，并且跟文献报道的药物引起细胞凋亡的EC 5Q值接近。
[0067] 2.2中药单体成分高内涵肾毒性筛选结果
[0068] 2.2.1中药单体成分高内涵图像采集结果
[0069] 作为一种优选，以肾毒性较明确的雷公藤甲素(TR)和斑蝥素(CA)的图像采集结果 作为代表，如图3所示，雷公藤甲素和斑蝥素单体成分均以l(T 8Mol/L的较小浓度进行筛选， 图a、d、g、j为空白组细胞图像，图b、e、h、k为斑蝥素组细胞图像，图c、f、i、l为雷公藤甲素组 细胞图像，从图片中可观察到b、c图中细胞数量明显少于a图，且从放大的j、k、l图中可看到 细胞核形态的明显改变，其中k图可见明显的细胞皱缩，1图中可以看出细胞核明显变大。
[0070] 对具体各指标的影响分别如图4a~图4e所示，以雷公藤甲素和斑蝥素为代表，对 其量效关系进行考察，在l(T4-l(r 8M〇l/L浓度范围内，计算所得药物对细胞存活率的1(：50分 别为斑蝥素8.689yM、雷公藤甲素0.09466yM(图4a);引起线粒体质量增高的IC 5q值为斑蝥素 ~5665yM、雷公藤甲素29.88yM(图4b);引起线粒体膜电位下降的IC5Q值为斑蝥素50.19yM、 雷公藤甲素〇. 1863yM(图4c);而斑蝥素引起细胞核面积皱缩的IC5Q值为51.15yM，雷公藤甲 素引起核面积肿胀的IC5〇值为0.006012yM(图4d);两药引起细胞核圆度变化的IC 5〇值分别 为斑蝥素~8875yM、雷公藤甲素0.0484yM(图4e);结果证明，两药均能在较低浓度下引起各 指标的明显变化，与筛选结果中l(T 8Mol/L浓度即能引起细胞数量下降及形态改变一致，验 证了实验所建立的基于细胞表型的高内涵多指标检测方法的准确性。
[0071] 3 ?小结
[0072] 在本实验高内涵多指标肾毒性检测方法建立过程中，我们分别选择了马兜铃酸A、 环孢素 A和顺铂三种机理不同且临床有不同用途但都以其严重的肾脏毒性而使用受限的药 物及对2种具有肾毒性报道但机理尚不明确的中药单体进行检测。实验以HEK293为细胞模 型准确的表现了这三种药物在不同浓度下对细胞表型变化的影响。从实验结果可见，在三 种阳性药作用下，细胞存活率均随药物浓度上升而逐渐下降；线粒体质量随药物浓度升高 而逐渐升高；线粒体膜电位随药物浓度升高而降低;细胞核面积和细胞核圆度也随着药物 的浓度升高发生一定的改变。表明这3个阳性药对细胞核和线粒体功能产生了一定影响，进 而引起细胞凋亡，并且用所建立方法对2种中药单体成分进行检测时，虽然检测浓度极低， 从这些结果中可见，2种单体成分对细胞核和线粒体造成了不同程度的损伤。
[0073] 由于本实验所测得的阳性药半数致死量与文献报道接近，并且单体筛选检测浓度 较低，效果较明显，证明基于多指标高内涵所建立的肾毒性检测方法相较其他传统方法而 言，具有检测更灵敏、结果更准确、评价指标更加全面并且操作更方便的优势，可以同时对 细胞核和线粒体的形态和功能进行精确的分析，为中药及其单体成分肾毒性研究做出初步 判断，可成功应用于中药单体成分及中药新药的毒性评价与筛选。
[0074] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，包括:采用能够对 细胞核或线粒体功能改变进行特异性检测的荧光分子探针对细胞进行标记，并以高内涵筛 选系统作为检测手段，基于高内涵筛选系统对已经加入待测药物的活细胞进行成像分析， 得出所述待测药物对细胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响，从而判断对细胞的影响。2. 如权利要求1所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所 述待测药物包括:马兜铃酸A、环孢素 A和顺铂，计算检测浓度为O.Ol-lOOymol/L范围内对细 胞数量、细胞核及线粒体的至少一种影响。3. 如权利要求1或2所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在 于，所述待测药物样本用MEM基础培养基溶解稀释至Ο.ΟΙμ mol/L，配置于离心管中，铝箱避 光-20°C密封保存。4. 如权利要求3所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所 述细胞为HEK293细胞，其用含10 %胎牛血清、1 %青链霉素的MEM培养基培养，细胞在37°C、 5 % C〇2培养箱培养，每三天传代一次。5. 如权利要求4所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，所 述焚光分子探针为Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM或Rhodaminel23〇6. 如权利要求4或5所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在 于，在所述成像分析时，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/SRhodamine 123通道进行活细胞成像。7. 如权利要求6所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法，其特征在于，检 测所述药物对所述细胞的影响时，计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量和 线粒体膜电位指标，考察药物对细胞的影响。8. 如权利要求1、2和7中任一项所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法， 其特征在于，所述高内涵筛选系统作为检测手段，具体操作包括:细胞接种于孔板之后，收 集对数生长期细胞，以I X IO4个/mL浓度加入培养板，IOOyL/孔，37°C，5%⑶2培养箱中培养 24h后加入用MEM基础培养基稀释的所述待测药物，37°C避光，5 %C02培养24小时后，加入含 Hoechst 33342和Mitotracker Deep Red FM的MEM基础培养基50yL/孔，37°C避光，5%C〇2 培养30min，再加入含Rhodaminel23的MEM基础培养基IOOyL/孔，37°C避光，5%C〇2培养 30min，选择Hoechst 33342、Mitotracker Deep Red FM和/或Rhodamine 123通道进行活细 胞成像，对图像进行采集，计算细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量、线粒体膜 电位5个指标的I C5q值检测对细胞的影响。9. 一种基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法的应用，其特征在于，用于具有 肾毒性中药单体的筛选。10. 如权利要求9所述的基于细胞表型的高内涵多指标肾毒性检测方法的应用，其特征 在于，对所述中药单体对细胞的影响检测选择细胞数量、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体 质量和线粒体膜电位5个指标的IC 5Q值。
【文档编号】G01N21/64GK105928913SQ201610235316
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】朱彦, 王萌, 任晓亮, 高秀梅, 崔英, 姜苗苗, 王晓明, 邵瑞, 郭晓, 张慧杰, 谭乐俊
【申请人】天津中医药大学