一种肿瘤抗原肽及其在诊断和药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤抗原肤。更具体地，本发明涉及肿瘤抗原蛋白（乳头瘤病毒结合 因子，PBF)的片段肤和其基因在癌症免疫领域中的用途。
【背景技术】
[0002] 细胞免疫，特别是细胞毒性T细胞（下文中称为CTL)在从活体中清除肿瘤细 胞、病毒感染的细胞等中发挥重要作用。CTL识别肿瘤细胞上的抗原肤（肿瘤抗原肤）和 MHC(主要组织相容性复合体）I类抗原（在人中其被称为HLA抗原）的复合物，并攻击和杀 死肿瘤细胞。
[0003]当细胞内合成肿瘤特异性蛋白（即肿瘤抗原蛋白质）后，该肿瘤特异性蛋白通过 蛋白酶的细胞内降解产生肿瘤抗原肤。得到的肿瘤抗原肤与内质网中的MHCI类抗原化LA 抗原）结合W形成复合物，其被运输至细胞表面并作为抗原呈递。当肿瘤特异性CTL识别 了作为抗原呈递的复合物时通过细胞毒性作用或淋己因子的产生展示抗肿瘤作用。对一系 列送些作用的阐明使通过使用肿瘤抗原蛋白或肤作为所谓的癌症免疫治疗剂（癌症疫苗） 在具有肿瘤的患者中提高肿瘤特异性CTL的疗法成为可能。
[0004] 作为代表性实例，肿瘤抗原蛋白包括文献Immunity,vol. 10:281，1999的表1中 所列的郝些。此外，识别乳头瘤病毒的E2结合位点的乳头瘤病毒结合因子（PBFHGenBank 数据库登记号AF263928)作为可应用于包括肉瘤（例如骨肉瘤）的癌症（肿瘤）的肿瘤抗 原蛋白被报导（参考专利文件1，国际公开号W0 04/029248)。另外，鉴定了结合HLA-A24 或HLA-B55抗原的肿瘤抗原肤。国际公开号为W02010/047310的专利文件2公开了结合 HLA-A2抗原的PBF来源的肿瘤抗原肤，然而其作为癌症诊断或治疗的抗原肤的活性还不够 强，不能完全满足癌症免疫领域的用途。
【发明内容】
[0005] 本发明者基于GenBank数据库登记号为AF263928的乳头瘤病毒结合因子（PBF)， 及专利文件2公开的内容，进行深入研究。通过大量试验，棍奇的发现了一种肿瘤抗原肤， 其作为癌症诊断或治疗的抗原肤的活性明显强于专利文件2公开的肿瘤抗原肤。因此，本 发明的目的在于提供一种肿瘤抗原肤及其在诊断和药物中的用途。
[0006] 本发明者证明了所述肿瘤抗原肤可用作在体内或体外诱导CTL的试剂，即癌症疫 苗，并且所述肿瘤抗原肤对肿瘤（例如骨肉瘤、肾癌和其它肿瘤）发挥治疗或改善作用。所 述肿瘤抗原肤也用作肿瘤（例如骨肉瘤、肾癌和其它肿瘤）的肿瘤标记物。
[0007] 本发明包括W下内容：
[0008] 在第一方面，本发明提供一种肿瘤抗原肤，其氨基酸序列如SEQIDNO;1所示。
[0009]AlaMetProSerPheGinlieProVal(SEQIDN0：l)〇
[0010] 在第二方面，本发明提供一种编码如SEQIDNO;1所示的氨基酸序列的多核巧酸， 优选地，所述多核巧酸的核巧酸序列如SEQIDNO;2所示。
[0011]GCTATGCCATCCTTCCAGATCCCAGTC(SEQIDNO：2)〇
[0012] 由于密码子的简并性，本发明的多核巧酸还包括郝些虽然与SEQIDNO;2所示的 序列不同，但也编码SEQIDNO;1所示的氨基酸序列的多核巧酸。
[0013] 在第Η方面，本发明提供一种用于诱导细胞毒性T细胞的试剂，所述试剂包含如 第一方面所述的肿瘤抗原肤和/或第二方面所述的多核巧酸作为活性成分。
[0014] 在第四方面，本发明提供一种产生抗原呈递细胞的方法，所述方法包括将如第一 方面所述的肿瘤抗原肤和/或第二方面所述的多核巧酸与具有抗原呈递能力的细胞在体 外接触。
[0015] 在第五方面，本发明提供一种由如第四方面所述的方法产生的抗原呈递细胞。
[0016] 在第六方面，本发明提供一种诱导细胞毒性Τ细胞的方法，所述方法包括将如第 一方面所述的肿瘤抗原肤和/或第二方面所述的多核巧酸与外周血淋己细胞在体外接触。
[0017] 在第走方面，本发明提供一种由如第六方面所述的方法诱导产生的细胞毒性Τ细 胞。
[0018] 在第八方面，本发明提供一种抗体，所述抗体特异性结合如第一方面所述的肿瘤 抗原肤。
[0019] 在第九方面，本发明提供一种包含如第一方面所述的肿瘤抗原肤和HLA抗原的 HLA四聚体。
[0020] 在第十方面，本发明提供一种肿瘤标记物，所述肿瘤标记物包括如第一方面所述 的肿瘤抗原肤、第二方面所述的多核巧酸或与其互补的多核巧酸、第八方面所述的抗体和 第九方面所述的HLA四聚体中的一种或多种。
[0021] 本发明提供的肿瘤标记物中，所述肿瘤优选为肉瘤或肾癌。
[0022] 在第十一方面，本发明提供一种用于肿瘤诊断的试剂，所述试剂包含如第十方面 所述的肿瘤标记物。
[0023] 在第十二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所 述的肿瘤抗原肤、第二方面所述的多核巧酸、第五方面所述的抗原呈递细胞、第走方面所述 的细胞毒性Τ细胞、第八方面所述的抗体、第九方面所述的HLA四聚体中的一种或多种。
[0024] 在第十Η方面，本发明提供如第一方面所述的肿瘤抗原肤在制备诱导细胞毒性Τ 细胞的药物中的用途。
[00巧]本发明的有益效果：
[0026] 本发明提供了一种肿瘤抗原肤和其基因，可作为用于诱导CTL的试剂和肿瘤标记 物。本发明提供的用于诱导CTL的试剂在肿瘤（例如骨肉瘤、肾癌和其它肿瘤）的治疗中 有用，肿瘤标记物在肿瘤的诊断中有用。
【附图说明】
[0027] 图1为显示了CTL5A9的肤-特异性细胞毒性活性的图。其中，纵坐标表示细胞毒 性活性（％特异性裂解），横坐标表示CTL5A9细胞（效应物）数和祀细胞数的比例。
[0028] 图2为显示了CTL5A9细胞（效应物）对癌细胞系扣20S、0S2000和Κ562)的细胞 毒性作用的图。符号"+ "和表示有关各个细胞系的PBF表达与否、HLA-A0201表达与 否和IFN-Y处理与否。通过变化的效应物；祀比例测定了CTL5A9对各个细胞系的细胞毒 性活性。
【具体实施方式】
[002引1、本发明提供的肤
[0030] 本发明提供的肤（在下文可能被称为"本发明的肤"）为包含与SEQ ID NO: 1的氨 基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的肿瘤抗原肤，并且本发明的肤为上述PBF蛋白质 的肤片段的变异体，并具有结合HLA抗原、优选HLA-A2抗原从而使所述肤被CTL识别的活 性。
[0031] 本文中，"基本相同的氨基酸序列"组成的肤与由SEQIDNO: 1的氨基酸序列组成 的肿瘤抗原肤发挥类似的活性，而对其氨基酸序列没有特别限巧[|。例如，基本相同的氨基酸 序列可W是SEQIDNO: 1的氨基酸序列中的第二位氨基酸具有鄉氨酸、异亮氨酸或谷氨醜 胺取代的或在C-端氨基酸具有亮氨酸取代的氨基酸序列。就此而论，关于HLA-A2类型的 HLA(例如HLA-A0201、-A0204、-A0205、-A0206和-A0207)，呈递的抗原肤序列的通常模式 (即基序）是已知的（Immunogenetics, 41,P. 178, 1995 ;和J.Immunol.,155,P. 4749, 1995， 其在此处引入作为参考）。
[0032] 本发明的肤可W通过宿主细胞表达或者人工合成获得。优选地，所述肤具有不超 过11个氨基酸，更优选9个氨基酸的长度。
[0033] 可依照在常规肤化学中使用的方法合成本发明的肤。送些已知方法典型的例 子包括下列文献中描述的方法；P巧tide Synthesis, Interscience, New York,1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc. , New化rk,1976;阳PUCHIDO GOSEI [Peptide Synthesis], Maruzen Co. , Ltd., 1975；PEPUCHID0 GOSEI NO KISO TO ZIKKEN[Basics and Experiments for Peptide Synthesis],Maruzen Co. , Ltd., 1985; lYAKUHIN NO KAIHATSU, ZOKU[Developments of Pharmaceuticals, 2nd Series],vol.14:PEPUCHIDO G0SEI[Peptide Synthesis],Hirokawa Publishing Co.,1991，其在此处引入作为参考。
[0034] 通过测定肤与HLA-A2抗原的复合物能否被CTL识别，可奶则定本发明的肤是否具 有作为肿瘤抗原肤的活性。一种典型的方法例如J.Immunol.，154,P. 2257, 1995 (其在此处 引入作为参考）中描述的方法。根据所述方法，从对HLA-A2抗原呈阳性的人中分离外周血 淋己细胞，在体外加入候选肤刺激，可W确认由候选肤脉冲（pulsed)的特异性识别HLA-A2 抗原-阳性细胞的CTL的诱导。在此情况下，通过化ISA或类似方法测量CTL响应抗原 肤-呈递细胞而产生的各种细胞因子（例如IFN-Y)的量可测定送些CTL是否已被诱导。 可选地，通过测量CTL对用Μ化标记的抗原肤-呈递细胞的细胞毒性活性也可测定CTL的 诱导（51化释放实验，Int.J.Cancer, 58,Ρ.317, 1994,其在此处引入作为参考）。
[0035] 对上述CTL而言，除了使用肤刺激人外周血淋己细胞制备的CTLW外，也可使用通 过例如在Int.J.Cancer, 39, 390-396, 1987;和N.化g.J.Med, 333, 1038-1044, 1995 (其在此 处引入作为参考）中描述的方法所建立的CTL。
[003引通过使用用于人的动物模型的实验（(W0 02/47474,和Int J.Cancer, 100, 565-570 (2002)，其在此处引入作为参考）可测定本发明的肤的体内活性。
[0037] 此外，本发明的肤包括偶联了多个包括本发明的肤的表位的肤（即多表位肤）。因 此，具有CTL诱导活性的多表位肤也可为本发明的肤的特定实例。
[0038] 本文中，多表位肤可W定义如下：
[0039]ω本发明的肤和任意多个其它PBF来源的CTL表位（肿瘤抗原肤）偶联得到的 肤；
[0040] 扣）本发明的肤和辅助表位偶联得到的肤；或
[0041] (iii)本发明的肤、任意多个其它PBF来源的CTL表位（肿瘤抗原肤）和另外的辅 助表位偶联得到的肤，并且其经历抗原呈递细胞中的细胞内加工从而使得到的呈递在抗原 呈递细胞上的肿瘤抗原肤诱导CTL。
[0042] 在与本发明的肤连接的表位为辅助表位的情况下，辅助表位具有13至30个氨 基酸左右、优选13至17个氨基酸左右的长度，可使用的辅助表位例如来源于己肝病毒的 皿VC128-140和来源于破伤风毒素的TT947-967。
[0043] 上述多表位肤可通过如上所述的用于肤合成的常规方法制备，也可W使用常规 DNA合成和基因工程程序基于编码多表位肤的多核巧酸的序列信息制备。也就是说，可通过 下述方法制备多表位肤；将多核巧酸插入熟知的表达载体；用得到的重组表达载体转化宿 主细胞；培养得到的转化体；和从培养物中收集偶联多个表位的期望多表位肤。例如，该程 序可W依照在W下文献MolecularCloning,T.Maniatis等人，C甜L油oratory(1983);和 DNACloning,DM.Glover,I化PRESS(1985)中描述的方法进行，其在此处引入作为参考。
[0044] 制备的偶联多个表位的多表位肤诱导CTL的活性，可W通过上面提及的肤的体外 实验或肤的体内实验使用在W0 02/47474和IntJ.Cancer, 100, 565-570(2002)(其在此处 引入作为参考）中描述的用于人的动物模型来测定。
[0045] 2、本发明提供的核酸
[0046] 本发明提供的核酸（在下文中可能被称为"本发明的核酸"）包含编码本发明的上 述肤的多核巧酸。<