专利名称：：利用栗精胺提高抗体依赖性细胞毒性的方法利用栗精胺提高抗体依赖性细胞毒性的方法相关申请的交叉参考利用免疫药物除去靶细胞群是许多征兆中的重要治疗干细胞裂解、凋亡信号传导通路的激活、存活所需的信号传导通路的阻断以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC),也被称作Fc依赖性细胞毒性。ADCC是有效的机制，这被认为对于许多免疫药物的效力而言是重要的。00041ADCC激活的机制包括Fc受体结合免疫药物分子，其中免疫药物分子结合到靶细胞的表面。Fc受体与免疫药物的结合可以被免疫球蛋白的恒定区中的结构域介导，例如CH2和/或CH3结构域。不同类型的恒定区可以结合不同的Fc受体。例子包括IgGlFc结构域结合同源Fc受体CD16(FcyRIII)、CD32(FcyRII-Bl和画B2)以及CD64(FcyRI)，IgAFc结构域结合同源Fc受体CD89(FcaRI),IgE结构域结合同源Fc受体FcsRl和CD23。在糖蛋白中，糖可以结合到三肽基序Asn-X-Thr/Ser中天冬酰胺的侧链中酰胺氮原子。这种类型的糖基化，被命名为N-连接的糖基化，其是在内质网(ER)中以多个单糖添加到磷酸长醇上形成14-残基支链的糖复合物开始的。接着，这种糖复合物被通过寡糖转移酶(OST)复合物转移到蛋白质上。在糖蛋白离开ER内腔之前，从14-残基寡糖去除三个葡萄糖分子。酶ER葡糖苷酶I、ER葡糖苷酶II和ER甘露糖香酶参与ER处理。00071随后，肽被转运到高尔基复合体，在此处N-连接的糖链被以许多不同的方式修饰。在高尔基体的顺(cis)区室、中间(medial)区室中，原始的14-糖类N-连接的复合物可以通过被除去甘露糖(Man)残基而修整，通过添加N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac)和/或岩藻糖(Fuc)残基而延长。通常各种形式的N-连接糖具有共同的由3个甘露糖和2个N-胰腺氨基葡萄糖残基构成的五糖核心。最后，在高尔基反(trans)区域中，可以添加其他GlcNac残基，随后是半乳糖(Gal)和末端唾液酸(Sial)。在高尔基复合体中的糖处理被称作"末端糖基化"以将其与ER中发生的"核心糖基化，，区分开。可以在许多形式和结构上发生最终的复合物糖单元，其中某些具有2个、3个或4个直链(被称作双触角、三触角或四触角)。许多酶参与高尔基体处理，其包括高尔基甘露糖苷酶IA、IB和IC，GlcNAc-转移酶I,高尔基甘露糖苷酶II,GlcNAc-转移酶II，半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。某些提议的用于生产岩藻糖含量较低的免疫球蛋白的方法对于制造对于治疗症状具有最佳ADCC活性的生物药物具有显著的缺陷。例如，使用除去岩藻糖残基的酶(岩藻糖普酶)包括额外的昂贵的制造步骤，其具有潜在的显著经济和药物连贯性风险。细胞系的分子改造以敲除参与合成岩藻糖基化糖蛋白的酶在目前的实践中要求特殊的宿主林不能"可调地"生产ADCC能力不同的药物以调节治疗应用的效力和安全性。未增强ADCC产品的比较的产生是昂贵且耗时的。使用RNAi或反义分子处理细胞系以降低(knockdown)这些关4建酶的水平可能具有意想不到的脱靶效应，并如果真正在制造水平上执行将是昂贵的。因此，一直存在需要有利的方法用于制备ADCC增强的免疫药物以及这样所产生的改善的免疫药物用于治疗用途。发明概述本发明提供了培养基和大规模细胞培养方法用于改善免疫糖蛋白的性质包括效应子功能例如ADCC和/或糖基化特征例如岩藻糖含量的降低。本发明还提供了通过这些方法所产生的改善的免疫糖蛋白，以及这些免疫糖蛋白在治疗疾病中的应用。0012]在某些实施方式中，本发明提供了用于提高宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，其通过将宿主细胞培养在含有浓度为大约25至大约800|tiM之间，或者在大约100至大约500)iM之间，或在大约100至大约400之间，或在大约100至大约300|iM之间的栗精胺(castanospermine)的培养基中。在示范性实施方式中，ADCC被提高至少2倍、3倍、4倍或5倍。在相关的实施方式中，本发明提供了提供了提高宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的CD16结合的方法，其通过将宿主细胞培养在含有浓度为大约25至大约800pM之间，或者在大约100至大约500liiM之间，或在大约100至大约400]LiM之间，或在大约100至大约300IliM之间的栗精胺的培养基中。在示范性实施方式中，CD16结合被提高了至少50%、75%、100%、125%、150%、175%或200%。0014]在本发明的方法中，细胞生长、活力和/或密度不受显著影响(例如保持未处理的细胞的至少80%或更高)。培养基中免疫糖蛋白产生的水平可以为至少100|iig/mL、125ng/mL或150pg/mL。0015]在任意前述实施方式中，培养基可以是基本上无血清的并且可以包含第二糖修饰剂(carbohydratemodifier)。可以通过改变应用到细胞培养的糖修饰剂例如栗精胺的浓度或持续时间而调控对ADCC的相对影响，这提供了相对于通过改变糖基化而改善ADCC的传统方法的额外优势。可以使用本领域中已知的检验对ADCC活性进行测量和表达，在示范性的实施方式中提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。00201糖基化和糖含量已知影响多种免疫球蛋白效应子介导的功能包括ADCC、CDC和循环半衰期。本文所描述的数据显示本发明的方法令人吃惊地能够提供表现出改善的ADCC而不影响CDC或半衰期的免疫糖蛋白。因此，在示范性的实施方式中，免疫糖蛋白分子组合物的ADCC得到提高，但其他免疫球蛋白型效应子功能例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或延长的循环半衰期仍类似或未被显著影响(例如提高或降低低于2倍，或提高或降低低于50%、40%、30%、20%或10%)。可以将免疫糖蛋白分子组合物的Fc受体结合测定为糖修饰剂处理的免疫糖蛋白分子对比未处理的免疫糖蛋白分子结合CD16的相对比例。下面在实施例中描述了示范性检验。在示范性实施方式中Fc受体结合提高了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。才艮据本发明使用糖+多饰剂例如栗精胺处理的宿主细胞所产生的免疫糖蛋白组合物将以比未经此处理的宿主细胞所产生的免疫糖蛋白组合物在FcR结合检验中高的亲和力结合CD16(高和低亲和力形式即在氨基酸158处为V或F)和/或CD32a或b和/或CD64。本文显示，Fc受体结合亲和力的这种提高与ADCC活性的提高相关。00221本发明还提供了用于改变免疫糖蛋白的糖含量/糖基化特征和/或降低岩藻糖含量的方法，其通过将宿主细胞培养在体积为至少750mL、1L、2L、3L、4L、5L、IOL、15L、20L或更多含有糖修饰剂例如栗精胺的培养基中，其中糖修饰剂的浓度能够降低免疫糖蛋白组合物的总岩藻糖含量和/或改变其糖基化特征。在培养基中糖修饰剂例如栗精胺的示范性终浓度为低于800(iM,或低于750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10jxM。00231可以通过改变应用到细胞培养的糖修饰剂例如栗精胺的浓度或持续时间而调控对岩藻糖含量的相对影响。组合物的总岩藻糖含量可以被表达为未岩藻糖基化免疫糖蛋白与组合物中免疫糖蛋白总数目的相对百分比。示范性的组合物含有至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多未岩藻糖基化的分子。根据本发明糖修饰剂例如栗精胺处理的宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的岩藻糖含量相对于未经此处理的宿主细胞会降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或IO倍或更多。0024在任何前述方法中，宿主细胞在暴露到糖修饰剂例如栗精胺的过程中可以表现出高生长水平。例如，产生免疫糖蛋白的CHO细胞的示范性群体倍增时间为大约14小时；期望根据本发明的糖修饰剂的浓度(例如有效提高ADCC的浓度)不会降低该倍增时间。理想地，糖修饰剂例如栗精胺的有效浓度在加入糖修饰剂后的72小时时间点不会降低细胞生长超过10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%。00251在任一前述方法中，宿主细胞可以在暴露到糖修饰剂例如栗精胺的过程中表现出高蛋白质产量水平。例如，在存在有效量糖修饰剂例如栗精胺时蛋白质产量水平可以为大约50pg/mL或更高，或大约75、100、125或150(ig/mL或更高。优选，宿主细胞表现出高生长水平和高蛋白质产量水平。术语"免疫糖蛋白"是指糖基化多肽，其结合靶分子并含有来自免疫球蛋白恒定区的充分的氨基酸序列以提供效应子功能优选ADCC和/或CDC。示范性分子将含有来自免疫球蛋白CH2结构域的序列，或者来自一种或更多种免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。根据本发明预期进行生产的免疫糖蛋白的具体子集包括单链蛋白质，其任选地通过铰链和/或CH3结构域中的共价或非共价结合而二聚化。该单链蛋白质的子集不包括典型的免疫球蛋白的四聚体构型(因为不存在轻链)，但包括Fc-配体或Fc-可溶受体融合物。单链蛋白质的具体例子包括SMIP产物。SMIP产品和其生产方法之前已经被描述在共有的美国专利申请no.10/627,556和美国专利公开2003/133939,2003/0118592和2005/0136049中，均被通过参考整体并入本文。具有效应子功能的多价结合蛋白被描述在2007年6月12日提交的国际专利申请No.PCT/US07〃1052(要求2006年6月12日提交的U.S.S.N.60/813,261以及2006年10月20日提交的60/853,287的优先权)中。SMIP是新型的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其具有下列特征同源结构例如抗原、相应受体等的结合结构域；IgGl、IgA或IgE铰链区多肽或突变IgGl铰链区多肽具有0、1或2个半胱氨酸残基；以及免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一个实施方式中，结合结构域分子具有1或2个半胱氨酸残基。在相关的实施方式中，预期，如果结合结构域分子包含2个半胱氨酸残基，则第一个半胱氨酸(典型地包括在重链和轻链可变区之间)不被缺失或氨基酸置换。SMIP产物能够ADCC和/或CDC,但它们形成二硫键连接的多聚体的能力可能被破坏。示范性的SMIP产物可以具有一个或更多个结合区，例如来自免疫球蛋白的可变轻链和/或可变重链结合区的免疫球蛋白超家族的结合区。在示范性实施方式中，这些区域被接头肽分开，其中接头肽可以是本领域中已知的任何接头肽以能够与结构域或区连接兼容。示范性的接头是基于Gly4Ser接头基序的接头，例如(Gly4Ser)n,其中n=3-5。可以根据本发明产生的示范性SMIP产品包括结合CD20或CD37的产品。结合CD20或CD37以及包括特异性结合序列和/或氨基酸修饰的SMIP产品被描述在共有的、同样未决的美国专利申请no.10/627,556和11/493,132中，均被通过参考整体并入本文中。、白介素15与Fc区的融合蛋白[J.Immunol.,160,5742(1998)]、因子VII与Fc区的融合蛋白[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，12180(2001)]、白介素与Fc区的融合蛋白[J.Immunol.,154,5590(1995)]、白介素2与Fc区的融合蛋白[J.Immunol.,146,915(1991)]、CD40与Fc区的融合蛋白[Surgery,132，149(2002)]、Flt-3(fms-类酪氨酸激酶)与抗体Fc区的融合蛋白[Acta.Haemato.,95,218(1996)]、OX40与抗体Fc区的融合蛋白[J.Leu.Biol.,72,522(2002)]、其他CD分子[例如CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD106(VCAM醫l)、CD137]、粘附分子[例如ALCAM(活性白细胞细胞粘附分子)、钙粘蛋白、ICAM(细胞间粘附分子)-l、ICAM-2、ICAM-3]、细胞因子受体[例如白介素-4R、白介素-5R、白介素-6R、白介素-9R、白介素-10R、白介素-12R、白介素-13Ral、白介素-13Ra2、白介素-15R、白介素-21R]、趋化因子、诱导细胞死亡的信号分子[例如B:7-H1、DR6(死亡受体6),PD-1(程序死亡-l)、TRAILRl]、共刺激分子[例如B7-l、B7-2、B7-H2、ICOS(可诱导共刺激剂)]、生长因子[例如ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR]、分化诱导因子(例如B7-H3)、激活因子(例如NKG2D)、信号转移分子(例如gpl30)。00331免疫糖蛋白的其他实施例包括抗体。本文的术语"抗体"被定义为包括全组装抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(双特异性抗体、能够结合抗原的抗体片段(例如Fab'、F，(ab)2、Fv、单链抗体、二聚抗体(diabody))和包含前述的重组肽只要它们表现出期望的抗原结合活性。预期原始分子和/或片段的多聚体或集合体包括化学衍生抗体。预期任何同种型类别或亚类的抗体包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如IgGl和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。"免疫球蛋白"或"原始抗体，，是四聚体糖蛋白，其由两对相同的多肽链(两条"轻链"和两条"重链")构成。每条链的氨基末端部分包括大约100~IIO或更多个氨基酸的"可变区"("V"),其主要负责抗原识别。在该可变区中，"高变区"或"互补性决定区"(CDR)由轻链可变结构域中的残基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3),以及重链可变结构域中的31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3)构成(正如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)]所描述的)，和/或那些来自高变环的残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3))和重链可变结构域中的残基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)(正如[Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)]所描述的))。0035]每条链的羧基末端部分含有恒定区。轻链在恒定区中具有单个结构域。因此，轻链具有一个可变区和一个恒定区结构域。重链在恒定区中具有多个结构域。IgG、IgA和IgD抗体的重链具有3个被称为CH1、CH2和CH3的恒定区结构域，IgM和IgE抗体的重链具有四个恒定区结构域CH1、CH2、CH3和CH4。因此，重链具有一个可变区和3个或4个恒定区。、结构域抗体(dAb)[Ward等人，Nature341:544-546,1989]、互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)[Bird等人，Science242:423-426,1988,和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988,任选包括多肽接头和任选多特异性Gruber等人，J.Immunol.152:5368(1994)]、单链抗体片段、二聚抗体[EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)]、三聚抗体(triabody)、四聚抗体(tetrabody)、微型抗体[Olafsen,等人，ProteinEngDesSel.2004Apr;17(4):315-23]、线性抗体(linearantibody)[Zapata等人，ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995)];螯合重组抗体[Neri等人，JMolBiol.246:367-73,1995],三链抗体(tnbody)或双链抗体(bibody)[Schoonjans等人,JImmunol.165:7050-57，2000;Willems等人，JCh薩atogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci.786:161-76,2003]、细胞抗体(intrabody)[Biocca,等人，EMBOJ.9:101—108,1990;Colby等人，ProcNatlAcadSciUSA.101:17616-21,2004]、纳米抗体(nanobody)[Cortez-Retamozo等人，CancerResearch64:2853-57，2004]、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗[Desmyter等人，J.Biol.Chem.276:26285-90,2001;Ewert等人，Biochemistry41:3628-36，2002;美国专利公开No.20050136049和20050037421]、含VHH的抗体、冲莫拟抗体(mimetibody)[美国专利公开No.20050095700和20060127404;WO04/002424A2;WO05/081687A2]、或其变体或衍生物，以及含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，其足以提供与多肽的特异性抗原结合，例如CDR序列，只要抗体保持期望的抗原结合活性。术语"衍生物"在结合抗体使用时是指通过缀合到治疗或诊断剂、标记(例如用放射性核或各种酶)、共价聚合物结合例如聚乙二醇化(利用聚乙二醇衍生)和通过化学合成非天然氨基酸的插入或置换而共价修饰的抗体。本发明的衍生物将保持本发明未衍生化的分子的结合性质》癌症靶向抗体与细胞毒性剂例如放射性同位素(例如1131、1125、Y90和Rel86)、化学治疗剂或毒素的缀合可以增强破坏癌细胞。100431对于靶分子是"特异性"的免疫糖蛋白以高于任何其他靶的亲和力结合该靶。本发明的免疫糖蛋白与它们的靶可以具有至少大约104M"或可替换地105M"、106M"、107M"、108M-1、109M-1或101QM"的Ka的亲和力。可以使用传统技术容易测定这些亲和力，例如通过使用BIAcore仪器或通过使用放射标记耙抗原的放射免疫检验。可以通过例如Scatchard等人，AnnN.Y.Acad.Sci.,51:660(1949)的方法对亲和力数据进行分析。耱發谬游0044]"糖修饰剂"是小分子有机化合物，优选分子量<1000道尔顿，其抑制参与对作为结合到多肽的糖一部分的糖进行添加、除去或修饰的酶。糖基化是非常复杂的过程，其发生在内质网中("核心糖基化")和高尔基体中("末端糖基化")。0045糖基化酶的其他基于多肽或基于多核苷酸的抑制剂包括抑制早期糖修饰剂活性的RNAi或反义根据本发明都是有用的，但被排除在"糖修饰剂"的定义之外。后续糖基化步骤包括高尔基体甘露糖苷酶II、GlcNAc-转移酶II、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶、岩藻糖基转移酶和岩藻糖激酶。示范性的糖修饰剂包括任意下列的。栗精胺被认为是葡糖苷酶I和II抑制剂。去氧岩藻糖野尻霉素(Deoxyfuconojinmycin)是岩藻糖苷酶抑制剂。6-曱基-四氢-吡喃-2H-2,3,4-三醇已经被报道在体内抑制L-岩藻糖的磷酸化，即GDP-L-岩藻糖生物合成的第一步。6,8a-二表-栗精胺被报道为岩藻糖基转移酶抑制剂。l-N-亚應基糖A和B(也分别被称作l-丁基-5-曱基-哌啶-3,4-二醇盐酸盐和5-甲基-哌啶-3,4-二醇盐酸盐)已经被报道为岩藻糖基转移酶抑制剂。去氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojinmycin)(DMJ)是ER甘露糖苷酶I抑制剂。Kifunensine(Kf)是ER甘露糖苷酶I抑制剂。苦马豆素(Swainsonine)(Sw)是ER甘露糖普酶II抑制剂。莫能菌素(Monensin)(Mn)是ER和高尔基体之间细胞内蛋白质转运的抑制剂，其干扰核心寡糖的延长。尽管被广泛用于治疗性蛋白的生产的CHO细胞是优选的，但本领域中所有已知产生糖基化蛋白的宿主细胞都可以被使用包括酵母细胞、植物细胞、植物、昆虫细胞和哺乳动物细胞。酵母细胞的例子包括毕赤酵母(尸/c/na)、例如尸./"Wor^和酵母菌属(Sacc/z^owycM)例如酿酒酵母(S.cerev/wae)以及粟酒裂殖酵母(iSc/z/ms^cc/z"r函;A^/歸6e)、克鲁维酵母(《/t(yverow;KCM)Zacto、脆壁克鲁维酵母(/rag"&)、保加利亚克鲁维酵母(AT.6w/g^7cw)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeram")、AT.而/"/、AT.t/myo//n'/ar謂^w"Wo/eraw和马克斯克鲁维酵母(f.mao:/am^);耶氏克鲁维酵母(《.少07Tow/a);里氏木霉(7>7'c/o<ie，"),粗糙脉孢菌(Afewmsp0n3cra^")、施旺酵母(iSc/z而wm'omyces)Sc/z而"m'0m7c"occ油"fa/Zs、脉孑包菌(A^wroy/ora)、青霉菌(尸em'cz'〃/wm)、7b(y/oc/aof/wm、曲霉菌(J^erg〃/M)、构巢曲霉(Amt/w/^w)、黑曲霉(Amgw),汉逊酵母属(/7a"化"w/a),假丝酵母(Owt^^)、克勒克酵母(A7oec/bra)、拟酵母(7bn^/o戸w)和红酵母属(i^WWon^)。示范性昆虫细胞包括苜着尺獲(Autographacalifornica)禾口草J4夜虫我(Spodo/^ena/rwg/penia)和果蝇(Z>wo//7")。示范性哺乳动物细胞包括各种CHO、BHK、HEK-293、NS0、YB2/3、SP2/0和人细胞例如PER-C6或HT1080以及VERO、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、Jurkat、Saos、PC-12、HCT116、L929、Ltk-、WI38、CV1、TM4、W138、HepG2、MMT、白血病细胞系、胚胎干细胞或受精卯细胞。00591可以在任何培养体系中并根据本领域已知的任何方法培养细胞，包括T型烧瓶、旋转器和振荡器烧瓶、滚筒瓶和搅拌罐生物反应器。着壁依赖性细胞可以被培养在被保持在搅拌罐生物反应器中的微载体上例如高分子球体。可替换的，细胞可以以单细胞悬浮液的形式生长。可以以分批方法加入培养基，例如如果以单批次一次性将培养基加入到细胞中或者以定期加入小批次培养基的分批给料方法加入到细胞中。可以在培养的最后收获培养基，或者在培养过程中多次收获培养基。连续灌注生产工艺也是本领域中公知的，并且包括连续将新培养基给料到培养物种，同时从反应器中连续回收相同体积。灌注培养通常达到比分批培养高的细胞密度，并且能够利用重复收获而维持数星期或数月。0060本发明的免疫糖蛋白可以用作治疗剂用于治疗靶分子所接到的疾病，或者例如作为细胞溶解剂以杀死具有所表达靶分子或与细胞表面结合的靶分子的癌细胞。0061]"治疗"或"治疗"是指治疗性治疗或预防性治疗。治疗性治疗可以改善接受治疗的个体中疾病的至少一种症状，或者可以延迟个体中发展中疾病的恶化，或者防止其他相关疾病的发生。通过评估疾病状态领域公知的临床标准的评估对改善的应答进行评定。在一个实施方式中，给药是在需要在癌症或受影响组织的位点进行的，所述癌症或受影响组织需要通过直接注射到位点中或者通过可以在内部释放制剂的持续递送机制而进行治疗。例如，在本发明植入到癌症附近的制剂中可以包括生物可降解微球或胶嚢或能够持续递送组合物(例如可溶多肽、抗体或小分子)的其他生物可降解高分子构造。0066]还可以在多个位点将治疗组合物递送给患者。可以同时仅是多份给药，或者在持续的时间段内给药。优选注射含水溶液。含水组合物可以净皮冻干用于储存，并在使用之前在适当载体中复原(reconstitute)。这种技术已经显示对于传统免疫球蛋白是有效的。能够采用任何适当的冻干和复原技术。本领域技术人员能够理解冻干和复原能够引起不同程度的活性损失并且可能需要调节使用水平以进行补偿。10068在所有情况中，该形式必须是无菌的，并且必须是流动的达到容易发生注射的程度。可以例如通过使用包覆例如软磷脂，通过维持在分散液时所需的粒径以及通过使用表面活性剂而维持恰当的流动性。其在制造和储藏条件下必须是稳定的，并且能够被保持抵抗微生物的污染行为例如细菌和真菌。可以通过各种抗菌剂和抗真菌及例如对羟苯甲酸、氯代丁醇、石炭酸、山梨酸、硫柳汞等实现对微生物行为的防止。在许多情况中，期望包括等渗剂例如糖或氯化钠。10069)此外，预期在本发明中使用的组合物的亲水和疏水性质被很好地平衡，这样增强了它们在体外特别是体内应用的实用性，而其他缺少该平衡的组合物是基本上实用性较低的。具体的，被预期在允许在体内吸收和生物利用度，同时还具有在脂类中的溶解度，这允许化合物穿过细胞膜到达假定的作用位点。图1描绘根据细胞/ml的细胞计数所显示的，生长在具有各种浓度栗精胺的细胞培养基中表达TRU-016的CHO细胞的细胞生长。0074图2描绘根据活细胞百分比所显示的，生长在具有各种浓度栗精胺的细胞培养基中表达TRU-016的CHO细胞的细胞活力。0075图3描绘在存在各种浓度的栗精胺时培养的细胞所产生的TRU-015的CD16结合，并且显示了几何平均荧光强度对比栗精胺浓度。00761图4描绘根据几何平均荧光强度所显示的，在存在各种浓度6,8a-二表栗精胺、苦马豆素或去氧甘露糖野尻霉素(DMJ)时所培养的细胞所产生的TRU-016的CD16结合。00771图5描绘根据平均荧光强度所显示的，在存在不同浓度kifunensme所培养的细胞所产生的TRU-016的CD16结合。100781图描绘6根据平均荧光强度所显示的，在存在不同浓度栗精胺时所培养的细胞所产生的蛋白质A-纯化的TRU-016的CD16结合。图7和8分别描绘使用高亲和力和低亲和力供体PBMC测量的TRU-015的ADCC，以及所加入TRU-015对比特异性杀死百分比的图表。图9描绘在存在不同浓度栗精胺时所培养的细胞素所产生的TRU-016的ADCC以及特异性杀死百分比对比所加入TRU-016浓度的图表。图10描绘在存在各种糖修饰剂时培养的细胞所产生的TRU-016的ADCC，以及特异性杀死百分比对比所加入TRU-016浓度的图表。0082图11描绘在给药在存在各种糖修饰剂时培养的细胞所产生的TRU-016的小鼠中的药物动力学数据。图12描绘给药使用各种糖修饰剂处理的细胞所产生的TRU-016的小鼠血清中的TRU-016的CD16结合。|00841图13描绘植入肿瘤细胞以及给药使用各种糖修饰剂处理的细胞或未处理细胞所产生TRU-016的小鼠在第8天的相对肺瘤体积。图14描绘植入肿瘤细胞以及给药使用各种糖修饰剂处理的细胞或未处理细胞所产生TRU-016的小鼠的存活百分比。0086]图15描绘在存在栗精胺时所培养的细胞所产生的TRU-015的CDC以及碘化丙锭阳性(死细胞)百分比对比TRU-015测试蛋白浓度的图表。0087图16描绘在存在各种糖修饰剂时所培养的细胞所产生的TRU-016的CDC,以及碘化丙锭阳性(死细胞)百分比对比TRU-016测试蛋白浓度的图表。图17描绘在栗精胺浓度范围内，TRU-016的相对特异性蛋白产量。00891图18描绘在栗精胺浓度范围内，TRU-016同时结合CD37与FcyRIIIa(CD16)的检验结果。0090]图19描绘对于栗精胺浓度范围，TRU-016与表达CD37的细胞的剂量应答结合曲线。CD37-特异性SMIP^皮描述在共有的美国专利申请No.10/627,556和美国专利7^开No.2003/133939,2003/0118592以及2005/0136049中，均通过参考将其整体并入本文。如下所述产生示范性SMIP、TRU-016。20093!TRU-016[G28-lscFvVH1IS(SSC-P)HWCH2WCH3〗是重组单链蛋白质，其结合CD37抗原。TRU-016的核普酸和氨基酸序列被列于SEQIDNO:1和2中。结合结构域基于在前述段落的专利公开中所已经公开的G28-l抗体序列，通过参考将其并入本文。将结合结构域通过经修饰的铰链区连接到效应子结构域人IgGl的CH2和CH3结构域。TRU-016以溶液中的二聚体存在。00941通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达体系中产生TRU-016。通过蛋白质A亲和层析从CHO培养物上清純化TRU-016SMIP。使用dPBS，以5.0ml/分钟(150cm/小时)对50mLr蛋白质AFF琼脂糖凝月交柱(GEHealthcarerProteinASepharoseFF，Catalog#17-0974-04)平衡1.5倍柱体积(CV)。以1.7ml/分钟的流速使用AKTAExplorer100Air(GEhealthcareAKTAExplorer100Air,Catalog#18-1403-00)将培养物上清上样到r蛋白质A琼脂糖凝胶FF柱，捕获重组TRU-016。使用dPBS，接着1.0MNaCl、20mM磷酸钠pH6.0、接着使用25mMNaCl，25mMNaOAc,pH5.0对柱清洗5倍柱体积(CV)。这些清洗步骤从r蛋白质A柱除去了非特异性结合的CHO宿主细月包蛋白质，这有助于在洗脱后产品沉淀。将纯化的蛋白质进行GPC尺寸排阻层析法(SEC)以达到对来自较高分子量聚集体的TRU-016(二聚体)的进一步纯化。使用dPBS,以12.6ml/分钟(38cm/小时)对含有1LSuperdex200FF琼脂糖凝胶的XK50/100柱(GEhealthcareXK50/100孔层析柱Catalog#18-8753-01)平tfl.5倍柱体积(CV)。将最大体积54ml(3%CV)的样品应用到柱。柱继续以12.6ml/分钟运行，洗脱蛋白质浮皮分级在40mL级分中。使用分析型HPLC对每种级分进行分析产品质量，并汇集>95%POI(未聚集的)TRU-016的洗脱级分。将所得到的汇集物以0.22pm进行过滤除菌。接着浓缩材料，并使用20mM磷酸钠和240mM蔗糖pH6.0进^f亍配置。纯化葡萄糖变体(glycovariant)的可替换方法如下。通过蛋白质A亲和层析从CHO培养上清纯化TRU-016。使用dPBS,以1.0mL/分钟对1mLMabSelect亲和层析柱(GEHealthcareHitrapMabSelect,catalog#28-4082-53)平衡7倍柱体积(CV)。使用AktaExplorer100Air(GEHealthcare,AktaExplorer100Air,catalog#18-1403-00)以1.0mL/分钟将培养上清上样到MabSelect柱捕获重组TRU-016。使用dPBS对柱清洗20CV,接着使用20mM磷酸钠、1.0MNaClpH7.0清洗5CV,接着使用dPBS清洗3CV。0098使用10mMpH3.5从柱洗脱重组TRU-016,接着使用10mM柠檬酸盐3.0解吸8CV。在解吸之后，使用dPBS对柱重新平衡5CV。在洗脱过程中，将按白纸收集到级分中，并根据所吸光度进行汇集，并利用每5mL洗脱液添加大约400|liL0.55M2-(N-吗啉)乙烷磺酸(MES)pH6.0而将所汇集的材料调至pH5。将该中和的洗脱液过滤除菌，并进行活性检验以及处理分析检验。如下所述，对使用不同浓度的各种糖修饰剂培养的细胞所产生的TRU-016检验CD16结合、ADCC、CDC、药物动力学参数和体内活性。[ooiio图1和2是代表性的，并且显示已最高达到1000pM浓度的糖修饰剂栗精胺的处理不会影响细胞计数或经过所有取样时间段(最高达到144小时)的细胞活力百分比。实施例3结合FcR100111将根据实施例2产生的免疫糖蛋白体外检验与Fq/受体的可溶性Ig-融合版本的结合，其中受体的胞外结构域与鼠IgG2aFc融合。通过分别将Fcy受体I的胞外结构域(GenbankAcc.No.BC032634)、IIa(GenbankAcc.No.NM—021642)、lib(GenbankAcc.No.BC031992)和III-V158(高亲和力等位基因)(GenbankAcc.No.X07934)以及III-F158(低亲和力等位基因)融合到具有在残基238Pro变成Ser突变(MIgG2aP238S)的鼠IgG2aFc,产生可溶性受体材料。对于两种形式的FeyRIII(CD16)，都将HE4导肽克隆到CD16氨基酸1~178中，接着融合到MlgG2aP238S。(小鼠Fc-净争异'l"生^t体，与人Fc有最小的交叉反应)孵育。通过单色流式细胞仪在FACsCalibur上使用CellQuest软件(BectonDickinson)对细胞进行分析。00115]如果在该检验中使用来自实施例2的TRU-016上清液而不是纯化的TRU-016蛋白，则可以通过使用稀释的上清液以及TRU-016标准对WIL2-S细胞直接染色，而定量上清液中SMIP的浓度。通过使用1:50稀释的FITC偶联的F(Ab，)2山羊抗人(力[CaltagH10101]才全测TRU-016。测定与低亲和力等位基因和高亲和力等位基因的结合，以类似地比较ADCC活性。CD16结合的提高(低或高亲和力等位基因)与ADCC活性的提高相关。图3~6展示了代表性结果。0、30或100)ug/mL栗精胺所培养的CHO细胞而产生的TRU-015纯化的蛋白质测试CD16结合(低亲和力等位基因)。图3展示了几何平均荧光强度的代表性结果，并且显示CD16结合在提高培养基中栗精胺浓度时CD16结合的剂量依赖性结合。对培养基中含浓度为50或250pM的6,8a-二表栗精胺、或浓度为50或250pM的苦马豆素、或浓度为50或250(iM的的去氧甘露糖野尻霉素(DMJ)所培养的CHO细胞而产生的TRU-016上清液测试CD16结合。图4中显示了平均荧光强度的代表性结果，并且显示两种浓度的DMJ都提高了CD16结合。尽管以这些浓度对6,8a-二表栗精胺或苦马豆素没有观察到效果，但对纯化的蛋白质进行了进一步测试以确定效果。100120对培养基中含有浓度为0、0.5、1、3、5或10|uM的kifunensme所培养的CHO细胞所产生的TRU-016上清液测试CD]628结合。图5中展示了平均荧光强度的代表性结果，并且显示kifunensine比DMJ在提高CD16结合方面有效得多，并且及时在最低浓度0.5pM下也大大提高了CD16结合。-自然释放的cpm)/(最大释放cpm-自然释放cpm)x100计算特异性杀死百分比，并将数据根据特异性杀死百分比对比TRU-016浓度进行作图。001231图7~10中展示了代表性结果。100124对培养基中含有O、2、5、10、30或100貼/mL栗精胺所培养的CHO细胞所产生的TRU-015纯化的蛋白质测试4吏用PBMC从高亲和力(V/V158)和低亲和力(F/F158)CD16供体测量的ADCC。图7和8中展示了特异性杀死百分比的代表性结果(分别为高亲和力和低亲和力供体)，并且显示在培养基中提高浓度的栗精胺下，剂量依赖性的ADCC活性提高。00125对培养基中含有0、10、25、50、100或200iiM栗精胺所培养CHO细胞产生的TRU-016纯化的蛋白质测试ADCC。图9中展示了特异性杀死百分比的代表性结果，并显示在培养基中提高浓度的栗精胺下，剂量依赖性的ADCC活性提高。00126对培养基中含有200|iMDMJ、10pMkifenunsine或200栗精胺所培养的CHO细胞所产生的TRU-016纯化的蛋白质测试ADCC。图10中展示了特异性杀死百分比的代表性结果，并且显示所有这些浓度的糖修饰剂改善了CHO细胞所产生的免疫糖蛋白的ADCC。实施例5CDC活性对未处理的CHO细胞，或者使用30)Lig/ml栗精胺处理的CHO细胞所产生的TRU-015纯化的蛋白质测试CDC活性。结果展示在图15中。00129对未处理CHO细胞或者培养基中含有200DMJ、10|iMkifenunsine或200栗精胺所培养的CHO细胞所产生的TRU-016纯化的蛋白质测试CDC活性。结果展示在图16中。00130j这些结果显示糖修饰的TRU-015或TRU-016的CDC与未处理CHO细胞所产生的相应蛋白质的CDC类似，这说明宿主细胞的培养基中存在糖修饰剂对宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的CDC没有显著的影响。实施例6药物动力学特征在基于FACS的结合检验中使用CD37+Ramos人细胞系测定每种TRU-016测试样品的血清浓度。将CD37+Ramos细胞(5x105个细胞/孔)连同待测试的血清样品孵育在96孔平底板中。将加料(spiked)血清样品用于标准曲线。将细胞在4。C下孵育1小时，之后加入检测抗体。使用焚光素偶联的山羊抗人IgGFc^片段特异性抗体检测TRU-016测试蛋白与CD37+Ramos细胞的结合。将标准曲线用于构建作为抗原浓度函数的结合曲线。简言之，标准曲线包括各种抑制浓度的TRU-016测试蛋白，其被加料到1:2稀释在FACS緩沖液中的正常小鼠血清中。对每个板运行两次标准曲线。将来自FACS分析的平均荧光强度(MFI)输出到SoftmaxPro软件，并用于计算TRU-016测试蛋白的血清浓度。药物动力学研究的结果显示在含有200|uMDMJ、10(iMkifenunsine或200栗精胺的培养基中所培养的CHO细胞所产生的TRU-016(图11中展示的)在被被给药给小鼠时表现出了与未处理CHO小鼠所产生的TRU-016类似的药物动力学特征，这说明宿主细胞培养基中的糖修饰剂对半衰期或其他药物动力学参数没有显著影响。|00l34j对从在给药TRU-016之后48、72、96和192小时后从小鼠获得的含有TRU-016的血清重复CD16检验，显示血清在所测试的所有时间点都保持了其提高的CD16结合活性。结果显示在图12中。实施例7糖修饰的免疫糖蛋白的体内活性001351在第0天为棵鼠皮下给药5x106个Ramos细胞，并在第0、2、4、6和8天静脉注射200貼对照人IgG或经200|uMDMJ、10kifenunsine或200)liM栗精胺处理的CHO细胞所产生的31TRU-016测试蛋白质。典型地，小鼠在6天内产生胂瘤，并在稍后死亡。使用数字测径器和LabCat软件每周测量肿瘤三次，并将肿瘤体积计算为V2[长度x(宽度)]2。每周测定体重一次。00136]当胂瘤尺寸达到1500mm3(在周五达到1200mm3),处死小鼠。如果发生肺瘤溃疡，肿瘤抑制动物的活动性，或者如果体重损失达到或超过20%也将小鼠处死。00137]在研究开始后的8天相对肿瘤体积的中间结果显示在图13中。在开始研究后关于存活百分比的属于显示在图14中以及下表1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*每种糖修饰的TRU-016的数值都与hulgG处理的对照组显著不同。进行进一步的实-睑以测定栗精胺浓度对细胞活力、密度和TRU-016的特异性蛋白质产量的影响。在开始试-验之前，在37。C和5%二氧化石灰下在潮湿的培养箱中，将转染TRU-016的CHO细胞培养在摇瓶的Ex-Cell302CHO无血清培养基(SAFCBiosciences)中，所述培养基^皮补充了1x非必需氨基酸(MediaTech)、1x丙酮酸钠(MediaTech)、4mML-谷氨酰胺(MediaTech)、500nM氨曱喋呤(MPBiomedicals)和1mg/L重组胰岛素(Recombulin-GIBCO/InvitrogenCorp.)。通过将栗精胺在无菌、过滤/去离子水(MediaTech)中稀释而制备200mM储液浓度的栗精胺(AlexisBiochemicals),并使用0.2HTTuffryn膜(PallCorpomtion)过滤通过13mmAcrodisc。将储液等分到无菌的O-环状(O-ringed)0.5mL微型离心管(Fisherbrand,FisherScientific)中，并在-20。C冷冻。在开始实验前大约1小时，在室温下将所需要的份数冷冻，并通过涡旋(vortexing)充分混合每瓶的内含物。001411对于每次实验，将对数期的细胞接种在上述培养基中，达到在250mL摇瓶中总体积为60mL密度为200,000个细胞/mL,并以待测试的浓度加入CS。800pM、400|tiM、200pM、100[aM、50^M、25|nM和0的CS浓度均在两份烧瓶中进行测试。在潮湿的恒温箱中在37。C和5%二氧化碳下对所有培养物进行孵育，酶至少每隔一天监控活细胞密度和整体细胞活力。在下列抬1全中测试实施例8中所产生的TRU-016,其同时评估了TRU-016结合结构域结合表达CD37的耙细胞的能力，以及TRU-016SMIP的Fc部分结合人CD16和鼠IgGFc融合蛋白的能力。将适当数目的Daudi细胞(350,000/孔乘以孔的数目)并在15°C下一250xg离心5分钟。除去上清。通过使用FACSBuffer稀释来自USB(USBUS19943)1:4的4%储液制备1%的冷低聚甲醛。通过将2%FBS(Gibco)加入到Dulbecco，sPBS(Invitrogen)(v/v)中并使用0.22nm过滤器无菌过滤而制备FACS緩沖液。在4。C下保存和使用FACS緩沖液。将细胞重悬浮在1。/。低聚甲醛中(体积等于50jiL/孔乘以孔的数目)，并铺在圆底96孔板中。在4。C下孵育细胞30分钟。在孵育后，通过向每孔加入150jiLFACS緩冲液，250xg离心3分钟并除去上清而对细胞进行清洗。将细胞重悬浮在50pLFACS緩冲液中。将TRU-016稀释在FACS緩冲液中，浓度范围在饱和到背景水平之间(24(ig/mL—0.011|ng/mL),加入到适当的孔中，50)liL/孑L,并将细胞在4°C下孵育25分钟。将CD16:MuIgGFc融合蛋白稀释在FACS緩沖液中达到饱和水平(20ng/ml)并加入进行检验。OpL/孔)，在4。C下额外孵育30分钟以与已经;故结合到细胞表面的TRU-016形成复合物。通过在15。C下250xg离心3分钟，除去上清，接着使用200iliL/孔FACS緩冲液清洗3次而从孔除去所有未结合的试剂。接着将细胞与荧光团(R-藻红蛋白，Jackson115-116-071)标签F(ab，)2抗体，对Fc特异性的抗体(并选择为对人Fc的反应性最低)孵育。该抗体将结合CD16:MuIgGFc融合蛋白的MuIgGFc部分。将抗体以1:200稀释在FACS緩冲液中，并向每孔加入100pL。在4。C下黑暗中孵育板45分钟。通过向每孔加入150pLFACS緩冲液并在15。C下250xg离心3分钟以及除去上清而除去所有未结合R-PE。随后利用200|uL/wellFACS緩35冲液，在15。C下250xg离心3分钟以及除去上清而进行第二次清洗。使用200nL/孔1%低聚甲醛重悬浮细胞并在4。C下储存过夜。实验结果展示在图18中，并显示相对于最高达到400pM的CS浓度的的剂量依赖性结合应答，在400iliM结合似乎变平。00151]为了证明CS处理的TRU-016与CD16增强的结合并不是部分由于增强的分子与CD37的结合，除了在检验板中加入并孵育经处理或未处理的TRU-016样品，并通过在15。C下250xg离心3分钟除去上清接着使用200pL/孔FACS緩沖液清洗3次而除去未结合的TRU-016之外，重复上述检验。接着，将细胞与偶联FITC的山羊抗人IgGFc特异性抗体(CaltagH10501)孵育。该抗体将与结合到细胞的TRU-016的人IgG链结合。将抗体在FACS緩沖液中1:50稀释，并将100)aL加入到每个孔中。将板在4。C下黑暗中孵育45分钟。通过向每个孔中加入IOOiliLFACS緩沖液，在15。C下250xg离心3分钟，接着除去上清而除去所有未结合的FITC标记的抗体。随后，使用200|iL/孔FACS緩沖液进行第二次清洗。使用200)uL/孔2%低聚甲醛重悬浮细胞，并保存在4°C下过夜。在BDFACSCalibur流式细胞仪系统上测量每个样品所结合的焚光，并使用CellQuestPro软件(BectonDickinson,ver5.2)进行分析。对每个样品的GeoMean焚光强度相对于TRU-016浓度进行作图。产生剂量应答并使用SoftMaxPro软件(MolecularDevices,ver5.0.1)拟合4-参数逻辑(4-PL)曲线。将TRU-016的滴度用于形成测试和未处理对照和CS处理样品的剂量应答曲线进行比较。(样品值-自然发生值)/(最大值-自然发生值)*100%自然发生值=仅从靶细胞释放的51Cr量最大释放=从经去污剂裂解剂处理的靶释放的51Cr量背景对照=从靶细胞+效应子细胞(无TRU-016)释放的51Cr量[00157产生剂量应答并使用SoftMaxPro软件(MolecularDevices,ver5.0.1)拟合4-参数逻辑(4-PL)曲线。将TRU-016的滴度用于形成测试和参照材料的剂量应答曲线进行比较。将经处理物品的EC50值与未处理对照(无CS)进行比较以测定ADCC活性的提高百分比。下表总结了图20中所展示的数据。数据显示经过100pM-800HM终浓度范围内的CS处理的TRU-016的ADCC活性，相对于未处理TRU-016被显著提高。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>比例1:X^耙与效应子比例(从全血新分离的PBMC)对于CD等位基因供体是纯合高亲和力(高)、纯合低亲和力(低)或杂合的。[001581尽管根据上述示范性实施方式已经对本发明的组合物和方法进行了描述，但本领域技术人员清楚可以对本文所描述的组合物和/或方法或者方法中的步骤或步骤的顺序进行变化，而不离开本发明38的概念、主旨和范围。更具体的，明显的是某些化学和生理相关的试剂可以置换本文所描述的试剂，而能达到相同或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员明显的类似置换和修饰被认为在所附权利要求所限定的本发明的主旨、范围和概念中。[00159J本文中所引用的参考文献全部具体地通过参照并入本权利要求1.提高宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，该方法包括下列步骤在体积为至少1升的培养基中培养所述宿主细胞，其中所述培养基包含栗精胺，其浓度在大约25至大约800μM之间，这提高了所述宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的ADCC。2.权利要求l的方法，其中ADCC被提高至少2倍。3.权利要求l的方法，其中ADCC被提高至少5倍。4.提高宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的CD16结合的方法，其包括下列步骤在体积为至少1升的培养基中培养所述宿主细胞，其中所述培养基包含栗精胺，其浓度在大约25至大约800^vl之间，这提高了所述宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的CD16结合。5.权利要求4的方法，其中CD16结合被提高至少50%。6.权利要求4的方法，其中CD16结合被提高至少2倍(200%)。7.权利要求1至7任一项的方法，其中培养基中免疫糖蛋白产量的水平为至少100(ag/mL。8.权利要求1至7任一项的方法，其中栗精胺以大约100至400(iM之间的浓度存在。9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述培养基基本上无血清。10.权利要求1至9任一项的方法，其中在补料分批培养物中培养宿主细胞。11.权利要求1至9任一项的方法，其中在连续进料培养物中培养宿主细胞。12.权利要求1至9任一项的方法，其中培养基包含笫二糖修饰剂。13.组合物，其包含根据权利要求1至12任一项的方法所产生的免疫糖蛋白以及无菌可药用的载体或稀释剂。14.杀死或抑制癌症细胞生长的方法，其包括为个体给药权利要求13的组合物的步骤，其中所述癌症细胞在其表面表达被所述免疫糖蛋白分子结合的分子。15.耗尽细胞的方法，其包括为个体给药权利要求13的组合物，其中所被耗尽的细胞在其表面表达被所述免疫糖蛋白分子结合的分子全文摘要提供了具有改善的ADCC和改变的糖基化特征的免疫糖蛋白，包括抗体。由在包含栗精胺的培养基中生长的宿主细胞产生了免疫球蛋白。文档编号C07K16/00GK101646688SQ200780039452公开日2010年2月10日申请日期2007年10月24日优先权日2006年10月24日发明者E·S·埃斯普林,P·A·汤普森,P·R·鲍姆申请人:特鲁比昂药品公司