一种电化学检测的细胞前处理方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种电化学检测的细胞前处理方法。
【背景技术】
[0002]体外细胞电化学试验方法是近几年发展起来的用于细胞活性检测的试验方法，相较于传统方法，如MTT法、流式细胞仪法等，具有简单、快速、灵敏、低成本等特点，可以细胞活性为指标来评价抗癌药物敏感性、环境致癌物毒性及生物材料的生物相容性，该方法目前主要通过检测细胞内电活性物质伏安响应的变化来反映细胞活性的变化，因此细胞内电活性物质的有效释放是完成该项测试的关键性因素，而目前用来实现细胞内电活性物质释放的细胞前处理技术是细胞加热裂解法和细胞原位低渗裂解法，即在进行电化学检测之前，首先把细胞放置于一定温度的装置中，使其加热失活，从而释放出细胞内电活性物质，该方法实现了细胞中电活性物质在检测装置中的有效释放，可以保证细胞电化学方法检测到细胞内电活性物质。传统细胞加热裂解法中细胞生存环境为高渗PBS溶液，如果采用低渗溶液如双蒸水代替高渗PBS溶液，使细胞周围环境为低渗溶液，则可能会导致细胞大量吸水胀大，从而加强细胞裂解程度，这样就可以实现细胞原位低渗裂解。
[0003]现有细胞前处理技术虽然在一定程度上实现了细胞内电活性物质的释放，从而完成细胞的电化学检测，以其测定结果表达细胞活性的变化，但该方法只是实现了在细胞膜表面打开通道来释放电活性物质，电活性物质释放不够完全，从而电化学信号较弱，无法用其来真实地反映细胞活性的变化。
【发明内容】
[0004]本发明是为了解决现有细胞前处理技术释放电活性物质不够完全，从而无法真实地反映细胞活性变化的问题，提供一种电化学检测的细胞前处理方法。
[0005]本发明一种电化学检测的细胞前处理方法为细胞原位复合裂解法，具体方法为:将待检测细胞接种于培养皿中，置于37°C、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养24h，然后去除培养基，加入低渗裂解液，调整待检测细胞浓度为5X 14?5X 10 8Cells -mL \然后在30?70°C水浴条件下，裂解30?60min，即完成。
[0006]本发明在细胞加热裂解法的基础上复合低渗裂解法，即用低渗溶液如双蒸水代替高渗PBS溶液，使细胞周围环境为低渗溶液，同时辅助加热，实现双重效果叠加，导致细胞大量吸水胀大，从而加强细胞裂解程度，直至细胞膜最终破裂，从而实现细胞原位复合裂解，完全释放出细胞内全部电活性物质，不仅有效增强了电化学信号，而且真实地反映了细胞内电活性物质的实际含量，提高了电化学检测信号的敏感度，使其更有利于细胞活性检测，并且能够真实地反映细胞活性的变化，提高了细胞电化学试验方法的准确性，有望在实际样本检测中获得更加广泛的应用。
【附图说明】
[0007]图1为试验I试验组、对照组I和对照组2的MCF-7细胞三种裂解方式对比的电化学图；其中a为细胞原位复合裂解，b为细胞原位加热裂解，c为细胞原位低渗裂解；
[0008]图2为试验I的试验组细胞裂解产物的显微镜图；
[0009]图3为试验I的对照组I细胞裂解产物的显微镜图；
[0010]图4为试验I的对照组2细胞裂解产物的显微镜图。
【具体实施方式】
[0011]【具体实施方式】一:本实施方式一种电化学检测的细胞前处理方法为细胞原位复合裂解法，具体方法为:将待检测细胞接种于培养皿中，置于37°c、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养24h，然后去除培养基，加入低渗裂解液，调整待检测细胞浓度为5X104?5X 18Cells.mL \然后在30?70°C水浴条件下，裂解30?60min，即完成。
[0012]本【具体实施方式】在细胞加热裂解法的基础上复合低渗裂解法，即用低渗溶液如双蒸水代替高渗PBS溶液，使细胞周围环境为低渗溶液，同时辅助加热，实现双重效果叠加，导致细胞大量吸水胀大，从而加强细胞裂解程度，直至细胞膜最终破裂，从而实现细胞原位复合裂解，完全释放出细胞内全部电活性物质，不仅有效增强了电化学信号，而且真实地反映了细胞内电活性物质的实际含量，提高了电化学检测信号的敏感度，使其更有利于细胞活性检测，并且能够真实地反映细胞活性的变化，提高了细胞电化学试验方法的准确性，有望在实际样本检测中获得更加广泛的应用。
[0013]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:所述的培养基为DMEM高糖培养基。其他步骤和参数与【具体实施方式】一相同。
[0014]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:所述的去除培养基的方法为用移液枪吸去培养基，并用等渗PBS缓冲液冲洗三遍。其他步骤和参数与【具体实施方式】一或二相同。
[0015]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:所述的低渗裂解液为双蒸水。其他步骤和参数与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0016]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:所述的在50°C水浴条件下，裂解30min。其他步骤和参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0017]通过以下试验验证本发明的有益效果:
[0018]试验1、本试验试验组电化学检测的细胞前处理方法为细胞原位复合裂解法，具体方法为:将5X105cells -mL 1的MCF-7细胞接种于培养皿中，置于37°C、C02体积浓度为5%的培养箱中培养24h，然后去除培养基，再加入双蒸水，调整细胞浓度为5X 16Cells ^mL \然后在50°C水浴条件下，裂解30min，即完成。
[0019]对照组I细胞原位加热裂解法的方法为:将5X 15Cells.mL 1MCFI细胞接种于培养皿中，置于37°C、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养24h，然后去除培养基，再加入高渗PBS，调整细胞浓度为5 X 16ceIls.mL \然后在50°C水浴条件下，裂解30min，即完成；其中高渗 PBS 为 Phosphate buffer saline (PBS电化学，pH 7.4)，其包括沈2.2mmolL 1Na2HPO4.12H20 和 199.9mmol.L 1KH2PO4)。
[0020]对照组2细胞原位低渗裂解法的方法为:将5X 15Cells.mL 1MCFI细胞接种于培养皿中，置于37°C、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养24h，然后去除培养基，再加入双蒸水，调整细胞浓度为5X 16Cells.mL \然后在37°C水浴条件下，裂解30min，即完成。[0021 ] 将试验组、对照组I和对照组2的细胞裂解产物循环伏安法检测，记录细胞的电化学信号，试验组细胞原位复合裂解产物在0.7V和1.1V处分别出现两个检测峰，其中0.7V处检测峰为黄嘌呤与鸟嘌呤氧化的循环伏安峰，而1.1V处为腺嘌呤和次黄嘌呤氧化的循环伏安峰，分析细胞中嘌呤碱基的含量，从而可以确定四种嘌呤碱基含量的相对水平。
[0022]本试验中去除培养基的方法为:用移液枪吸去培养基，并用等渗PBS缓冲液冲洗三遍；其中等渗 PBS 缓冲液为 Phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)，其包括 136.7mmolL 1NaCU.7mmol L 1KCH 7mmol L 1Na2HPO4.12H20 和 1.5mmol.L 1KH2PO40
[0023]通过数据处理，分析比较试验组和对照组I和对照组2的电化学数据的差异，发现试验组细胞原位复合裂解的电化学信号强度远高于细胞原位加热裂解和低渗裂解法，信号增强作用明显，0.7V处的检测峰面积分别比对照组I和对照组2增加了 138.79%和156.79%, 1.1V处的检测峰面积分别比对照组I和对照组2增加了 205.80%和244.09%,从而表明该方法更适于细胞电化学检测前处理，尤其是增加了对于腺嘌呤和次黄嘌呤检测的敏感度；同时该裂解方式还能够降低细胞内嘌呤物质的检出下限，原单纯加热裂解检测下限仅为IXlO5ceIls.mL \而复合裂解检测下限达到2.5X 104cells.mL \提高电化学的灵敏性。
[0024]用显微镜观察试验组、对照组I和对照组2的细胞裂解产物，结果如图2、图3和图4所示，由图2可知:细胞在原位复合裂解下，细胞吸水肿胀且细胞膜破裂，经过吉姆萨染液染色后，可明显观察到细胞核完整，细胞膜破碎并散落在溶液中。由图3可知:细胞在原位加热裂解下，细胞处在高渗PBS(Wfc%，中失水皱缩，经过吉姆萨染液染色后，可明显观察到细胞是完整且形态皱缩。由图4可知:细胞在原位低渗裂解下，细胞吸水肿胀，可明显观察到细胞肿胀并部分细胞膜破裂。
【主权项】
1.一种电化学检测的细胞前处理方法，其特征在于该方法为细胞原位复合裂解法，具体方法为:将待检测细胞接种于培养皿中，置于37°C、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养24h，然后去除培养基，再加入低渗裂解液，调整细胞浓度为5X 14?5X 10 8cells -mL \然后在30?70°C水浴条件下，裂解30?60min，即完成。2.根据权利要求1所述的一种电化学检测的细胞前处理方法，其特征在于所述的培养基为DMEM高糖培养基。3.根据权利要求1所述的一种电化学检测的细胞前处理方法，其特征在于所述的去除培养基的方法为用移液枪吸去培养基，并用等渗PBS缓冲液冲洗三遍。4.根据权利要求1所述的一种电化学检测的细胞前处理方法，其特征在于所述的低渗裂解液为双蒸水。5.根据权利要求1所述的一种电化学检测的细胞前处理方法，其特征在于所述的在50°C水浴条件下，裂解30min。
【专利摘要】一种电化学检测的细胞前处理方法，它涉及一种电化学检测的细胞前处理方法。本发明是为了解决现有细胞前处理技术释放电活性物质不够完全，从而无法真实地反映细胞活性变化的问题，本发明方法为：将待检测细胞接种于培养皿中，置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，然后去除培养基，再加入低渗裂解液，调整细胞浓度，然后在水浴条件下，裂解，即完成。本发明的细胞原位复合裂解，实现了细胞膜的完全破裂，电化学信号大幅度增强，且处理简化，不仅使电化学检测信号加强，更重要的是电化学检测结果更准确地反映了细胞内电活性物质含量的真实情况。本发明应用于生物分析领域。
【IPC分类】G01N27/26
【公开号】CN105021671
【申请号】CN201510324323
【发明人】崔继文, 毕胜, 野秀玉, 李锦莲, 刘继光, 武冬梅
【申请人】佳木斯大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月12日