专利名称：一种用改良stela法测细胞中最短端粒长度的方法
技术领域：
本发明涉及一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法。
背景技术：
端粒(Telomere)是一段DNA重复序列，位于染色体末端，可以保持染色体的完整性。1990年，Harley等证实端粒的长度可以随着细胞分裂次数的增多而逐渐变短。这一发现在端粒和细胞衰老之间建立了紧密的联系。端粒重复序列的长度可能起着一种分子钟(molecular clock)的作用。不同年龄的人的体细胞的寿命明显不同,其端粒的长度也不相同。是随着年龄的增长而缩短。来自新生儿的体细胞可在体外传代培养80—90代，来自70岁老人的体细胞在体外只能传代培养20 30代，而且端粒的重复序列长度也缩短很多。端粒酶(Telomerase)是细胞中负责端粒延长的一种酶,是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控。实验证明，体细胞里没有端粒酶的活性，所以体细胞每分裂一次，端粒也就缩短一些。随着细胞不断地进行分裂，端粒的长度将越来越短，当达到一个临界长度时，细胞染色体会失去稳定性，使细胞不能再进行分裂而进入凋亡(apoptosis)。端粒的长度决定了细胞的寿命，因此可用丢失的端粒重复序列的长度来推测细胞有丝分裂的次数，所以端粒被称为分子钟或有丝分裂钟(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色体稳定性,细胞的衰老和死亡外,还与肿瘤的发生密切相关。在人体内的各种细胞中，生殖细胞和干细胞染色体的末端比体细胞染色体的末端长出几千个碱基对，并且在这两类细胞里能检测到端粒酶的活性。除此之外，其他所有体细胞里都未测得端粒酶的活性。惟一的例外是来源于体细胞的恶性肿瘤细胞却又重新出现了端粒酶活性，发挥其合成端粒重复序列的功能，以补偿正常的端粒序列丢失，使端粒的重复序列不会达到导致细胞死亡的临界长度，从而获得细胞的“永生性”(immortality)。这样，恶性肿瘤细胞在体内或体外都能无限制地分裂增殖。上文提到的端粒长度缩短指的是所有染色体末端端粒的平均长度。近年来，很多实验观察开始质疑端粒的平均长度与衰老之间的联系。一些研究小组提出了于端粒相关的细胞衰老是由单一或某几个短端粒引起的观点。这一观点的正确性也被越来越多的实验数据所证明。目前，研究端粒长度主要是应用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。但是，这个方法测量的是细胞内端粒的平均长度，而无法测量其中短端粒所占的比例，因此有很大的局限性。单个端粒长度分析(STELA, single telomere length analysis)是在单个染色体水平上基于PCR的端粒测量方法。第I步是“telorette” (在与端粒G悬突不配对的20个核苷酸后有7个同源的TTAGGG接头)的退火.第2步是将“telorette”连接到富C链5末端.此后用识别telorette尾巴的teltail引物同亚端粒上游引物进行PCR扩增。在研究这个区域的多态现象时，上游引物可以是特异的等位基因。STELA最先被用于分析人类X染色体短臂。最近对秀丽隐杆线虫的端粒和沃纳综合征的成纤维细胞的端粒的研究表明，在单个染色体水平上STELA的分析有很高的可靠性。STELA的PCR扩增具有高度的端粒特异性，用STELA测量人类成纤维细胞的XpYp端粒长度始终比TRF的平均值小，且这两者成线性关系，说明STELA没有包括亚端粒长度。另外，有一些手段可以比较精确的研究染色体中短端粒的情况，例如基于荧光原位杂交(Q-FISH)的技术。但是这些技术手段都或多或少存在一些不足之处，无法作为高效精确地研究或检测最短端粒的合适手段。
发明内容
发明目的
本专利涉及一种改良的STELA法，可以有效快速地检测研究细胞染色体短端粒长度和所占的比例。技术方案
一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于按步骤实现
A、限制性内切酶消化细胞中提取的gDNA经过MseI和NdeI两种限制性内切酶酶切(摩尔比I :1)；
B、Linker寡核苷酸连接Linker通过互补配对连接到各个gDNA片断的5’-TA-3’ ；其中 linker 为 11+2-mer oligo 和 42-mer oligo ；ll+2-mer oligo 的序列为 5，_TAC CCGCGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列为 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGGTGC GGA CGC GGG-3 ；
C、Telorette片断的连接telorette被连接到端粒的5，端；其中Telorette序列如下，可任选择其中一个序列
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3，；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3，；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3，。D、PCR 扩增端粒片段，其中引物为 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3，，5，-TGCTCC GTG CAT CTG GCA TC-3，-标记物。作为一种优化方式，其步骤为
A、培养人皮肤成纤维细胞BJ和人肺成纤维细胞MR-90，并分离上述两种细胞的生长期细胞和衰老细胞的gDNA ；
B、取步骤A中的gDNAI ug,加入Msel/Ndel双酶切(摩尔比I :1),同时加入IxNEBuf fer2 和 Ix BSA, 37 1反应过夜；
C、10ng 消化后的 gDNA 片断于 65 °C加入 50 uM 42-mer oligo 和 50 uM ll+2-meroligo，反应体积为7 ul ;之后将反应温度由65 °〇于I h内降至16 V ;加入20 U T4 DNA连接酶，Ix NEBuffer2和Ix ATP,于16 1反应过夜；其中 11+2-mer oligo 的序列为 5’ -TAC CCG CGT CCG C-3’ ；
42-mer oligo 的序列为 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGCGGG-3 ；
D、在步骤(C)中反应体系中补加20 U T4 DNA连接酶和I(T3 uM Telorette，并补充相应的Ix NEBuffer2和Ix ATP，使反应体积达到25 ul，35 1反应过夜，然后于65 °C反应20 min,灭活T4 DNA连接酶,获得DNA ;其中Telorette序列如下,可任选择其中一个序列5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3，；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3，；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3，。E、PCR反应体积为 12 ul，模板DNA 50 pg(步骤(3)获得)，Ix FailSafe PCR PreMixH, 0. I uM teltail 引物和 Adaptor 引物，I. 25 U FailSafe enzyme ;PCR 条件为
权利要求
1.一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于按步骤实现 A、限制性内切酶消化细胞中提取的gDNA经过MseI和NdeI两种限制性内切酶酶切摩尔比1:1; B、Linker寡核苷酸连接Linker通过互补配对连接到各个gDNA片断的5’-TA-3’ ；其中 linker 为 11+2-mer oligo 和 42-mer oligo ;ll+2_mer oligo 的序列为 5，_TAC CCGCGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列为 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGGTGC GGA CGC GGG-3 ； C、Telorette片断的连接telorette被连接到端粒的5，端；其中Telorette序列如下，可任选择其中ー个序列5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3’ ； D、PCR扩增端粒片段，其中引物为 5’-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3，，5，-TGC TCCGTG CAT CTG GCA TC-3，-标记物。
2.根据权利要求I所述的ー种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于按步骤实现A、提取gDNA ； B、取步骤A中的gDNAI ug,加入Msel/Ndel摩尔比1:1双酶切，同时加入IxNEBuf fer2 和 Ix BSA, 37 °C 反应过夜； C、10ng 消化后的 gDNA 片断于 65 °C加入 50 uM 42-mer oligo 和 50 uM ll+2-meroligo，反应体积为7 ul ;之后将反应温度由65で于I h内降至16 V ;加入20 U T4 DNA连接酶，Ix NEBuffer2和Ix ATP,于16 °C反应过夜； 其中 11+2-mer oligo 的序列为 5，-TAC CCG CGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列为 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGCGGG-3 ； D、在步骤(C)中反应体系中补加20U T4 DNA连接酶和I(T3 uM Telorette，并补充相应的Ix NEBuffer2和Ix ATP，使反应体积达到25 ul，35で反应过夜，然后于65で反应20 min,灭活T4 DNA连接酶,获得DNA ;其中Telorette序列如下,可任选择其中ー个序列5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3’ ； E、PCR反应体积为 12 ul，模板 DNA 50 pg (步骤(3)获得)，1x FailSafe PCR PreMixH, 0.1uM teltail 引物和 Adaptor 引物，1.25 U FailSafe enzyme ;PCR 条件为
3.根据权利要求2所述的ー种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于步骤(E)中所述的标记物包括放射性标记物和非放射性标记物，放射性标记物包括同位素32P或35S ;非放射性标记物包括生物素、地高辛、异硫氰酸荧光素、罗丹明、金或银。
4.根据权利要求2所述的ー种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于其中步骤(A)中gDNA来自于人皮肤成纤维细胞BJ和人肺成纤维细胞MR-90的生长期细胞和衰老细胞的gDNA。
5.根据权利要求2所述的ー种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于步骤(E)获得PCR结束后，以免疫印迹法检測。
全文摘要
本发明涉及一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法。本发明涉及一种改良的STELA法，可以有效快速地检测研究细胞染色体短端粒长度和所占的比例。该改良STELA法与传统的STELA法相比，在连接telorette之前多了一步连接反应。其可以检测最短端粒长度，而现有技术只能检测平均端粒长度，扩大应用范围，同时更加准确可以简便，快速，直观的测量样品中最短端粒的长度以及其所占的比例。
文档编号C12Q1/68GK102618633SQ20121002370
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者叶亚东, 叶汝章, 夏琰, 张娟, 朱文华, 杨紫俊, 滕凌, 潘鹂, 胡芳, 路易斯伊格纳罗, 霍世元 申请人:常州亚当生物技术有限公司