用于对单个细胞所具有的细胞毒性进行评价的组合物以及方法

用于对单个细胞所具有的细胞毒性进行评价的组合物以及方法
【专利说明】用于对单个细胞所具有的细胞毒性进行评价的组合物以及方法
[0001]本申请为申请号为200980155152.6的分案申请，要求2009年I月21日的优先权。发明领域
[0002]本发明提供了一种用于对发生在靶点与效应器细胞对之间的相互作用进行分析的方法，所述的方法利用高通量的筛选方法，用以对微阵列中的大量的单个细胞进行描述。
【背景技术】
[0003]尽管已经对发生在人类与所述的I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)之间的相互作用进行了超过二十五年的研宄，人类免疫缺陷病毒(HIV) /获得性免疫缺陷综合症(AIDS)仍然是全球健康的最为盛行的威胁之一。目前的评估表明，它将成为接下来的二十年内世界范围内的死亡率的第三大重要诱因，位列于癌症以及心血管疾病之后。目前仍然没有研发出一种能够预防感染或者引发天然机制用以对所述的疾病进行控制的疫苗。单纯利用现有的分析工具并不足以能够对那些与所述的免疫系统细胞相关的至关重要的特征进行定义，其中所述的免疫系统细胞能够提供有效的针对所述病毒的保护性的免疫力。例如流式细胞术以及免疫吸附检测(酶联免疫斑点检测ELISpot，酶联免疫吸附检测ELISA)这样的技术能够对细胞群体进行评价，但是对于稀少的事件而言具有差的敏感度。其他的重要功能，例如细胞毒性以及增殖作用，目前仅仅能够被进行批量的测量。同样的，如果在可能的情况下，这样的局限性使得以足够的清楚度对所述的人类免疫应答进行评价是困难的，其中所述的人类免疫应答是针对人类免疫缺陷病毒(HIV)而产生的，对于应答所进行的评价的目的在于确定保护作用的相关性。这样一来，迫切的需要一种新的方法，用以对针对病毒的保护性免疫力进行分析，其中所述的病毒例如是人类免疫缺陷病毒(HIV)。

【发明内容】

[0004]本发明提供了用以识别CD8+细胞的方法，所述的CD8+细胞能够对宿主体内的CD4+人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型细胞进行溶解，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种效应器CD8+细胞以及来自于宿主的靶向细胞的悬浮液，其中所述的悬浮液被沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有至少一个存在于微孔阵列之中的微孔，其中在所述的微孔阵列中的至少一个微孔中含有一个效应器细胞；在允许利用所述的CD8+细胞对所述的靶向细胞进行溶解的条件下对所述的悬浮液进行培养；对利用所述的效应器细胞对所述的靶向细胞所产生的溶解进行检测，并且识别出那些能够对CD4+人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型细胞进行溶解的CD8+细胞。任选的，对能够使所述的靶向细胞发生溶解的效应器细胞进行回收。优选的，对上述回收的效应器细胞进行培养，其中所述的效应器细胞对所述的靶向细胞进行了溶解。在一个方面，在将细胞沉积于所述的微孔内之前对所述的效应器细胞以及靶向细胞进行混合。或者可供选择的，在将细胞沉积于所述的微孔内之后对所述的效应器细胞以及靶向细胞进行混合。通过对一种被标记的细胞所具有的荧光性的变化进行监测的方式对溶解作用进行检测。或者可供选择的，通过对所述的靶向细胞所具有的细胞内的钙的水平的变化进行监测的方式对溶解作用进行检测。利用一种钙敏感性的荧光素染料对所述的钙进行检测。优选的，所述的钙敏感性荧光素染料是Fura2AM (Invitrogen)0
[0005]在一个方面，将所述的微孔阵列与一种底物进行接触，其中利用至少一种试剂对所述的底物进行了预处理，此后利用所述的试剂进行检测，其中所述的试剂能够特异性的检测出所述的效应器细胞的一种产物。所述的试剂是一种抗体，细胞因子，或者是溶解作用的可溶性的调节剂。优选的，所述的细胞因子是肿瘤坏死因子(TNF-α )或者干扰素-γ(IFN-y)o任选的，所述的溶解作用的可溶性调节剂是端粒酶B (GzB)或者穿孔蛋白。本发明所述的方法中任选的进一步包括利用CD69对一种效应器细胞进行标记。
[0006]本发明同样提供了一种对宿主体内的抗体应答进行鉴定的方法，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种来自于宿主的B细胞悬浮液，其中所述的悬浮液被沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一个微孔阵列之中的至少一个微孔，其中所述的宿主感染有人类免疫缺陷病毒(HIV)，或者所述的宿主被怀疑感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)，并且其中存在于所述的微孔阵列之中的至少一个微孔内含有一个单个的细胞；将所述的微孔阵列与一种底物进行接触，其中利用至少一种B细胞检测试剂对所述的底物进行了预处理；并且对所述的试剂进行检测，从而对所述的抗体应答进行鉴定。优选的，所述的B细胞检测试剂是一种对糖蛋白(gp) 120中的一个表位具有特异性的抗体。
[0007]在一个方面，本发明所述的方法中进一步的包括将所述的微孔阵列与第二种底物进行接触，其中利用至少第一种B细胞检测试剂对所述的底物进行了预处理。任选的，所述的第一种B细胞检测试剂是一种针对人类免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白(gp) 120的抗体。优选的，所述的抗体作用的是所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白(gp)120的所述C-末端。在一个方面，对由存在于所述的微孔阵列之中的所述B细胞生成的所述抗体的同型体进行测定。任选的对所述的B细胞进行分离，其中所述的B细胞能够表达一种与人类免疫缺陷病毒(HIV)发生反应的抗体。在另外一个方面，对所述抗体所具有的轻链以及重链可变区域进行了分离以及扩增。所述的B细胞被任选的暴露于一种试剂之下，其中所述的试剂能够刺激存在于所述的细胞之中的抗体的生成。优选的，所述的试剂是CD40L或者是一种抗-B细胞抗原受体(BCR)抗体。在另外一个方面，所述的B细胞被暴露于CD40L以及抗-B细胞抗原受体(BCR)抗体之下。
[0008]本发明同样提供了用以鉴定B细胞与多种人类免疫缺陷病毒(HIV)分离物之间的交叉反应性的方法，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种来自于宿主的B细胞悬浮液，其中所述的悬浮液被沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一个微孔阵列之中的至少一个微孔，其中所述的宿主感染有人类免疫缺陷病毒(HIV)，或者所述的宿主被怀疑感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)，并且其中存在于所述的微孔阵列之中的至少一个微孔内含有一个单个的细胞；将所述的微孔阵列与第一种底物进行接触，其中利用由存在于所述的至少一个微孔中的所述B细胞生成的抗体对所述的底物进行了预处理；将所述的底物与第一种经过标记的人类免疫缺陷病毒(HIV)病毒体以及第二种经过标记的人类免疫缺陷病毒(HIV)病毒体进行接触；并且确定所述的第一种经过标记的病毒体以及第二种经过标记的病毒体是否与所述的抗体进行了结合，其中所述的抗体是由在所述的微孔中的相同细胞生成的。任选的，对生成抗体的所述的B细胞进行回收，其中所述的抗体能够与所述的第一种经过标记的病毒体以及第二种经过标记的病毒体发生特异性的结合。在一个方面，对上述回收到的B细胞进行培养。优选的，所述的病毒体中的至少一种是经过标记的。或者可供选择的，所述的第一种病毒体以及第二种病毒体被进行了截然不同的标记，即，利用不同的可检测性的标记物对它们进行了标记。
[0009]本发明同样提供了用以生成效应器细胞的功能曲线的方法，其中所述的效应器细胞能够对宿主体内的一种人类免疫缺陷病毒(HIV)感染产生应答，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种效应器细胞群体，所述的效应器细胞选自由下述细胞所组成的组中:细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(⑶8+)，天然杀伤(NK)细胞(⑶16+)，天然杀伤(NK) T细胞(CDld+, Va 24+)，或者γ δ T (Vy 9+, V δ 2+)，其中所述的效应器细胞是从宿主处获得的，将所述的效应器细胞沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一个微孔阵列之中的至少一个微孔，其中存在于所述的微孔阵列之中的至少一个微孔内含有一个单个的效应器细胞，其中将所述的效应器细胞群体与一种同源的靶向细胞群体一同进行装载；对所述的效应器细胞进行可视化处理；对所述的效应器细胞所具有的细胞毒性进行评价；将所述的微孔阵列与第一种底物进行接触，其中利用一种试剂对所述的底物进行了预处理，所述的试剂能够对白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a )、以及干扰素-γ (IFN-γ )中的一种或者多种进行特异性的检测；并且确定存在于所述的微孔之中的效应器细胞是否与所述的一种或者多种试剂进行了结合。在一个方面，所述的细胞毒性是通过检测钙黄绿素AM (Calcein AM)的释放的方式来进行评价的。任选的，利用一种或者多种特异性的表面标记物蛋白质对所述的细胞进行了标记。优选的，所述的表面标记物蛋白质是CD62L，趋化因子受体3 (CXCR3)，趋化因子受体4 (CCR4)，或者趋化因子受体7 (CCR7)。在另外一个方面，从一个或者多个微孔中进行效应器细胞的回收。任选的，对上述回收的细胞进行培养从而获得所述的回收细胞的克隆性的扩增。任选的对存在于所述的回收细胞之中的一种或者多种基因的表达进行鉴定。所述的被回收的细胞优选是⑶8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，天然杀伤(NK)细胞，天然杀伤(NK)T细胞，或者γ δΤ细胞。在另外一个方面，所述的宿主是一种处于急性阶段的感染，一种高度活跃的抗逆转录病毒治疗(HAART)宿主，或者是一种杰出的控制者(elitecontroller)。
[0010]本发明同样提供了用以对宿主体内的一种先天性免疫应答进行评价的方法，其中所述的免疫应答针对的是一种人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种来自于宿主的天然杀伤(NK)细胞悬浮液，其中所述的悬浮液被沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有存在于一个微孔阵列之中的至少一个微孔，其中所述的宿主感染有人类免疫缺陷病毒(HIV)，或者所述的宿主被怀疑感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)，并且其中存在于所述的微孔阵列之中的至少一个微孔内沉积有一个单个的细胞；并且将所述的微孔阵列与一种底物进行接触，其中利用至少一种天然杀伤(NK)细胞检测试剂对所述的底物进行了预处理；并且对所述的试剂进行检测，从而对天然杀伤(NK)细胞进行检测并且对所述的先天性免疫应答进行评价。在一个方面，使用NKp4-Cy3、CD107a-Alexa647、和/或CD69_Alexa488对所述的天然杀伤(NK)细胞进行检测。所述的天然杀伤(NK)细胞检测试剂能够对天然杀伤(NK)细胞进行检测。在被沉积在所述的可模压成型的平板上之前，任选的对所述的细胞进行共同培养。优选的，利用白细胞介素-12(IL-12)以及白细胞介素-18 (IL-18)对所述的细胞进行共同培养。
[0011]本发明同样提供了用以对天然杀伤(NK)细胞群体中的克隆多样性进行评价的方法，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种天然杀伤(NK)细胞以及来自于宿主的靶向细胞的悬浮液，其中所述的悬浮液被沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有至少一个存在于微孔阵列之中的微孔，其中在所述的微孔阵列中的至少一个微孔中含有一个单个的效应器细胞；在允许利用所述的天然杀伤(NK)细胞对所述的靶向细胞进行溶解的条件下对所述的悬浮液进行培养；对利用所述的效应器细胞对所述的靶向细胞所产生的溶解进行检测，并且对所述的效应器细胞进行识别，从而对存在于所述的天然杀伤(NK)细胞群体中的克隆多样性进行评价。在一个方面，对能够使所述的靶向细胞发生溶解的效应器细胞进行回收并且任选的对其进行培养。在另外一个方面，对已经使所述的靶向细胞发生溶解的天然杀伤(NK)细胞进行回收。任选的，在将细胞沉积于所述的微孔内之前对所述的天然杀伤(NK)细胞以及靶向细胞进行混合。或者可供选择的，在将细胞沉积于所述的微孔内之后对所述的天然杀伤(NK)细胞以及靶向细胞进行混合。在一个方面，通过对一种被标记的细胞所具有的荧光性的变化进行监测的方式对溶解作用进行检测。在另外一个方面，对已经使所述的靶向细胞发生溶解的天然杀伤(NK)细胞进行分离并且对存在于所述的天然杀伤(NK)细胞之上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因进行检测。所述的微孔阵列任选的与一种底物进行了接触，其中利用至少一种试剂对所述的底物进行了预处理，所述的试剂能够特异性的检测出所述的天然杀伤(NK)细胞的一种产物；并且对所述的试剂进行检测。所述的试剂是一种抗体，细胞因子，或者是溶解作用的可溶性的调节剂。优选的，所述的细胞因子是肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、以及干扰素-γ (IFN-γ)。
[0012]本发明同样提供了用以对天然杀伤(NK)细胞以及B细胞群体中的多样性进行评价的方法，所述的方法是通过下述方式来实现的:提供一种细胞悬浮液，所述的悬浮液中包括扩展的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型CD4+细胞T细胞，活化的天然杀伤(NK)细胞，以及B细胞和靶向细胞，其中所述的悬浮液被沉积在一种可模压成型的平板之上，在所述的平板上含有存在于微孔阵列中的至少一个微孔，其中存在于所述的微孔阵列之中的至少一个微孔中含有一个单个的T细胞；在允许所述的抗体与T细胞的表面进行结合的条件下对细胞进行培养，其中所述的抗体是由B细胞生成的；对含有B细胞、天然杀伤(NK)细胞、以及溶解的T细胞的孔进行识别，并且对B细胞或者天然杀伤(NK)细胞进行识别。在一个方面，利用白细胞介素-2 (IL-2)对所述的天然杀伤(NK)细胞进行活化。在另外一个方面，利用CD40L或者抗-B细胞抗原受体(BCR)对所述的B细胞进行活化。在另外一个方面，利用一种抗-B细胞抗原受体(BCR)抗体的CD40L对所述的B细胞进行活化。任选的，从所述的孔中对所述的B细胞或者天然杀伤(NK)细胞进行回收；并且对所述的B细胞所具有的一种或者多种性质进行鉴定。在另外一个方面，对存在于所述的B细胞之中的抗体基因进行鉴定。任选的对存在于所述的B细胞之中的编码抗体的基因所具有的VDJ区域进行分析。在允许抗体与所述的底物进行连接的条件下任选的将所述的微孔阵列与一种底物进行接触，其中所述的抗体是有所述的B细胞生成的。在另外一个方面，将所述的底物与来自于一个人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型细胞的溶解产物进行接触，并且对含有由B细胞生成的抗体的孔进行识别，其中所述的抗体与所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)溶解产物或者一种抗-免疫球蛋白G3抗体进行了结合。优选的，对含有B细胞生成的抗体的孔进行了识别，其中所述的抗体与所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)溶解产物或者抗-免疫球蛋白G3抗体进行了结合。
[0013]通过下述对于优选实施方式的描述，并且通过下述的权利要求，本发明所具有的其他的特征以及优点将变得显而易见。除非另外定义，在本发明中所使用的所有的技术术语以及科学术语将具有与发明所属技术领域的普通技术人员普遍理解的含义相同的含义。尽管那些与本发明中所描述的相类似或者相等价的方法以及材料可以被用来进行本发明的实践或者测试，但在下文中对适合的方法以及材料进行了描述。在本发明中提及的所有的公开出版物、专利申请、专利、以及其他的参考文献中的全部内容被引入作为参考。如果遇到矛盾，本说明书，包括定义，将占主导地位。除此之外，所述的材料、方法、以及实施例仅仅是描述性的并且并不意在构成限制。
[0014]本发明所具有的其他的特征以及优点将通过下面详细描述的说明书以及权利要求而变得显而易见。
【附图说明】
[0015]附图1是一种检测方案的图示。将所述的细胞，经过荧光素标记的靶向(利用钙黄绿素进行了染色，绿色)以及效应器(利用α-⑶8抗原呈递细胞(APC)进行了染色，粉色)装载在大约30微摩的微孔阵列之中并且利用荧光显微镜对其进行了成像。在此之后利用玻璃盖玻片对所述的微孔阵列进行了覆盖并且在37°C、5%的二氧化碳条件下进行了 2-6小时的培养，其中利用捕获抗体对所述的玻璃盖玻片进行了预先的官能团化。经过培养之后，使用特异性的荧光素抗体对存在于所述的玻璃盖玻片之上的分泌出的细胞因子进行检测，并且利用缺乏荧光性的特性对由特异性的效应器所溶解的靶向进行成像(孔I)。在仅仅含有靶向细胞的微孔中(孔2)以及在含有不能够溶解所述的靶向的效应器的微孔中(孔3)，所述的靶向所具有的荧光性应当仅仅发生了非常微小的变化。
[0016]附图2是经过标记的靶向以及效应器的一系列代表性的荧光成像，所述的成像发生在培养之前以及培养之后(O小时以及4小时)。(A)钙黄绿素染色(绿色)，肽负载(KKlO)的靶向(可以看到3个独立的细胞);(B)利用α -⑶8-抗原呈递细胞(APC)进行标记(粉色)的效应器；(C)效应器(粉色)以及未负载(没有进行KKlO肽的添加)的靶向(绿色)的共同培养物；(D)效应器(粉色)以及负载有KKlO肽的靶向(绿色)的共同培养物。仅仅当效应器能够对负载有肽的靶向进行识别时，才会发生靶向的溶解(如D中所示)。
[0017]附图3是一组⑶4 T细胞的荧光成像，其中利用一种表达NL4-3病毒的绿色荧光蛋白(GFP)对所述的T细胞进行了感染。所述的绿色细胞标记着感染。
[0018]附图4是一系列的荧光成像，表示的是人类免疫缺陷病毒(HIV)特异性⑶8+ T细胞克隆与B细胞的共同培养物，其中所述的B细胞负载有钙黄绿素AM标记的人类免疫缺陷病毒(HIV)肽。通过荧光素信号的损失标记着由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的溶解作用。
[0019]附图5是一组荧光成像，表示的是抗原呈递细胞(APC)标记的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(红色)与钙黄绿素AM标记的B-细胞(绿色)的共同培养物。钙黄绿素AM荧光性淬火代表的是由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的杀伤。