细胞毒性t细胞诱导剂的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于即使没有佐剂也可使肽发挥作为疫苗的充分的效果，本发明提供一种细胞毒性T细胞诱导剂，其特征在于，其为含有由猿猴病毒40的VP1构成的病毒样颗粒的细胞毒性T细胞诱导剂，在上述VP1的DE环和／或HI环中插入有T细胞表位肽。
【专利说明】细胞毒性T细胞诱导剂【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞毒性T细胞(CTL)诱导剂、以及利用其的病毒性疾病或癌症的预防或治疗方法。
【背景技术】
[0002]猿猴病毒(Simian virus)40 (SV40)属于乳多空病毒科,是猿猴多瘤病毒的一种，是小形且没有被膜的肿瘤病毒。
[0003]SV40病毒的外壳由被称为VPl的主衣壳蛋白构成。当使VPl基因在昆虫细胞内等高表达时，VPl被大量合成，在细胞的核内自组装形成很多病毒样颗粒(VLP)。由本发明的发明人等提出在该VLP的内部封入药剂等，用作药物递送的方案(国际公开2006/004173)。
[0004]本发明的发明人等确认，当在VPl中插入外源性肽时，大多情况下无法形成正常的VLP，但是在VPl中的DE环、HI环中插入时则形成正常的颗粒。利用该性质，在DE环、HI环插入外源性肽，能够改变VLP的细胞指向性(专利文献I)。
[0005]一直以来进行着利用该VLP制作疫苗。例如，在专利文献2中记载了包含结合有CTL表位肽的VLP的CTL疫苗。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本国际公开2006/088229
[0009]专利文献2:日本特开2009-197001号公报
【发明内容】
[0010]发明所要解决的课题
[0011]为了破坏病毒感染细胞等而利用源自病毒的肽作为疫苗。但是，肽的滞留性差，而且易于分解，因此通常与佐剂一起给药。但是，佐剂多存在副作用，对人给药时存在问题。
[0012]本发明就是在上述这样的技术背景下进行的，其目的在于提供一种即使没有佐剂，也能够使肽发挥作为疫苗的充分的效果的手段。
[0013]用于解决课题的方法
[0014]本发明的发明人为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现，由将T细胞表位肽插入DE环、HI环而得到的改变型VPl构成的VLP显示很强的CTL诱导性。
[0015]在专利文献I中公开了由在DE环、HI环插入外源性肽而得到的改变型VPl构成的VLP。但是，在专利文献I中，外源性肽是专门为了改变VLP的细胞指向性而插入的，使用外源性肽诱导CTL的思想在专利文献I中没有公开。此外，在专利文献I的权利要求10等中记载了作为外源性肽使用抗原表位，但该抗原表位是为了 VLP能够与抗体结合而使用的。即，专利文献I中记载的“表位”是被抗体识别的表位，而不是被T细胞识别的表位(T细胞表位)。
[0016]在专利文献2中公开了包含结合有CTL表位肽的VLP的CTL疫苗(权利要求182等)。但是，专利文献2中没有公开在猿猴病毒40的VPl的DE环和/或HI环中插入CTL表位肽。另外，本发明的CTL诱导剂即使没有免疫刺激物质也具有充分的CTL诱导效果，但在引用文献2中公开的疫苗包含含有非甲基化CpG的寡核苷酸等免疫刺激物质(权利要求1)，这点与本发明的CTL诱导剂不同。
[0017]本发明就是基于以上认知而完成的。
[0018]即，本发明提供以下的(I)~(10)。
[0019](I)一种CTL诱导剂，其特征在于，其为含有由猿猴病毒40的VPl构成的病毒样颗粒的CTL诱导剂，且上述VPl的DE环和/或HI环中插入有T细胞表位肽。
[0020](2)如在(I)中记载的CTL诱导剂，其特征在于，T细胞表位肽为源自病毒蛋白质的肽。
[0021](3)如在(I)中记载的CTL诱导剂，其特征在于，T细胞表位肽为源自流感病毒的HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2 或 PB1-F2 的肽。
[0022](4)如在(I)中记载的CTL诱导剂，其特征在于，T细胞表位肽为源自对癌细胞特异性的蛋白质的肽。
[0023](5)如在(I)中记载的CTL诱导剂，其特征在于，T细胞表位肽为源自Melan-A/MART-1、gplOO、MAGE-A3、MAGE-AlO、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1 或 hTERT 的肽。
[0024](6)如在(I)中记载的CTL诱导剂，其特征在于，T细胞表位肽为由序列号I至39中任意一个序列号所记载的氨基酸序列构成的肽。
[0025](7) 一种人以外的动物的病毒性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自病毒蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人以外的动物进行给药。
[0026](8) 一种人以外的动物的癌症的预防或治疗方法，其特征在于，将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自对癌细胞特异性的蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人以外的动物进行给药。
[0027](9)一种人的病毒性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自病毒蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人进行给药。
[0028](10) 一种人的癌症的预防或治疗方法，其特征在于，将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自对癌细胞特异性的蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人进行给药。
[0029]发明的效果
[0030]本发明的CTL诱导剂所含的VLP即使没有佐剂也具有很强的CTL诱导效果。因此，本发明的CTL诱导剂能够不产生副作用地进行病毒性疾病、癌症的预防或治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1是表示Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的裂解物以及细胞团溶液在SDS-PAGE后的CBB染色的结果的图。制备的裂解物和细胞团溶液的一部分在10%SDS-PAGE中展开，用CBB染色。Ml-DE-VLP的裂解物在左图的泳道1-4，泳道1、2将不含CpG佐剂的试样展开，泳道
3、4将含有CpG佐剂的试样展开。Ml-DE-VLP的细胞团在左图的泳道5_6，泳道5、6将不含CpG佐剂的试样展开，泳道7、8将含有CpG佐剂的试样展开。Ml-H1-VLP的裂解物在右图的泳道1-4，泳道1、2将不含CpG佐剂的试样展开，泳道3、4将含有CpG佐剂的试样展开。Ml-H1-VLP的细胞团在右图的泳道5-6，泳道5、6将不含CpG佐剂的试样展开，泳道7、8将含有CpG佐剂的试样展开。
[0032]图2是表示Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的裂解物以及细胞团溶液的足垫免疫后的细胞内细胞因子染色(ICS, Intracellular cytokine staining)分析结果的图。将Ml-DE-VLP(A、B)和Ml-H1-VLP (C、D)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮(A、C)以及利用吹打进行重悬浮(B、D))对转基因小鼠进行免疫，一周后用ICS分析。另外，将Ml-DE-VLP (E、F)和Ml-H1-VLP (G、H)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮(E、G))以及裂解物溶液(F、H)对转基因小鼠进行免疫，两周后用ICS分析。CpG (_)表示没有加入CpG佐剂，CpG+表示加入了 CpG佐剂。另外，肽刺激(P印tide pulse) (Ml flu M58-66)(-)表示没有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(Mlflu M58-66)+表示通过添加上述序列而对CTL进行再诱导。各图的右上框内的点表示CD8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞，框内的数字表示该细胞的比例。
[0033]图3是表示Ml-DE-VLP和M1-H1-VLP在不同的免疫途径中的ICS分析结果的图。将Ml-DE-VLP (左图)和Ml-H1-VLP (右图)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以足跟关节、静脉内、腹腔内、肌肉内、鼻腔内的途径进行免疫，一周后进行ICS分析。肽刺激(Mlflu M58-66)(-)表示没有添加 CTL 表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(MlfIu M58-66) +表示通过添加上述序列而对CTL再诱导。另外，“脾”表示从脾脏提取的淋巴细胞，“肺”表示从肺提取的淋巴细胞。各图的右上框内的点表示CD8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞,框内的数字表示该细胞的比例。
[0034]图4是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫时的CD107-1CS分析结果的图。将Ml-DE-VLP (左图)和Ml-H1-VLP (右图)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内、腹腔内的途径进行免疫，一周后进行CD107-1CS分析。肽刺激(Mlflu M58_66)(_)表示没有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(Mlflu M58-66) +表示通过添加上述序列而对CTL再诱导。另外，“脾”表示从脾脏提取的淋巴细胞。各图的右上框内的点分别表示⑶8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞(上图)、⑶8阳性细胞中的⑶107阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞(下图)，框内的数字表示该细胞的比例。
[0035]图5是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫时的51铬释放分析结果的图。将Ml-DE-VLP (左图)和Ml-H1-VLP (右图)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内、腹腔内的途径进行免疫，一周后取出淋巴细胞进行培养，用于51铬释放分析，培养一周后进行51铬释放分析。(_)表示来自没有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)的靶细胞的铬释放的比例，Ml:58-66表示来自添加了上述序列的靶细胞中的铬释放的比例。
[0036]图6是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫时的In vivo CTL分析结果的图。将Ml-DE-VLP (左图)和Ml-H1-VLP (右图)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内、腹腔内的途径进行免疫，一周后，进行CFSE染色，将混合了 CTL表位序列(GILGFVFTL)的淋巴细胞(CFSE高)和未混合的淋巴细胞(CFSE低)以相同数量静脉注射导入，一天后进行In vivo CTL分析。各图表示小鼠的淋巴细胞中的CFSE染色的细胞的CFSE强度(横轴)和细胞数(纵轴)。图中的(_)表示使用没有免疫的小鼠的淋巴细胞的情况，Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP分别表示使用以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫的小鼠的淋巴细胞的情况。框内的字表示利用以下的式子算出的对于淋巴细胞的特异性的损伤率。特异性的损伤率(％)=(1-r (control)/r (immunized))X 100,其中，r (control)表示没有免疫的小鼠中的(CFSE低的淋巴细胞数/CFSE高的淋巴细胞数)，r (immunized)表示免疫后的小鼠中的(CFSE低的淋巴细胞数/CFSE高的淋巴细胞数)。
[0037]图7是表示Ml-DE-VLP和M1-H1-VLP的添加引起的淋巴细胞的成熟化的图。在6小时后(各个的左图)以及24小时后(各个的右图)，回收没有任何添加(直方图中灰色的区域)、添加了 50%0pt1-preepTM溶液的(上段、直方图中粗线、中空)、添加了 Ml-DE-VLP(中段、直方图中粗线、中空)、添加了 Ml-H1-VLP (下段、直方图中粗线、中空)的淋巴细胞，用FITC-抗⑶80抗体(左)、FITC-抗⑶86抗体(中央)、FITC-抗⑶40抗体(右)染色，进行直方图分析。纵轴表示细胞数，横轴表示FITC的强度。用FITC-抗⑶86抗体以及FITC-⑶40抗体染色的以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP孵育的淋巴细胞(直方图中粗线、中空)中，与没有任何添加(直方图中灰色的区域)相比，直方图向右偏。这表示因为CD86和CD40在淋巴细胞表面表达，所以相对于没有任何添加的淋巴细胞，FITC-抗⑶86抗体和FITC-抗⑶40抗体更多地与淋巴细胞表面结合。
[0038]图8是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫时对流感病毒的病毒挑战实验分析结果的图。〔图8-aWfMl-DE-VIi^PMl-H1-VLP的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内、腹腔内的途径免疫，一周后，对免疫的小鼠实施麻醉后，使流感A病毒(A/H1N1/PR8以及A/H3N2/Aich1、浓度:100TCID50/20μl、接种量:20 μl)经鼻感染，4天后从肺制备提取液，根据红细胞的凝集的分布，以组织培养流感病毒的感染量(tissue culture influenzavirus infectious dose,TCID5tl)算出在该提取液中所含的流感病毒量。左边的表表示感染A/H1N1/PR8后的小鼠肺的流感病毒量的结果，右边的表表示感染A/H3N2/Aichi后的小鼠肺的流感病毒量的结果。免疫物(_)表示没有免疫的小鼠，Ml-DE-VLP表示用Ml-DE-VLP免疫的小鼠的肺的提取液每Iml所含的流感病毒量的组织培养流感病毒的感染量(TCID50),Ml-H1-VLP表示用Ml-H1-VLP免疫的小鼠的肺的提取液每Iml所含的流感病毒量的组织培养流感病毒的感染量(TCID5Q)。〔图8-b〕将Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内、腹腔内的途径免疫，一周后，对免疫的小鼠实施麻醉后，使流感A病毒(A/H1N1/PR8、浓度:100TCID5(l/20 μ l、接种量:20 μ l)经鼻感染，将此时的小鼠的体重设为100%，2周每天分析小鼠的体重变化。左图表示没有免疫的小鼠的体重变化，中央表示用Ml-DE-VLP免疫的小鼠的体重变化，右图表示用Ml-H1-VLP免疫的小鼠的体重变化。
[0039]图9〔图9-a〕是表示WT1WT-DE-VLP和WT1WT-H1-VLP的裂解物和细胞团溶液在SDS-PAGE后的CBB染色的结果的图。将制备的裂解物和细胞团溶液的一部分在10%SDS-PAGE中展开，用CBB染色。WT1WT-DE-VLP的裂解物为泳道3，WTlffT-DE-VLP的细胞团为泳道4，WTlffT-H1-VLP的裂解物为泳道5，WTlffT-H1-VLP的细胞团为泳道6。〔图9-b〕是表示WT1WT-DE-VLP和WT1WT-H1-VLP的不同的免疫途径中的ICS分析结果的图。将WTlffT-DE-VLP (图9-b、上段)和WT1WT-H1-VLP (图9_b、下段)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内(WTlWT-DE-VLP)、腹腔内(WTlWT-H1-VLP)的途径免疫，一周后进行ICS分析。肽刺激(RMFPNAPYL) (_)表示没有添加CTL表位序列(RMFPNAPYL)，肽刺激(RMFPNAPYL)+表示通过添加上述序列而对CTL再诱导。各图的右上框内的点表示⑶8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞，框内的数字表示该细胞的比例。〔图9-c〕是表示以WT1WT-DE-VLP和WT1WT-H1-VLP免疫时的51铬释放分析结果的图。将Ml-DE-VLP (左图)和M1-H1-VLP (右图)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以肌肉内、腹腔内的途径免疫，一周后取出淋巴细胞进行培养，用于51铬释放分析，培养一周后，进行51铬释放分析。(_)表示从没有添加CTL表位序列(RMFPNAPYL)的靶细胞的铬释放的比例，WTlffT表示从添加了上述序列的靶细胞中的铬释放的比例。
[0040]图10是表示通过ICS分析比较IFA (弗氏不完全佐剂，incomplete freund’ sadjuvant)和M1-DE-VLP、M1-H1-VLP的CTL诱导的结果的图。在将Ml:58_66的CTL表位序列(GILGFVFTL)的肽用IFA悬浮得到的乳浊液以皮下内(s.c.)的途径进行一次免疫(左上图)、以及一次免疫一周后进行第二次免疫(左下图)，经过一周后的小鼠；以及将Ml-DE-VLP(右上图)和Ml-H1-VLP (右下图)的细胞团溶液(利用超声波处理进行重悬浮)以皮下内(s.c.)的途径进行免疫，经过一周后的小鼠进行ICS分析。肽刺激(Ml:58-66)(-)表示没有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(Ml: 58-66)+表示通过添加上述序列而对CTL再诱导。另外，“脾”表示从脾脏提取的淋巴细胞。各图的右上框内的点表示CD8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞，框内的数字表示该细胞的比例。
[0041 ] 图11是表示利用ELISA分析以M1-DE-VLP和M1-H1-VLP孵育时的脾脏提取淋巴细胞的IL-12的分泌量的结果的图。表的左边的optiprep表示仅为溶解有VLP的溶剂，wild-type-VLP表示没有插入CTL表位的野生型的VLP，LPS表示用脂多糖(Iipopolysaccharide)孵育从脾脏提取的淋巴细胞。中央表示孵育时间，右边表示利用ELISA算出的培养淋巴细胞的培养上清的IL-12的浓度。
【具体实施方式】`
[0042]以下，详细地说明本发明。
[0043]本发明的CTL诱导剂的特征在于，含有由猿猴病毒40的VPl构成的病毒样颗粒，且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有T细胞表位肽。
[0044]本发明中使用的T细胞表位肽只要能够诱导CTL就没有特别限定。作为T细胞表位肽，已知有源自病毒蛋白质的肽和源自对癌细胞特异性的蛋白质的肽等，但在本发明中，能够使用这些肽中的任意的肽。其中，此处“对癌细胞特异性的蛋白质”是指在正常细胞中不表达而仅在癌细胞中表示的蛋白质，或与正常细胞相比较在癌细胞中表达增加的蛋白质。
[0045]作为源自病毒蛋白质的肽，可以例示源自流感病毒的HA、NA、Ml、M2、NP、NSl、NS2、PA、PB1、PB2、PB1-F2等蛋白质的肽。这些之中，优选源自流感病毒的Ml、NP、NSl、PA、PBl、PB2等蛋白质的肽。作为具体的肽，为作为源自流感病毒的Ml的肽的GILGFVFTL (序列号I),ASCMGLIY (序列号 2)、SIIPSGPLK (序列号 3)、ILGFVFTLTV (序列号 4);作为源自 NP 的肽的 CTELKLSDY (序列号 5)、LPFEKSTVM (序列号 6)、ILRGSVAHK (序列号 7)、ELRSRYWAI (序列号8)、SRYWAIRTR (序列号9);作为源自PBl的肽的NMLSTVLGV (序列号10)、RIFLAMIITI(序列号11)、VSDGGPNLY (序列号12);作为源自PB2的肽的VLTGNLQTL (序列号13)、作为源自NSl的肽的IILKANFSV (序列号14)等。[0046]作为源自流感病毒以外的病毒的蛋白质的肽，可以例示源自HIV的Gag、Pol、Env、Tat、Nef、Rev的肽、源自丙型肝炎病毒(HCV)的El、E2、Core、NS2、NS3、NS4、NS5的肽、源自人乳头状瘤病毒(HPV)的E6、E7的肽等。
[0047]作为源自对癌细胞特异性的蛋白质的肽，可以例示源自Melan-A/MART-1、gplOO、MAGE-A3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-l、WT-UhTERT 等蛋白质的肽。这些之中，优选源自HER2/new、WT-l、MAGE-A3等蛋白质的肽。作为具体的肽，可以例示作为源自HER2/new的肽的 ALCRWGLLL (序列号 15)、QLFEDNYAL (序列号 16)、KIFGSLAFL (序列号 17)、ILHNGAYSL(序列号 18)、IISAVVGIL (序列号 19)、VVLGVVFGI (序列号 20)、RLLQETELV (序列号 21)、VMAGVGSPYV (序列号 22)、CLTSTVQLV (序列号 23)、QLMPYGCLL (序列号 24)、YLEDVRLV (序列号25)、VLVKSPNHV (序列号 26)、YMMVKCWMI (序列号 27)、ELVSEFSRM (序列号 28)、VLRENTSPK(序列号 29)、RWGLLLALL (序列号 30)、TYLPTNASL (序列号 31 )、PYVSRLLGI (序列号 32);作为源自WT-1的肽的RMFPNAPYL (序列号33)、SLGEQQYSV (序列号34)、CMTffNQMNL (序列号35)、YMFPNAPYL (序列号 36)、CMTWNQMNL (序列号 37)、CYTWNQMNL (序列号 38)、RWPSCQKKF(序列号39)等。
[0048]在环中插入的T细胞表位肽的长度只要能够诱导CTL就没有限定，通常为3~27个氨基酸，优选为8~11个氨基酸，更优选为9个氨基酸。
[0049]DE环处于从VPl的N末端开始数的127-146位，HI环处于268-277位(国际公开2006/088229)。T细胞表位肽可以插入到这些环中的任意一个，对于DE环来说，优选以137-138位的氨基酸序列被T细胞表位肽取代的方式插入T细胞表位肽，对于HI环来说，优选以273-274位的氨基酸序列被T细胞表位肽取代的方式插入T细胞表位肽。另外，在插入到环中的T细胞表位肽的两端，通常插入有I~数个间隔氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等(国际公开2006/088229)。间隔氨基酸的个数通常为I~9个，优选为I~6个，更优选为3~6个。
[0050]T细胞表位肽既可以插入DE环和HI环的两者中，也可以仅插入一者。另外，在插入两者的情况下，既可以插入相同的T细胞表位肽，也可以插入不同的T细胞表位肽。此外，还可以在环中串联插入两个以上的T细胞表位肽。
[0051]由在环中插入有外源性肽的VPl构成的病毒样颗粒的制作方法记载于国际公开2006/088229，因此能够按照该方法制作由在环中插入有T细胞表位肽的VPl构成的病毒样颗粒。例如，制作插入有编码T细胞表位肽的碱基序列的改变型VPl基因，使用杆状病毒载体等使该改变型VPl基因在昆虫细胞内等高表达，由此能够制作目标病毒样颗粒。
[0052]本发明的CTL诱导剂对应于作为有效成分的物质的性状，制成一般的医药组合物的形态，组合物的直接送达一般通过非口服的注射(例如皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射、向组织间隙的空间注射等)实现。作为其他的给药法，可以列举粘膜给药(例如经口、经鼻或肺)、通过眼的给药、经皮给药以及栓剂。
[0053]即，在非口服给药的情况下，能够以注射剂、经鼻剂、局部给药剂(经皮剂等)、直肠给药剂等给药形态给药。在口服给药的情况下，通常能够以本领域中使用的给药形态给药。作为注射剂，可以列举例如无菌的溶液或混悬液、乳剂等，具体而言，可以列举水、水一丙二醇溶液、缓冲化液、0.4%的生理食盐水等。另外，制成液体制剂的情况下，能够通过冷冻保存或冷冻干燥等除去水分而进行保存。冷冻干燥制剂在使用时加入注射用蒸馏水等再溶解使用。作为局部给药剂，可以列举例如乳膏、软膏、洗剂、经皮剂等。作为口服剂或直肠给药剂，可以列举例如胶囊、片剂、丸剂、散剂、滴剂、栓剂、液剂等。
[0054]以上的剂型可以利用通常在本领域进行的方法，与药学上可接受的赋形剂、添加剂一起制剂化。作为药学上可接受的赋形剂、添加剂，可以列举载体、结合剂、香料、缓冲剂、增粘剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、助悬剂、防腐剂、PH调节剂、张力调节剂、浸润剂等。另外，作为药学上可接受的载体，可以列举例如碳酸镁、乳糖、果胶、淀粉、甲基纤维素等。
[0055]本发明的CTL诱导剂即使没有佐剂也具有充分的CTL诱导效果，因此既可以不含佐剂，也可以含有佐剂。作为使用的佐剂，可以列举氢氧化铝凝胶、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、百日咳菌佐剂、聚(I，C)、CpG-DNA等。
[0056]制剂中的T细胞表位肽的给药量、制剂的给药次数根据T细胞表位肽的种类、给药对象的症状、年龄、体重、给药形态等而不同，通常为0.01 μ g~Img,优选为0.1 μ g~500 μ g，更优选为1.0 μ g~100 μ g，优选将其在数日或数月中给药I次。例如，在初期免疫(即，治疗性或预防性给药)中，对成人患者将1.0μ g~500μ g的肽进行给药，根据由患者血液中的特异性的CTL活性测定所得到的患者的应答以及状态，按照从数周至数个月的加强疗法，继续将1.0 μ g~100 μ g的肽进行加强给药。
[0057]本发明的CTL诱导剂 能够作为病毒性疾病的预防或治疗用疫苗、各种癌症的预防或治疗用疫苗使用。
[0058]本发明的CTL诱导剂能够将人或人以外的动物作为给药对象。作为人以外的动物，可以列举家畜(例如牛、马、猪、鸡等)、宠物动物(例如狗、猫等)、实验动物(小鼠、大鼠等)
坐寸ο
[0059]本发明的CTL诱导剂也能够在如以下的预防或治疗方法中利用。
[0060](A) 一种预防或治疗人的病毒性疾病的方法，其将由猿猴病毒40的VPl构成的且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自病毒蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人进行给药。
[0061](B) 一种预防或治疗人以外的动物的病毒性疾病的方法，其将由猿猴病毒40的VPl构成的且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自病毒蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人以外的动物进行给药。
[0062](C) 一种预防或治疗人的癌症的方法，其将由猿猴病毒40的VPl构成的且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自对癌细胞特异性的蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人进行给药。
[0063](D) 一种预防或治疗人以外的动物的癌的方法，其将由猿猴病毒40的VPl构成的且在上述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自对癌细胞特异性的蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人以外的动物进行给药。
[0064]实施例
[0065]以下，通过实施例对本发明进行更详细地说明。
[0066]〔实施例1〕MlCTL表位插入SV40VP1基因的制作
[0067]将流感病毒颗粒内部蛋白质Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)(该表位序列为对于人的MHC class I的HLA-A * 0201的表位序列。)插入SV40VP1。具体而言，将VPl的DE环区域(137-138氨基酸区域，经典地将VPl基因的第4位的Ala作为氨基酸序号I)或者将HI环区域(273-274氨基酸区域)用GILGFVFTL取代，制作了 MlCTL表位插入SV40VP1插入突变体(M1-DE-VP1、M1-H1-VP1)。制作方法是以编码 SV40VP1 的 pFastBacl_SV40wild typeVPl作为模板，按照Overhang PCR法制作。引物使用以下的序列。
[0068]Ml-DE-VPl制作用引物
[0069]1st round
[0070]5’-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0071]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列号 40) 3’_DE21oop (Ml)
[0072]CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCATGAGTTTTTTGTGTCCCTGAATG (序列号 41)
[0073]5’_DE21oop (Ml)
[0074]CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGTGCTGGAAAACCCATTCAAG (序列号 42)
[0075]3’-Kpn1-SV40VPl
[0076]AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列号 43)
[0077]2nd round
[0078]5’-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0079]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列号 44) 3，-Kpn1-SV40VPl
[0080]AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列号 45) Ml-H1-VPl 制作用引物
[0081]1st round
[0082]5’-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0083]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列号 46) 3，-HIlloop (Ml)
[0084]CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCGTTGGTAAACAGCCCACAAATG (序列号 47)
[0085]5，-HIlloop (Ml)
[0086]CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGAACACAGCAGTGGAAGGG (序列号 48)
[0087]3’-Kpn1-SV40VPl
[0088]AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列号 49) 2nd round
[0089]5’-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0090]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列号 50) 3，-Kpn1-SV40VPl[0091 ] AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列号 51)
[0092]模板使用IOng,引物逐次加入 50pmol,制备 KOP polymerase2.5units,0.2mMdNTPs, ImM MgCl2, 6mM(NH4)2SO4, IOmM KCl，120mM Tris-HCl (pH8.0),0.l%TritonX-100,0.0OP/oBSA的浓度的混合溶液30 μ I。
[0093]PCR在1st round,2nd round时都在98 °C保温60秒后，重复25次以下的循环(98°C 15秒、59°C 15秒、74°C 30秒)，最后在74°C保温I分30秒，转移至4°C。
[0094]将由Overhang PCR制作的PCR片段用限制性内切酶KpnI和SalI切断，插入到PFastBacl质粒载体的Kpnl、SalI位点之间，制成了 M1-DE-VP1和M1-H1-VP1质粒。
[0095]〔实施例2〕表达Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl的杆状病毒的制作
[0096]向载有杆状病毒基因组的大肠杆菌DHlObac ( invitrogen)中导入Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl质粒进行转化，制备了重组有Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl的重组杆状病毒基因组。将重组杆状病毒基因组转染入Sf-9细胞,三天后回收其上清,作为含有重组杆状病毒的溶液。使该溶液的一部分再次感染Sf-9细胞，由此使重组杆状病毒滴度上升，制成了重组杆状病毒的储备溶液。
[0097]〔实施例3〕Ml-DE-VLP 和 Ml-H1-VLP 的制备
[0098]将重组有Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl的重组杆状病毒以M.0.1.(感染复数，multiplicity of infection) =0.05 ~0.2 感染 3X IO7 个 Sf-9 细胞。感染 3 天后回收Sf-9细胞，用PBS(-)清洗后，将细胞重悬于200 μ I的50%0pt1-pi^p?溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),50%0pt1-prep?)中，进行超声波破碎，制成裂解物溶液(图1左图、泳道1_4、Ml-DE-VPl以及右图、泳道1-4、M1-H1-VP1)。另一方面，将细胞用Iml的VPl超声波处理溶液(20mM Tris-HCl (pH7.9)、1%脱氧胆酸钠)重悬浮，进行超声波破碎后，以15，OOOrpm,4°C离心5分钟，分离为上清和细胞团，除去上清。在剩余的细胞团中加入50%0pt1-pi^p?溶液(20mM Tris-HCl (pH7.9)、50%0pt1-pi^p?)，通过吹打或者进行超声波处理进行重悬浮，制成了细胞团溶液(图1左图、泳道5-8、Ml-DE-VPl以及右图、泳道5_8、Ml-H1-VPl)。
[0099]将制备得到的裂解物和细胞团溶液的一部分进行SDS-PAGE电泳后，利用CBB染色进行染色(图1)。
[0100]〔实施例4〕Ml-DE-VLP 和 Ml-H1-VLP 的免疫
[0101]在上述包含Ml-DE-VLP和M1-H1-VLP的裂解物溶液(100 μ I)和细胞团溶液(100 μ I)中，加入作为佐剂的 CpG-olygodeoxyncleotide5002 (TCCATGACGTTCTTGATGTT:序列号52)佐剂5 μ g，对8周龄的转基因小鼠以足垫、足跟关节、静脉内、腹腔内、肌肉内、鼻腔内的途径进行免疫。转基因小鼠使用以C57BL/6为背景、表达在HLA-A 0201和H_2Db的嵌合体中进一步融合有人的β 2m的小鼠。该小鼠由于敲除了小鼠的β2πι和H-2Db，所以可以认为源自小鼠的MHC class I没有在细胞表面露出。
[0102]〔实施例5〕从免疫小鼠的脾脏和肺中制备淋巴细胞
[0103]在免疫I周或2周后，从小鼠摘出脾脏和肺，分别放置于加入了 5ml的RPM1-1640培养基的Φ 6cm培养皿中。使用镊子将脾脏在培养基内充分分散开，将培养基中含有溶出的淋巴细胞的溶液移动至15ml试管，再将Φ 6cm培养皿用5ml的RPM1-1640培养基清洗一次，将上清加入该15ml试管，使总量为10ml。立刻将堆积在15ml试管的底部的组织碎片保留，将上清再次移至新的15ml试管，在室温以1，200rpm离心5分钟，使淋巴细胞变成细胞团。除去上清，分散开细胞团后，为了除去红细胞，加入250 μ I的NH4Cl-Tris溶液混合后，立即加入IOml的RPM1-1640培养基，在室温以1，2000rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，再加入IOml的RPM1-1640培养基，以不吸到变性的红细胞的方式，用移液管转移至新的15ml试管，再次在室温以l，200rpm离心5分钟。除去上清后，将细胞团分散开，并用IOml的RPM1-1640培养基再一次悬浮，在室温以l，200rpm离心5分钟。除去上清，最后用2ml的混入有10%FCSRPM1-1640培养基悬浮。为了对淋巴细胞进行计数，在490 μ I的2%乙酸溶液中加入10 μ I的上述悬浮溶液，用Burker-Turk血细胞计数板算出细胞数，用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释或浓缩至2X 107cells/ml。
[0104]摘出的肺转移至没有混入培养基的Φ 6cm培养皿中，用剪刀充分剪碎后，用IOml的 50unit/ml Collagenase Typel、混入有 10%FCS 的 RPM1-1640 培养基悬浮，以 I 小时、37°C用5%C02培养箱孵育。孵育后，通过IOOym Nylon制的cell strainer (细胞过滤器)(BDFalcon),将上清回收至50ml试管,将残留在strainer的组织片用cell scraper (细胞刮棒)磨碎后，再使其通过IOml混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，将总量20ml的溶液回收至50ml试管。将回收的溶液在室温、1，200rpm离心5分钟，除去上清，将细胞团分散开后，加入10mlRPM1-1640培养基，将悬浮液移至15ml试管。将转移后的15ml试管在室温、1，200rpm离心5分钟，除去上清，将细胞团分散开后，再加入IOml RPM1-1640培养基，在室温、1，200rpm离心5分钟，由此清洗细胞。除去上清后,将细胞团分散开,最后加入IOml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，在室温、1，200rpm离心5分钟，除去上清，将细胞团分散开后，加入250 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基。
[0105]〔实施例6〕ICS分析
[0106]为了研究在按照上述方法从脾脏和肺中回收的淋巴细胞中，与Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)反应而被诱导的CTL的存在，进行了 ICS分析。在96孔圆底培养板中，每I孔加入5 μ I的以混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释25倍的BD GolgiPlug? (BD),在其中再加入以混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释的20 μ M的Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL, Operon) 100 μ I。作为阴性对照，加入不含肽的10%RCS混入RPM1-1640培养基 100u I ο
[0107]在该孔中加入上述制备的从脾脏制备的淋巴细胞和从肺制备的淋巴细胞100 μ I后，以5小时、37°C、5%C02培养箱孵育。
[0108]孵育后，以4°C、1, 400rpm短暂离心(spin down)除去上清，用旋润混合器将细胞分散开后，每I孔加入FACS缓冲液(2%FCS，0.l%sodium azide (叠氮钠)，1XPBS (-))200 μ 1，再以4°C、l，400rpm短暂离心除去上清，将细胞分散开后，加入用FACS缓冲液稀释至 5μ g/ml 的 Mouse BD Fe Block? (BD Pharmingen) 100 μ I,在 4°C 鮮育 10 分钟。
[0109]孵育后，以4 °C、1，400rpm短暂离心，除去上清，将细胞分散开后，在每I孔加入FACS缓冲液200 μ 1，再以4°C、1，400rpm短暂离心，除去上清，再进行一次利用FACS缓冲液的清洗操作。在分散开的细胞中，每I孔加入用FACS缓冲液稀释至10 μ g/ml的FITCRatAnt1-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen) 50 μ I,在 4°C 的暗处孵育 30 分钟。
[0110]在孵育后，进行2次用200 μ I的FACS缓冲液的清洗操作后，在分散开的细胞中，每 I 孔加入 100 μ I 的 BD Cytofix/Cytoperm? (BD Biosciences),在 4°C 的暗处孵育 20分钟。孵育后，用 200 μ I 的 IXBD Perm/Wash? (BD biosciences)进行 2 次与用 FACS 缓冲液进行的清洗操作同样的操作后，在分散开的细胞中，加入用IXBD Perm/Wash?稀释至10yg/ml 的 PE ant1-mouse IFN-Y Clone: XMG1.2 (BioLegend) 50 μ I,在 4°C 的暗处孵育30分钟。
[0111]孵育后，进行2次用200μ I的IXBD Perm/Wash?的清洗操作后,在分散开的细胞中，每I孔中加入100 μ I的FACS固定缓冲液(1%甲醛，I XFACS缓冲液)，在4°C的暗处孵育过夜。
[0112]孵育后，将400 μ I的FACS缓冲液加入到5ml的聚苯乙烯试管中，在其中加入用100 μ I的FACS固定缓冲液固定的样品后，用FACScan (BD)进行点矩阵作图分析。分析中使用Cell Quest (BD)的软件。图2、图3表示ICS的2维分析的结果。
[0113]如图2所示，在任意的测定结果中，通过CTL表位肽的孵育，CD8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞数的比例增大。另外，没有加入CpG的试样也得到了⑶8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞数的比例增大的结果。从这些结果可知，Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP即使没有佐剂，也具有能够诱导CTL的可能性。
[0114]如图3所示，在将Ml-DE-VLP进行肌肉内给药时，以及将Ml-H1-VLP进行腹腔内给药时，通过CTL表位肽的孵育，⑶8阳性/细胞内IFN- Y阳性细胞数显著增多。
[0115]〔实施例7〕CD107-1CS 分析
[0116]为了研究在用实施例5的方法从脾脏回收的淋巴细胞中，与Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)反应而被诱导的具有细胞毒活性的CTL的存在，进行了⑶107-1CS分析。在96孔圆底培养板中，每I孔加入5 μ I用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释25倍的BDGolgiPlug?(BD),并且每I孔加入5 μ I用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释25倍的BD GolgiStop?(BD)、0.8μ g FITC Rat Ant1-Mouse CD107a Clone:1D4BCBD Pharmingen),在其中进一步加入用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释的20 μ M的Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL、Operon) 100 μ I。作为阴性对照，加入不含肽的混入有10%RCS的RPM1-1640培养基100 μ I。
[0117]在该孔中加入在实施例5中制备得到的从脾脏制备的淋巴细胞100μ I后，在暗处、37°C用5%C02培养箱孵育6小时。
[0118]孵育后，以4°C、l，400rpm短暂离心，除去上清，用旋涡混合器将细胞分散开后，在每 I 孔中加入 FACS 缓冲液(2%FCS，0.l%sodium azide, IXPBS (-)) 200 μ 1，再以 4°C、1，400rpm短暂离心，除去上清，将细胞分散开后，加入用FACS缓冲液稀释至5 μ g/ml的Mouse BD Fe Block? (BD Pharmingen) 100 μ 1，在 4°C孵育 10 分钟。
[0119]孵育后，以4°C、l，400rpm短暂离心，除去上清，将细胞分散开后、每I孔中加入FACS缓冲液200 μ 1，再以4°C、1，400rpm短暂离心，除去上清，再进行一次利用FACS缓冲液的清洗操作。在分散开的细胞中，每I孔中加入用FACS缓冲液稀释至10 μ g/ml的PE/Cy5Rat Ant1-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen)50 μ I,在 4°C 的暗处孵育 30 分钟。
[0120]孵育后，进行2次用200 μ I的FACS缓冲液的清洗操作后，在分散开的细胞中，每I孔中加入 100 μ I 的 BD Cytofix/Cytoperm?(BD Biosciences),在 4°C 的暗处孵育 20 分钟。孵育后，用200 μ I的IXBD Perm/Wash? (BD biosciences)进行2次与用FACS缓冲液进行的清洗操作同样的操作后，在分散开的细胞中，加入用IXBD Perm/Wash?稀释至10 μ g/ml 的 PE ant1-mouse IFN- y Clone:XMG1.2(BioLegend)50 μ 1，在 4°C 的暗处孵育 30 分钟。
[0121]孵育后,进行2次用200μ I的IXBD Perm/Wash?的清洗操作后,在分散开的细胞中，每I孔中加入100 μ I的FACS固定缓冲液(1%甲醛，I XFACS缓冲液)，在4°C的暗处孵育过夜。
[0122]孵育后，在5ml的聚苯乙烯试管中加入400 μ I的FACS缓冲液，在其中加入100 μ I的用FACS固定缓冲液固定的样品后，用FACScan(BD)进行点矩阵作图分析。分析使用CellQuest (BD)的软件。图4表示⑶107-1CS的二维分析的结果。
[0123]如图4所示，可知在任意的测定结果中，通过CTL表位肽的孵育而使⑶8阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞数的比例增大的情况下，⑶8阳性/⑶107阳性/细胞内IFN-Y阳性细胞数的比例也都增大。由于⑶8阳性/⑶107阳性/细胞内IFN- Y阳性细胞具有细胞毒活性，所以可知利用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的免疫，存在能够诱导具有细胞毒性的CTL的可能性。[0124]〔实施例8〕51 络释放(51Chrome release)分析
[0125]为了显示实施例7所示的⑶8阳性/⑶107阳性/细胞内IFN- Y阳性细胞的细胞毒作用，进行了 51铬释放分析。从没有免疫的小鼠中用与实施例5同样的方法制备脾脏的淋巴细胞。在2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基中的没有免疫的小鼠的脾脏淋巴细
2.4X IO8Cells 中，加入 IOmM 的 Ml 的 CTL 表位的肽(GILGFVFTL，Operon) 4 μ 1，在 15ml试管中，以37°C、5%C02培养箱孵育2小时。孵育后，照射20Gy (格瑞)的X射线。照射后，以室温、1，2000rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，为了对淋巴细胞进行计数，在490 μ I的2%乙酸溶液加入10 μ I的淋巴细胞溶液，用Burker-Turk血细胞计数板算出细胞数，用混入有10%FCS 的 RPM1-1640 培养基稀释至 5X 106cells/ml。
[0126]同时，通过肌肉注射免疫约50 μ g的M1-DE-VLP，并且通过腹腔注射免疫约50 μ g的M1-H1-VLP，免疫I周后，从小鼠中摘出脾脏，分别放置于加入了 5ml的RPM1-1640培养基的Φ6(^培养皿中。使用镊子将脾脏在培养基内充分分散，将培养基中含有溶出的淋巴细胞的溶液移至15ml试管，用5ml的RPM1-1640培养基将Φ 6cm培养皿再清洗一次，将上清加入该15ml试管中，使总量为10ml。进行了免疫的淋巴细胞由于没有除去血液，所以立刻将堆积在15ml试管的底部的组织碎片保留，再次将上清移至新的15ml试管，以室温、1，200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，为了对淋巴细胞进行计数，在490 μ I的2%乙酸溶液加入10 μ I的淋巴细胞溶液，用Burker-Turk血细胞计数板算出细胞数，用混入有10%FCS的 RPM1-1640 培养基稀释至 5X106cells/ml。
[0127]在48孔培养板中，每I孔中，将500 μ I没有实施上述免疫的、以Ml的CTL表位的肽孵育、经过X射线照射的淋巴细胞5X106cellS/ml与500 μ I经过免疫的淋巴细胞5Χ 106cells/ml混合。该孔每I个样品制作了 24个孔。混合后，以37°C、5%C02培养箱孵育7天。
[0128]7天的孵育后，将24孔中的淋巴细胞收集到I支50ml试管中，以室温、1，200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，为了对淋巴细胞进行计数，在20 μ I的0.4%台盼蓝(Trypan Blue)溶液(Gibco)中加入20 μ I的淋巴细胞溶液，用Burker-Turk血细胞计数板算出细胞数，用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释或浓缩至7.5X 106cells/ml。将该制备得到的淋巴细胞作为效应细胞。
[0129]同时，将lX106cells/ml的RMA-HHD培养细胞各Iml分注入2支15ml试管，在一个试管中加入IOmM的Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL，Operon)5 μ 1，以37°C、5%C02培养箱孵育2小时。在另一个试管中没有加入肽。孵育后，以室温、1，OOOrpm离心5分钟，使细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入IOOyCi (微西韦特)的Na251CrO4溶液，在37°C、5%C02培养箱孵育30分钟。孵育后，以室温、I, OOOrpm离心5分钟，使细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，为了进行清洗操作，加入Iml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，以室温、I, 200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团，除去上清。重复5次该清洗操作。最后，除去上清后，加入Iml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基。在新的15ml试管中，混合500 μ I该细胞溶液与9.5ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，稀释20倍。将该细胞溶液作为靶细胞。
[0130]在96孔板中分别加入100μ I的靶细胞(5X103cells)，在其中，加入效应细胞100μ I (7.5X105cells)，使效应细胞:靶细胞的比率为150:1 ;加入效应细胞20 μ I(1.5 X IO5Cells)和80 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，使效应细胞:靶细胞的比率为30:1 ;加入效应细胞10 μ I (7.5Χ IO4Cells)和90 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，使效应细胞:靶细胞的比率为15:1。作为阳性对照，加入100 μ I的5%Triton-X100溶液，作为阴性对照，加入100 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基。混合后，以37°C、5%C02培养箱孵育4小时。
[0131]孵育后，使用Supernatant collection system (Molecular Devices)回收上清，用 AUTO WELL GAMMA SYSTEM(ARC_380CL，Aloka)以及ALOKA RIA ProgramCARCAS ver.3.11，Aloka)对释放的51Cr的伽马射线进行计数、分析。图5表示51铬释放分析的结果。
[0132]如图5所示，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫、制备的淋巴细胞选择性地损伤提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的细胞(图5的Ml: 58-66)，由此诱导51Cr的释放，因此可知，通过Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的免疫，能够诱导出选择性地损伤提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的细胞的 CTL。
[0133]〔实施例9〕In vivo CTL 分析
[0134]为了分析实施例8所示的选择性损伤提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的细胞的CTL实际上在动物体内选择性地损伤提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的细胞，进行了 Invivo CTL分析。通过肌肉注射免疫约50 μ g的M1-DE-VLP，并且通过腹腔注射免疫约50 μ g的 Ml-H1-VLP。
[0135]免疫I周后，从未免疫的3只小鼠中摘出脾脏，放置于加入有5ml的RPM1-1640培养基的Φ6οπι培养皿。使用镊子将脾脏在培养基内充分分散，将在培养基中含有溶出的淋巴细胞的溶液移至15ml试管，将Φ 6cm培养皿用5ml的RPM1-1640培养基再清洗一次，将上清加入该15ml试管,使总量为10ml。没有免疫的淋巴细胞由于没有除去血液，因此立刻将堆积在15ml试管的底部的组织碎片保留，将上清再移至新的15ml试管，以室温、1，200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基。将制备得到的没有免疫的淋巴细胞Iml分别注入2支15ml试管中，在其中一支试管中加入1μ I的IOmM的Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL，Operon)，以I小时、37°C在5%C02培养箱孵育。孵育后，以室温、I, 2000rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，再加入IOml的RPM1-1640培养基，以室温、1，2000rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清,将细胞团分散开后,加入20ml的混入有0.1%BSA的PBS (_)溶液，在用CTL表位肽(GILGFVFTL)孵育的淋巴细胞溶液中，加入10 μ I的5mM羧基突光素二醋酸盐玻拍酸亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidylester) (CFSE) (Molecular Probes),在没有用肽孵育的淋巴细胞溶液中，加入1μ I的5mMCFSE,充分混合后，在37°C的水浴中振荡培养10分钟。振荡后，以室温、I, 200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入IOml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，以室温、1，200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，为了对淋巴细胞进行计数，在490 μ I的2%乙酸溶液中加入10 μ I的淋巴细胞溶液，用Burker-Turk血细胞计数板算出细胞数，用10%FCS混入RPM1-1640培养基稀释或浓缩成为5X 107cells/ml。将由CFSE标记的没有用肽孵育的淋巴细胞5X107cellS/ml和孵育的淋巴细胞5X 107cellS/ml等量混合，制成CFSE标记淋巴细胞溶液。
[0136]将没有免疫的小鼠利用肌肉注射免疫约50 μ g的M1-DE-VLP，并且利用腹腔注射免疫约50 μ g的M1-H1-VLP，对经过一周的各个小鼠静脉注射上述制备的CFSE标记淋巴细胞溶液200 μ I,使其经过一天。
[0137]经过一天后，从小鼠中摘出脾脏，置于加入有5ml的RPM1-1640培养基的Φ6αιι培养皿。使用镊子将脾脏在培养基内充分分散开，将在培养基中含有溶出的淋巴细胞的溶液移至15ml试管，将Φ 6cm培养皿用5ml的RPM1-1640培养基再清洗一次，将上清加入该15ml试管，使总量为10ml。淋巴细胞由于没有除去血液，所以立刻将堆积在15ml试管的底部的组织碎片保留，将上清再移至新的15ml试管，以室温、1，200rpm离心5分钟，使淋巴细胞成为细胞团。除去上清，将细胞团分散开后，加入Iml的FACS固定缓冲液(1%甲醛，I XFACS缓冲液)。将500 μ I的FACS缓冲液加入5ml的聚苯乙烯试管，在其中加入用200 μ I的FACS固定缓冲液固定的淋巴细胞溶液后，用FACScan (BD)进行直方图分析。分析使用Cell Quest(BD)的软件。图6表示In vivo CTL分析的结果。
[0138]如图6所示，从没有免疫的小鼠制备淋巴细胞时，没有混合CTL表位序列的淋巴细胞(在图中的“低”的位置表示。)和混合了 CTL表位序列的淋巴细胞(在图中的“高”的位置表示。)的细胞数基本相同。另一方面，从用Ml-DE-VLP或Ml-H1-VLP免疫的小鼠中制备淋巴细胞时，与没有混合CTL表位序列的淋巴细胞(在图中的“低”的位置表示。)相比，混合了CTL表位序列的淋巴细胞(在图中的“高”的位置表示。)的细胞数更少。由此可知，通过由Ml-DE-VLP或Ml-H1-VLP的免疫而诱导的CTL，实际上在动物体内选择性地损伤提呈Ml的CTL表位肽的细胞。
[0139]〔实施例10〕淋巴细胞的成熟化分析
[0140]用与实施例5同样的方法，从C57BL/6小鼠的脾脏中纯化除去了红细胞的淋巴细胞，用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释，以达到I X 107cells/ml。在96孔板中，加入a)没有任何添加的 50%0pt1-pi^p? 溶液(20mM Tris-HCl (ρΗ7.9)，50%0pt1-prep?) 5 μ 1，加入b)实施例3制备的Ml-DE-VLP溶液5 μ 1、或者c)Ml-HI_VLP溶液5 μ 1，在其中加入上述制备的淋巴细胞50 μ 1，并加入混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，使每I孔的总量为200 μ l。用吹打混合后，将该板以37°C、5%C02培养箱孵育6小时或24小时。
[0141]孵育后以4°C、l，400rpm短暂离心，除去上清，用旋涡混合器将细胞分散开后，在每 I 孔中加入 FACS 缓冲液(2%FCS，0.l%sodium azide, IXPBS (-)) 200 μ 1，再以 4°C、1，400rpm短暂离心，除去上清，将细胞分散开后，加入用FACS缓冲液稀释至10 μ g/ml的FITC Armenian Hamster Ant1-Mouse CD80Clone:16-10A1 (BD Pharmingen)、或 FITC RatAnt1-Mouse CD86Clone:GL-KBD Pharmingen)、或者 FITC Armenian Hamster Ant1-MouseCD40Clone:HM40-3 (BD Pharmingen) 100 μ 1，在 4°C、暗处孵育 30 分钟。
[0142]孵育后，进行2次用200 μ I的FACS缓冲液的清洗操作，然后在分散开的细胞中，每I孔中加入100μ I的FACS固定缓冲液(1%甲醛，IXFACS缓冲液)，在4°C的暗处孵育过夜。
[0143]孵育后，在5ml的聚苯乙烯试管中加入400μ I的FACS缓冲液，在其中加入用100 μ I的FACS固定缓冲液固定的样品，然后，用FACScan (BD)进行直方图分析。分析使用Cell Quest (BD)的软件。图7表示直方图的结果。
[0144]如图7所示，50%0pt1-prep?溶液不诱导⑶80、⑶86、⑶40的成熟化标记物的表达，与之相对，混入Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的溶液诱导CD86、CD40的成熟化标记物的表达。CD86的表达对于细胞毒性T细胞的活化很重要，因此可知Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP具有细胞毒性T细胞的活化作用。
[0145]〔实施例11〕病毒挑战实验
[0146]为了分析选择性损伤提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的细胞的CTL对于流感病毒感染的影响，进行了病毒挑战实验。对HLA-A2转基因小鼠(HHD小鼠)利用肌肉注射免疫约50 μ g的Ml-DE-VLP,并且利用腹腔注射免疫约50 μ g的M1-H1-VLP。
[0147]免疫I周后，将流感病毒(A/H1N1/PR8和A/H3N2/Aichi)用PBS (-)以组织培养流感病毒的感染剂量(tissue culture influenza virus infectious dose) (TCID5tl)计稀释至1001^105(|/2(^1，对免疫的小鼠实施麻醉后，将该稀释溶液2(^1经鼻感染。 [0148]感染4天后，取出小鼠肺，加入Iml的PBS (_)后，用组织匀浆器(玻璃匀浆器，带凸起，10ml，812-770-02，池本理化)将组织研碎至看不到为止，之后，将溶液移至15ml试管。用离心机以4°C、2000rpm离心5分钟，将上清移至带有螺纹盖的2ml试管。为了通过加入鸡的红细胞而根据红细胞的凝集算出流感病毒量，将小鼠肺研碎得到的上清100μ I加到圆底的96孔板的列Α，从列B至G加入混入有5%FCS的DMEM培养基90 μ 1，作为阴性对照在列H加入混入有5%FCS的DMEM培养基100 μ I。从列A使10 μ I移动到列B，用吹打进行悬浮后，重复进行从列B使10 μ I移动至列C进行悬浮的操作，直至列G，制作流感病毒感染肺上清的10倍稀释系列。为了算出平均值，每一个样品制作5个该系列。在该系列中全部各加入2.5 X 105cel I s/ml的MDCK细胞100 μ 1，然后以35°C、5%C02培养箱孵育24小时。孵育后，将培养上清用移液器全部除去，加入200 μ I的混入有0.0002%胰蛋白酶(2 μ Ι/ml胰蛋白酶)的DMEM培养基后，再以35°C、5%C02培养箱孵育3天。孵育后，加入50 μ I的0.8%鸡血液(鸡保存血液，0109-1，日本Biotest研究所)，在4°C静置I小时。根据红细胞的凝集分布算出组织培养流感病毒的感染剂量(TCID5tl)。
[0149]如图8a所示，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫的小鼠肺中的流感病毒滴度，与不进行免疫的小鼠相比较，低约10倍，由此表明Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫具有抑制流感病毒在肺中增殖的效果。
[0150]另外，从流感病毒(A/H1N1/PR8)感染之后，2周每天测定小鼠的体重，记录将感染前的体重设为100%时的体重变化。如图8b所示，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫的小鼠的体重大致维持其原来的体重，与之相对，未进行免疫的小鼠观察到显著的体重降低，由此表明利用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的免疫对于抑制由流感病毒感染引起的体重降低也有效
果O
[0151]〔实施例12〕插入有癌CTL表位的VLP免疫
[0152]用与实施例1到3相同的方法，代替Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)，制备了插入有对于作为癌抗原已知的WTl的HLA-A2的CTL表位序列(RMFPNAPYL)的VLP(WTIWT-DE-VLP、WTIWT-H1-VLP)(图9_a)。用与实施例4到6相同的方法，对HLA-A2转基因小鼠进行免疫，制备淋巴细胞，进行了对于WTl的CTL表位序列的ICS分析(图9-b)。另外，利用与实施例8同样的方法，进行了对于WTl的CTL表位序列的51铬释放分析。
[0153]如图9所示，可知与插入了 Ml的CTL表位序列的VLP同样，制备插入有WTl的CTL表位序列的VLP (图9-a)，并进行免疫，由此，对于WTl的CTL表位序列(RMFPNAPYL)的CTL被诱导(图9-b)，所诱导的对于WTl的CTL表位的CTL选择性地损伤提呈WTl的CTL表位序列的细胞(图9-c)。由此，表明VLP是能够诱导对于各种CTL表位序列的CTL的有用的载体。
[0154]〔实施例13〕 利用MlCTLpeptide悬浮IFA乳浊液进行CTL诱导的ICS分析
[0155]利用与实施例3到6同样的方法，进行Ml-DE-VLP (图10，右上图)和M1-H1-VLP(图10,右下图)的ICS分析。免疫通过在鼠蹊部皮下(subcutaneous, s.c.)注射与实施例4同样制备的100 μ I的Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的细胞团溶液来进行。
[0156]另一方面，悬浮有Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL)的IFA乳浊液如下制备，即，用450 μ I的PBS (-)稀释20 μ g/μ I浓度的在DMSO溶剂中溶解的GILGFVFTL肽(Operon)50 μ I,与 500 μ I 的弗氏不完全佐剂(incomplete freund’ s adjuvant, IFA) (Sigma) 一起，利用双注射器法(Two-syringe法)(GP注射器接头，NIPRO) (Inject2ml, B.BRAUN)混和。通过在鼠蹊部皮下(subcutaneous, s.c.)注射所制备的乳池液100 μ I进行免疫。进行一次免疫(图10，左上图)，并且在一次免疫一周后进行第二次免疫(图10，左下图)，经过一周，使用经过一周后的小鼠，利用与实施例5到6同样的方法进行ICS分析。
[0157]如图10所示，相比于通过MlCTL P印tide悬浮IFA乳浊液一次免疫、二次免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP —次免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞，通过与MlCTL peptide的孵育所诱导的⑶8阳性/细胞内IFN- Y阳性CTL的比例更高。由此表明，相比于作为经典的佐剂已知的IFA，使用VLP构建的本发明的细胞毒性T细胞诱导剂的⑶8阳性/胞内IFN- Y阳性CTL的诱导效率更好。
[0158]〔实施例14〕脾脏淋巴细胞的IL-12的分泌量的ELISA分析
[0159]利用与实施例5同样的方法，从HLA-A2转基因小鼠的脾脏中纯化除去了红细胞的淋巴细胞，用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释，使其达到I X 107cells/ml。在96孔板中，加入 a)没有任何添加的 50%0pt1-pi^p?溶液(20mM Tris-HClCρΗ7.9)，50%0pt1-prep?)5 μ l、b)高度纯化的野生型SV40VPl-VLP(500ng/y 1)5μ l、c)实施例3所制备的Ml-DE-VLP溶液5 μ 1、或者d) Ml-H1-VLP溶液5 μ 1，在其中加入上述制备的淋巴细胞50 μ 1，并加入混入有10%FCS的RPM1-1640培养基，使每I孔的总量为200 μ I。或者，在上述纯化的淋巴细胞50 μ I中，加入用混入有10%FCS的RPM1-1640培养基稀释至IOOng/μ I的LPS(Sigma) 150 μ I。吹打混合后，以37°C、5%C02培养箱将该板孵育6小时或24小时。孵育后，以4°C、I, 400rpm短暂离心,将上清回收到Eppendorf管，以4°C、15, OOOrpm短暂离心，将上清回收到新的Eppendorf管。将回收的培养上清的50 μ I用IL-12的enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) (Mouse Total IL-12ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC)按照试剂盒的操作说明书进行分析，算出培养上清中的IL-12的浓度(图11)。
[0160]如图11所示，当用将小鼠的淋巴细胞与将外源的Ml的CTL表位插入到VLP的DE环或HI环而得到的VLP (Ml-DE-VLP、Ml-H1-VLP)孵育时，与野生型的SV40VP1VLP相比，培养上清中的IL-12的浓度增大约20倍，由此表明通过插入外源的表位，相比于野生型的VLP，作为佐剂的活性被增强，作为细胞毒性T细胞诱导剂的效果增大。[0161]产业上的可利用性
[0162]本发明可用作病毒性疾病、癌症的预防药物或治疗药物，因此能够在制药等产业领域中利用。
[0163]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请(特愿2011-107874号和特愿2011-191208号)的说明书和/或附图中记载的内容。另外，本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接作为参考`在本说明书中引用。
【权利要求】
1.一种细胞毒性T细胞诱导剂，其特征在于: 其为含有由猿猴病毒40的VPl构成的病毒样颗粒的细胞毒性T细胞诱导剂，所述VPl的DE环和/或HI环中插入有T细胞表位肽。
2.如权利要求1所述的细胞毒性T细胞诱导剂，其特征在于: T细胞表位肽为源自病毒蛋白质的肽。
3.如权利要求1所述的细胞毒性T细胞诱导剂，其特征在于: T细胞表位肽为源自流感病毒的HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2或PB1-F2的肽。
4.如权利要求1所述的细胞毒性T细胞诱导剂，其特征在于: T细胞表位肽为源自对癌细胞特异性的蛋白质的肽。
5.如权利要求1所述的细胞毒性T细胞诱导剂，其特征在于: T 细胞表位肽为源自 Melan-A/MART-1、gplOO、MAGE-A3、MAGE-AlO, CEA、HER2/new、NY-E50-UWT-1 或 hTERT 的肽。
6.如权利要求1所述的细胞 毒性T细胞诱导剂，其特征在于: T细胞表位肽为由序列号I至39中任意一个序列号所记载的氨基酸序列构成的肽。
7.一种人以外的动物的病毒性疾病的预防或治疗方法，其特征在于:将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在所述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自病毒蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人以外的动物进行给药。
8.一种人以外的动物的癌症的预防或治疗方法，其特征在于: 将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在所述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自对癌细胞特异性的蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人以外的动物进行给药。
9.一种人的病毒性疾病的预防或治疗方法，其特征在于: 将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在所述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自病毒蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人进行给药。
10.一种人的癌症的预防或治疗方法，其特征在于: 将由猿猴病毒40的VPl构成的、且在所述VPl的DE环和/或HI环中插入有源自对癌细胞特异性的蛋白质的T细胞表位肽的病毒样颗粒对人进行给药。
【文档编号】A61K39/00GK103747799SQ201280031425
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年4月24日 优先权日:2011年5月13日
【发明者】半田宏, 川野雅章, 松井政则 申请人:Lsip基金运营联合公司