专利名称：细胞毒性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞毒性组合物，其是以基因重组的IgG抗体为有效成分，所述本发 明IgG抗体比天然来源抗体或者从CHO培养细胞制得的抗体具有更高的补体依赖性细胞毒 (CDC)活性。
背景技术：
抗体是被称作免疫球蛋白的糖蛋白，在属于淋巴细胞的B细胞中产生。作为抗体 的特性，可以识别特定的分子结构(抗原)，且具有很高的结合能力，从而将入侵生物组织 的细菌和病毒等非自体蛋白排除，在对感染的防御中发挥重要作用(非专利文献1)。
由来自单一抗体产生细胞的克隆制备得到具有均一的性质的抗体(单克隆抗体) 成为了可能，以作为癌细胞和免疫疾病产生原因的特定抗原为靶标的抗体药物得到了实用 化。制备单克隆抗体时，通常采用的方法是从小鼠细胞获得针对抗原的抗体，但对于人体给 药，为了防止排斥反应，有必要将恒定区等变为人抗体的氨基酸序列。
抗体药物由于具有很高的特异性，可以成为癌症和自体免疫疾病的有效药物(非 专利文献幻，但是其缺点在于制造成本高，导致医疗费用增高。所以期待对其制造方法进 行改善，转基因(基因重组)鸡等动物工厂是研究低成本生产抗体的一个方案(专利文献 1)。
此外，伴随着实用化的抗体药品临床知识日渐丰富，发现其效果并非充分，有必要 研制出效果更好的抗体。为了提高抗体的药效而研究增强其活性，不仅有利于提高药效，而 且可以降低给药量，从而有助于降低成本。
为了制造具有更高活性的抗体，通过基因重组技术改变抗体的糖链和氨基酸，从 胃胃 ι^δ Φ7(衣1 '! ! (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity :ADCC) 活性和补体依赖性细胞毒(complement-d印endent cytotoxicity :CDC)活性的方法进行 研究(专利文献2)。已经知道，通过除去结合于抗体Fc区域的N-糖苷键复合物糖链中的 岩藻糖，可提高ADCC活性的效果。此外还知道，在转基因鸡的卵清中产生的抗体，通过导 入基因的表达，其N-糖苷键复合物糖链中的岩藻糖含量低，所以ADCC活性高(非专利文献 3)。
按照这样的方法，通过人工改变糖链，可以提高ADCC活性，但是提高⑶C活性的实 用的方法还未知。如上所述，如果抗体Fc区域的N-糖苷键复合物糖链中不含有岩藻糖，可 以预测其ADCC活性高，但是在这种情况下，其CDC活性未必高。IgG抗体中存在子类，作为 抗体药品，多采用药效高，且可选择性地与蛋白质A结合从而容易被纯化的IgGl。但是IgG3 抗体的⑶C活性较高，公知可以通过将IgGl抗体的一部分Fc区域替换为IgG3抗体的氨基 酸，人工制造出CDC活性提高的抗体药物。但是这种在IgG子类间变换结构的嵌合抗体在 天然中并不存在，可能会出现预期不到的副作用(抗原性)，所以期望在不改变抗体Fc区域 蛋白质一级结构的条件下提高CDC活性的技术。
⑶C活性对于高效率地排除靶细胞发挥重大作用，所以该活性高的IgG抗体，期待在抗癌或者被用作改善过敏反应以及特异反应性等自体免疫疾病的抗体药品时具有良好 效果。CDC活性在非霍奇金淋巴瘤治疗用抗体利妥昔单抗(rituximab)的抗癌作用机制中 发挥着很大的作用(非专利文献4)，因此，在不改变天然氨基酸结构的前提下以更低成本 制造具有高⑶C活性的IgG抗体技术，对于现代生活中高罹患率的癌症患者和自体免疫疾 病患者而言是一个福音。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 :W02004/016081
专利文献2 :W02007/011041
非专利文献
非专禾丨J文献 1 :Monoclonal Antibodies Principles and Applications, ffiley-Liss, Inc. (1995)
非专利文献2 :Nature Reviews Cancer, 1,119(2001)
非专利文献3 :Nature Biotechnology, 28,1038 (2005)
非专利文献4 =Biochemi. Soc. Trans, 25 :705 (1997)发明内容
发明要解决的问题
有必要提供在不改变天然蛋白质的一级结构的条件下，CDC活性和ADCC活性等与 治疗效果有关机能提高的抗体组合物及其低成本制造方法。
解决问题的方法
技术领域：
本发明者发现，导入了编码IgG抗体基因的转基因鸟类产生的卵中蓄积的IgG抗 体，比CHO细胞来源的IgG抗体具有更高的CDC活性，从而完成了本发明。
换言之，本发明是基于上述发现完成的，其包含以下发明。
(1). 一种细胞毒性组合物，其以抗体为有效成分，所述抗体是从导入了编码IgG 抗体的基因的转基因鸟类产出的卵中得到的。
(2).上述(1)中所述的细胞毒性组合物，其以从卵清得到的抗体为有效成分。
(3).上述⑴或O)中所述的细胞毒性组合物，其中，IgG抗体的恒定区是人源 IgG 类。
(4).上述⑴ (3)中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，转基因鸟类是转基 因家禽鸟类。
(5).上述⑴ (4)中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，抗体的N-糖苷键 复合物糖链中的岩藻糖含量为CHO细胞来源抗体的五分之一以下。
(6).上述⑴ (5)中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，抗体的CDC活性是 用CHO细胞产生的抗体的五倍以上。
(J).上述⑴ (6)中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，IgG抗体是识别在 癌细胞中特异性表达的抗原的抗体。
(8). 一种癌症疾病的改善或治疗剂，其含有上述(1) (7)中任意一项所述的细 胞毒性组合物。
(9).上述⑴ (6)中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，IgG抗体是中和或 抑制与自体抗原发生反应的效应器细胞的抗体。
(10). 一种自体免疫疾病的改善或治疗剂，其含有上述⑴ (6)或者(9)中任意 一项所述的细胞毒性组合物。
发明效果
本发明的细胞毒性组合物以从导入了编码IgG抗体的基因的转基因鸟类产出的 卵中所产生的抗体为有效成分。该IgG抗体的CDC活性比CHO细胞来源的IgG抗体的CDC 活性更高，而且蛋白质一级结构相对于天然型未发生改变，可提供副作用少、疗效高的抗体 药物。另外，公知在转基因鸡的卵清中产生的抗体N-糖苷键复合物糖链中的岩藻糖含量较 少，由此也期待其ADCC活性高。⑶C活性和ADCC活性两者都高，可以将靶细胞有效地破坏、 杀死或者失活。
进一步地，通过使用转基因鸟类，在其卵中制造该IgG抗体，所以低成本制造该抗 体成为可能。
附图简要说明
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图1]所示是关于本发明实施例9中，转基因鸡来源和CHO细胞来源的完全人源 抗TNF抗体对于表达TNF抗原的T细胞的致死活性(CDC活性)的示意图。TG卵清抗体是 指由转基因鸡生产的卵清中纯化得到的完全人源抗TNF抗体。CHO抗体是指在CHO细胞中 制造的完全人源抗TNF抗体。纵轴表示FACS测定的靶细胞的死亡率。
发明的具体实施方式
本发明的细胞毒性组合物，是以从导入了编码IgG抗体的基因的转基因鸟类产出 的卵中得到的抗体为有效成分，通过该抗体的CDC活性、或者CDC活性和ADCC活性两种活 性，可以对涉及某种疾病、疾患等的细胞加以破坏、杀死或者灭活的组合物。
关于用于制造转基因鸟类的基因导入法，并无特殊限定，可以列举病毒载体法、精 子载体法和使用PGC(原始生殖细胞)的方法。
考虑到安全性，本发明使用的逆转录病毒载体优选缺失复制能力。作为复制能力 的缺失方法，优选的是通过使编码序列或者表达必需序列的至少一部分或者全部缺失，或 者通过引入取代、嵌入变异而导致不能表达，使得病毒粒子复制所必需的内核中包含的蛋 白质(群特异性抗原，gag)、逆转录酶(聚合酶，pol)和包膜糖蛋白(包膜(envelope) ,env) 中的任意一个或者其组合不被表达。
就逆转录病毒载体而言，由于每个病毒可以嵌入的基因长度有限，所以优选缺失 变异，从安全性和增加嵌入片段长度的观点来看，优选缺失gag、pol和env中的两个或更多 个。逆转录病毒载体优选在病毒粒子中含有作为包装标记发挥作用的病毒组装信号(Phi)。 gag区域的一部分有时作为病毒的包装信号发挥作用，所以从提高病毒效价的观点来看，病 毒载体优选含有至少一部分不能被表达的gag区域。(J. Virol.，1987，61 (5)，1639-46)。
作为逆转录病毒，并无特殊限定，可以列举莫罗尼小鼠白血病病毒、莫罗尼小鼠肉 瘤病毒以及鸟白血病病毒(ALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)来源的病毒等。为了感染鸟类胚 胎，优选使用小鼠肝细胞病毒(MSCV)和小鼠胚性肝细胞病毒(MESV)等对胚细胞和肝细胞 感染性较高的病毒。为了让该病毒载体高效率地感染鸟类细胞，优选人为地将包膜蛋白变 为牛水疱口炎病毒来源的VSV-G包膜蛋白质，但是并不限于该病毒的类型。5
标记基因是指编码下述蛋白质的基因，该蛋白质用作鉴定和分离正确导入了基因 的细胞的标记。逆转录病毒载体中也可以含有标记基因。作为标记基因，并无特殊限定，可 以列举绿色荧光蛋白(GFP)和青色荧光蛋白(CFP)、荧光素酶等荧光蛋白质基因，新霉素抗 性(NecZ)、潮霉素抗性(Hyg1O、嘌呤霉素抗性(Pure/)等抗药性基因，其他还有胸苷激酶、二 氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶、氯霉素乙酰基转移酶、β -内酰胺酶、β-半乳糖苷酶 等的基因。标记基因优选带有启动子基因和表达必需的要素。
外源性基因含有抗体蛋白质的编码序列，编码序列的边界由5，末端起始密码子以 及起始密码子对应的3’末端终止密码子决定。5’末端起始密码子近傍优选含有Kozak的 共有序列。编码序列的上游优选存在核糖体结合部位。为了在鸟类细胞内表达，外源性基 因优选含有至少一部分或者全部适当的启动子基因。所述启动子基因，是指DNA或者RNA 上这样的区域，其决定基因的转录起始部位，并直接调节转录的频度。
抗体分子包含根据抗原结构相应变化的结合区和变化较少的恒定区，根据恒定区 结构不同，可以分为几个种类(类别)。哺乳动物根据恒定区结构差异有IgG、IgE、IgA、IgM、 IgD五个种类，其生理活性也各不相同。IgA，IgG可以进一步分为亚类。
就抗体药物而言，使用血中寿命长且效果好的IgGl类抗体，因此本发明中向转基 因鸟类中导入的抗体基因优选为IgGl类抗体的结构基因。此外，从在转基因鸟类产出卵 中的蓄积效率的观点来看，IgGl类抗体也是优异的。另外，由于在卵中的蓄积良好，具有人 IgG类恒定区的抗体的基因、具有人IgGl、鹌鹑IgG2、鸡IgG2或小鼠IgG2亚类恒定区的抗 体的基因等外源性抗体结构基因是优选的。
作为其他优选的抗体结构基因，可以列举种间嵌合抗体的结构基因。在此所述种 间嵌合抗体，是指由2种以上不同生物物种的遗传性状构成的同一 IgG亚类间的杂合抗体。 现有的通过小鼠杂交瘤细胞制造的医疗用抗体，由于是小鼠来源，所以存在给予人体内时 导致免疫系统排斥反应的问题。为了消除这个缺点，例如通过重组方法将小鼠(啮齿目) 抗体Fc部分等人源化，从而可以大幅度降低排斥反应的风险。
作为上述种间嵌合抗体，可以列举抗人CD2抗体、抗CD20受体抗体、抗TNF抗体 等，还有已经作为药品上市者。近年来，所有的氨基酸序列均来源于人抗体的完全人源抗体 作为药品已经实用化，这些完全人源抗体可以优选作为本发明制造的抗体。
作为本发明的细胞毒性组合物的使用领域，考虑将其用作药品。作为抗肿瘤剂和 癌症疾患的改善或者治疗剂，优选含有可以识别在癌细胞中特异性表达的抗原，用于破坏 癌细胞的抗癌用途的抗体作为有效成分。癌细胞与正常细胞的结构差异很少，所以难以特 异地除去，但是已经发现其细胞表面存在特异性表达的抗原蛋白质，所以通过抗体识别进 行诊断和治疗已成为可能。
此外，作为本发明的细胞毒性组合物的有效成分，优选治疗自体免疫疾患的抗体， 该抗体中和或抑制与自体抗原反应的效应器细胞。在这种情况下，本发明的细胞毒性组合 物可以用作抗风湿药等自体免疫疾病的改善或治疗剂。
这类抗体不仅需要能识别靶细胞，还需要使靶细胞的机能失活，此时发挥重要作 用的是上述的抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性和补体依赖性细胞毒(CDC)活性。所述补体 依赖性细胞毒活性，是指与靶细胞结合后的抗体将补体系统活化，通过补体所具有的酶，有 效地溶解靶细胞的作用。根据近年来对抗体药品的研究，已知补体依赖性细胞毒活性在抗癌作用的呈现中发挥了重大功效。
比CHO细胞中制造的IgG抗体等具有更高的补体依赖性细胞毒活性的单克隆抗 体，可以有效地破坏作为靶细胞的癌细胞，从而使给药量降低，减小副作用，并提高患者的 QOL成为可能，此外，由于抑制了制造成本，所以可以减轻患者的负担。当抗体组合物的CDC 活性与CHO细胞中产生的抗体组合物相比是后者的5倍以上时，适用于本申请发明的细胞 毒性组合物。此外，抗体组合物的⑶C活性与CHO细胞中产生的抗体组合物相比是其10倍 以上时，更加适用于本发明的细胞毒性组合物。
抗体组合物的N-糖苷键复合物糖链的岩藻糖含量是CHO细胞来源抗体的五分之 一以下时适合使用，在十分之一以下时更加适合使用。
为了控制导入的结构基因的表达，使用组织特异性启动子基因等。所述组织特异 性启动子基因，是指在鸟类的特定组织或细胞中具有特别强活性的启动子基因。通过使用 组织特异性启动子基因，具有可以减少或者排除靶蛋白的表达对鸟类的发育和生存产生不 良影响的可能性的优点。作为组织特异性启动子基因，并无特殊限定，可以使用输卵管特异 性启动子基因。输卵管组织在性成熟后较为活跃，所以多在性成熟后对其进行强烈诱导。
作为输卵管特异性启动子基因，可以列举鸟类来源的卵清蛋白、卵运铁蛋白、卵类 粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2球蛋白、G3球蛋白、卵(类粘蛋白)抑制剂、卵糖蛋白、卵黄素 蛋白、卵巨球蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、抗生物素蛋白的启动子基因等。使用这些输卵 管特异性启动子基因时，靶蛋白能够在卵清中高表达是特别优选的。
其他的启动子有组织非特异性启动子。组织非特异性启动子基因指不是组织特异 性启动子基因的启动子基因。组织非特异性启动子基因并无特殊限定，是指在鸟类的几乎 全部体细胞中均具有活性的启动子基因。这种情况下，靶蛋白在血中也有表达，所以具有在 雏鸟阶段可以检出是否表达靶蛋白的优点。组织非特异性启动子基因并无特殊限定，可以 列举β肌动蛋白启动子基因、EFl α启动子基因、胸苷激酶启动子基因和猿病毒40 (SV40) 启动子基因、巨细胞病毒(CMV)启动子基因、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子基因等。另外， 也可以使用四环素诱导型启动子基因等组织非特异性诱导型启动子基因。
外源性基因也可以含有转录增强子和/或调节元件。转录增强子是DNA或者RNA 上的区域，其为促进从启动子基因转录的序列，但不能单独地引起转录。转录增强子与不同 于固有机能启动子的启动子基因相连时大多也能发挥机能，所以并不限定其与启动子基因 的组合。作为转录增强子，并无特殊限定，可以列举SV40、CMV、胸苷激酶增强子、类固醇应 答元件和溶菌酶增强子等。调节元件是有助于转录调节以及转录后的RNA稳定化，而单独 不会引起转录的DNA或者RNA上的区域。作为调节元件并无特殊限定，可以列举WPRE ( 土 拨鼠肝炎病毒来源的调节元件、美国专利6136597号公报)等。
此外，外源性基因可以含有上述以外的非翻译区域。
利用包装细胞或者辅助病毒等制备的假型病毒载体，按照通常的显微注射法 (Bosselman, R. A等、Science 243，533 (1989))，导入至初期胚胎、血管内及心脏内。除此之 外，还可以考虑脂质体转染法和电穿孔法等基因导入法，但考虑到操作性和高导入效率，优 选显微注射法。
外源性基因并无特殊限定，不但可以是鸟类以外的基因，也可以包括鸟类基因。即 使是制造转基因所用的个体具有的序列，但由于是在个体本来所具有的全部基因的基础上另外引入基因，所以称作外源性基因。
复制能力缺失型逆转录病毒载体所感染的胚胎优选是从孵化开始经过M小时以 上的胚胎。更优选从孵化开始32小时以后且72小时以前的胚胎。更优选48小时以后且 64小时以前的胚胎。感染部位即导入病毒液的部位优选心脏内或者血管内。在制造基因导 入效率高的GO转基因嵌合体鸟类时，优选在可以观察到心脏跳动的初期阶段(从心脏开始 跳动起6小时以内)导入基因。这是出于下面两点考虑基因随血流运至全身，而且细胞数 目不多。
显微注射是在显微镜下使用前端细小的微小玻璃管等向特定部位直接导入病毒 液的方法。在本研究中向心脏或血管等特定部位导入病毒液，所以其优于脂质体转染法和 电穿孔法等其他基因导入法。
作为本发明中所使用的鸟类并无特殊限定，优选可以作为家养动物利用的家禽鸟 类。作为家禽鸟类，可以列举鸡、火鸡、野鸭、鸵鸟、鹌鹑、鸭子等。其中鸡较为容易得到，作 为产卵禽的产量高，卵大，且大量饲养方法已经确立，因此是特别优选的。
将生殖细胞中保有外源性基因的GO转基因嵌合体鸟类与野生型鸟类或者GO转基 因嵌合体鸟类或者其后代交配，可以通过筛选孵化后的雏鸟，得到Gl转基因鸟类。就GO转 基因嵌合体鸟类而言，其全部细胞均导入外源性基因的效率较低，在大多数情况下均为导 入了外源性基因的细胞与野生型细胞这两种不同基因型的细胞共存的嵌合体状态。另一方 面，对于Gl转基因鸟类而言，优选所有的体细胞均一地保有导入的基因。体细胞或生殖细 胞中基因的导入，可以使用PCR法等对血液、体细胞、精子或卵子来源的DNA或RNA进行检 测来加以确认。此外，也可以依据靶蛋白的表达来判断。可以通过ELISA法、电泳法、靶蛋 白的活性测定等考察靶蛋白的表达。
G2代以后的转基因鸟类可以通过使Gl转基因鸟类交配得到。交配型可以通过Gl 转基因雄性和野生型雌性、Gl转基因雌性和野生型雄性、Gl转基因雄性和雌性等得到，也 可以将后代与其亲代进行回交。其中，对于Gl雄性和野生型雌性的交配型，1只Gl雄性可 以与多个野生型雌性交配，所以从效率上说是优选的。
本发明的靶蛋白生产方法以从上述的转基因鸟类中回收靶蛋白为特征。具体而 言，其特征在于从制得的转基因鸟类的血液和/或卵中提取并纯化因子。
纯化的特征在于，使用纯水或者平衡盐类溶液将转基因鸟类的卵特别是卵清成分 稀释，将所得的溶液通过柱法或过滤法进行纯化。稀释可以降低卵清的粘度，为了使柱法能 够顺利进行，期望高倍稀释从而降低粘度，但另一方面体积增加导致回收困难，因此优选稀 释2倍至10倍，更优选5倍至6倍。
为了从卵清溶液中回收目标抗体组合物，可以通过单独使用或者组合使用蛋白A 柱法、盐析法、吸附柱色谱法、离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、抗体柱法纯化，但并 不仅限定于上述方法。作为吸附柱色谱法，有Blue kpharose色谱法、肝素色谱法等，作为 离子交换柱法，有阴离子交换色谱法等。
实施例
以下，以抗TNF抗体为例，演示与CHO细胞来源的IgG抗体相比，由转基因鸟类卵 中制得的IgG抗体具有很高的CDC活性。但是，本发明并不限定于所述实施例。
关于基因操作，若无特殊说明，按照代表性方法进行(J. Samnrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis ；Molecular Cloning, A Laboratry Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory)。关于细胞培养，若无特殊说明，按照代表性方法进行。记载有商品名的情况 下，若没有特殊记载，按照附录的说明书指示进行。
(实施例1)完全人源抗TNF抗体表达质粒pMSCV/GΔ ALIH (HUMIRA (R))的构建
JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING，Vol. 98，No. 4，298-303，2004 中公 开 了 抗人 CD2 抗体 pMSCV/G Δ ALIH (CD2)。
基于公开的序列信息，化学合成了完全人源抗TNF抗体(阿达木单抗 (Adalimumab) ； HUMIRA (R)的全碱基序列。将其替换 pMSCV/G Δ ALIH (CD2)的 CD2 序列，得 至Ij pMSCV/G Δ ALIH (HUMIRA (R))。
(实施例2)使用pMSCV/GΔ ALIH (HUMIRA (R))和pVSV-G制备逆转录病毒载体
下文若无特殊说明，培养基使用含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、 50单位/ml的青霉素以及链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, DMEM) (Gibco公司制造)。在37°C、C02 5%条件下进行培养。在纯化逆转 录病毒载体使用的质粒DNA时，选用Endo Free Plasmid Maxi Kit (QIAGEN公司制造)。
为了通过实施例1中构建的质粒pMSCV/G Δ ALIH (HUMIRA (R))制备逆转录病毒载 体，将带有gag、pol基因的包装细胞GP293接种在胶原包被的直径IOOmrn的培养皿中，使 其细胞数为5X IO6个/皿(70%铺满)(使得第二天达到90%铺满)。次日，除去培养基， 加入7. 2ml培养基和10 μ 1的25mM的氯喹(Sigma公司制造)，继续培养1小时。将56 μ 1 的 Lipofectamine2000 溶液(Invitrogen 公司制造)悬浮于 1. 4ml 的 Opti-MEMI 培养基 (Gibco公司制造)中，室温下静置5分钟。将12 μ g的pMSCV/G Δ ALIH (HUMIRA (R))和12 μ g 的pVSV-G悬浮于1. 4ml的Opti-MEMI培养基中。混合Lipofectamine 2000溶液和质粒 DNA溶液，室温下放置20分钟。将其全部加入至培养皿中，培养6小时。6小时后，除去培 养基，加入9ml的培养基和200μ 1的1MHEPES Buffer Solution (Gibco公司制造)，进一步 培养24小时。
将培养上清液通过0. 45 μ m的醋酸纤维素滤膜(Advantec公司制造)，收集至离心 管中。使用超速离心机CS100GXL(日立工机公司制造)，以28，OOOrpm(50, 000g)离心分离 1. 5小时。除去上清液，向沉淀中加入20 μ 1的TNE缓冲液(50mM Tris-HCl (ρΗ7· 8)、130mM NaClUmM EDTA)在4°C条件下静置一晚，充分悬浮后，使用小型高速离心机，以12，OOOrpm 离心分离1分钟，将上清液通过0. 45 μ m的Durapore Ultrafree滤膜(Advantec公司制 造)，以该滤液作为病毒液。
(实施例3)病毒效价的测定
病毒液效价是根据向NIH3T3细胞(ATCC CRL-1658)中添加病毒液后感染的细胞 数目来定义的。将6孔培养板的各孔(底面积约为9. km2)中存在的5X104的NIH3T3细 胞中加入以IO2至IO6倍稀释率稀释的病毒溶液1ml，通过测定表达作为标记的GFP (Green Fluorescent Proteins)基因的细胞比例，来测定病毒液的效价。稀释IO6倍以后，呈现4 个集落时，病毒效价为4X106cfu/ml。
具体而言，在开始测定效价的前一天，向6孔培养板中接种5X IO4个/孔的NIH3T3 细胞并培养。第二天，用含有9 μ g/ml聚凝胺(polybrene)的培养基以900 μ 1/孔来更换 细胞培养基，用培养基将病毒液稀释至KT1 10_5，然后分别添加100 μ 1至各孔进行感染(聚凝胺的终浓度为8yl/ml)。培养4 6小时后，再加入Iml培养基。次日，更换培养基， 以后每3 4天更换一次培养基。感染约1周后，测定表达GFP的集落数，求出效价。
(实施例4)完全人源抗TNF抗体表达稳定的包装细胞的选择
在病毒感染的前一天，向M孔培养板中接种1. 5Χ IO4个/孔的GP293细胞并培 养。病毒感染当天，更换为Iml/孔的含有10 μ g/ml聚凝胺的培养基。然后向其中感染上 文实施例2中制得的病毒液。然后，将细胞按照有限稀释法克隆化。具体而言，次日，将细 胞稀释至10个/ml。将稀释后的细胞以100 μ 1的接种量分别接种至96孔培养板中(1个 孔中1个细胞)，选择细胞增殖速度快、与GP293细胞形态接近的细胞，得到完全人源抗TNF 抗体表达稳定的包装细胞的克隆。
(实施例5)使用完全人源抗TNF抗体表达稳定的包装细胞和pVSV-G的逆转录病 毒载体的制备
向直径为IOOmm的胶原包被的培养皿中接种完全人源抗TNF抗体表达稳定的包 装细胞5X IO6个(70 %铺满)(使得第二天达到90%铺满)。第二天，除去培养基，加入 7. 2ml培养基和10 μ 1的25mM的氯喹(Gigma公司制造)，继续培养1小时。将56 μ 1的 Lipofectamine 2000溶液悬浮于1. 4ml的Opti-MEMI培养基中，室温下静置5分钟。将 12 μ g的pVSV-G悬浮于1. 4ml的Opti-MEMI培养基中。混合Lipofectamine 2000溶液和 质粒DNA溶液，室温下放置20分钟。将其全部加入至培养皿中，培养6小时。6小时后，除 去培养基，加入9ml的培养基和200 μ 1的IM HEPES Buffer Solution(Gibco公司制造)， 培养24小时。
将培养上清液通过0. 45 μ m的醋酸纤维素滤膜，将滤液收集至离心管中。使用超 速离心机，以28，OOOrpm(50, OOOg)离心分离1. 5小时。除去上清液，向沉淀中加入20 μ 1 的TNF缓冲液，在4°C条件下静置过夜，充分悬浮后，使用小型高速离心机，以12，OOOrpm离 心分离1分钟，将上清液通过0. 45 μ m的Durapore Ultrafree滤膜(Advantec公司制造)， 将该滤液作为病毒液。按照上述方法，可以得到效价为108CfU/ml以上的病毒液。
(实施例6)通过向鸡胚中显微注射逆转录病毒载体和人工孵化从而制备产生完 全人源抗TNF抗体的转基因鸡
显微注射和人工孵化在无菌条件下进行。使用消毒液(SHOWA FURANKI公司制造) 和乙醇对鸡受精卵(城山种鸡场)的外侧进行除菌。将P-008(B)型孵化机(SHOWA FURANKI 公司制造)设置为38°C、湿度50 60%的环境，将接通电源的时刻作为孵化开始时刻(0 小时)，以后每15分钟将卵转动90°进行孵化。
从孵化开始经过约55小时后，孵化机的转卵改为每30分钟转卵30°。将卵 从孵化机取出，使用带有钻石刀(刀尖径20mm、轴径2. 35mm)的小型车床(minirouter) (PR0XX0N公司制造)以直径为3. 5cm的圆形切取其尖端部。以直径为4. 5cm的圆形切取 鸡双黄卵(城山种鸡场)的尖端部，将受精卵内容物移至舍去内容物的卵壳中，使用注射器 的内筒使胚胎向上移动。在立体显微镜系统SZX12(奥林巴斯公司制造)下，向femto芯片 II (Eppendorf公司制造)中注入病毒液，使用!^emtoJet (Eppendorf公司制造)显微注射约 2μ1的病毒溶液。将卵清制成糊，使用切割成约8X8cm2的保鲜膜(Saran wrap)(旭化成 公司制造)将该穴塞住，重新放入孵化机中继续孵化。从孵化开始至第20天，使用20G的 注射针在保鲜膜上打开20个左右的孔穴，并以60CC/min的速度向孵化机中供氧。一旦雏鸟开始破卵，即将卵壳割碎，使其孵出。该人工孵化的孵化率是7 30%。
(实施例7)从转基因鸡卵中获取IgG抗体
饲养诞生的雏鸡使其成长。作为饲料，使用幼雏S X Mfety和ne0Safetyl7(丰 桥饲料公司制造)。从该转基因鸡的卵中提取IgG抗体是用卵清进行的。使用超声波或物 理方法对卵清进行前处理使其整体均一化。使用蛋白A柱采用通常的柱纯化法制备IgG抗 体。制备好的IgG抗体在测定之前，一直在-80°C条件下冷冻保存。解冻优选在37°C迅速 进行，避免反复冻融。
(实施例8)使用ELISA法定量免疫球蛋白分子的浓度
为了测定实施例7中制备的卵清中IgG抗体的表达量，采用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法。抗体的产量通过测量中使用的标准品算出。
测定方法依照代表性的方法(Immunochemistry，8，871-874(1971))。
使用兔抗人IgG (Fe 特异性)抗体(Organon Teknika, Durham, NC, USA)作为第一 抗体，使用过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Organon Teknika, Durham, NC, USA)作为第 二抗体。使用邻苯二胺作为检出底物而显色，采用酶标仪测定吸光度。使用人IgGl (Athens Research and Technology, Athens, GA, USA)作为定量时的标准。
(实施例9)由实施例1 7制备的转基因鸡卵清来源的完全人源抗TNF抗体的 CDC活性和在CHO细胞中制备的完全人源抗体的CDC活性的比较。
以5X105/孔的浓度向M孔板中加入Iml表达TNF抗原的T细胞(Jurkat细 胞(ATCC No. TIB-152)或者 Raji 细胞(ATCC No. CCL-86))，再分别加入 10 % 人血清 RPMI 1640(日水公司制造)、0. 01,0. 1、1、10μ g/ml的抗体样品，在37°C条件下培养3小时 后，使用PI (碘化丙锭)染色，采用FACS (荧光活化细胞分选)测定活细胞数目。按照下述 方法计算出靶细胞的死亡率。
靶细胞的死亡率=(全部细胞数目-活细胞数目)/全部细胞数目(％)
如图1所示，与CHO细胞来源的完全人源抗TNF抗体相比，转基因鸡卵清来源的完 全人源抗TNF抗体在1/10的浓度下显示了相同程度的靶细胞致死效果，由此可知其具有 10倍的⑶C活性。此外，作为CHO细胞来源的完全人源抗体，使用的是市售的阿达木单抗 (adalimumab 商品名 HUMIRA(R))。1权利要求
1.一种细胞毒性组合物，其以从转基因鸟类产出的卵中得到的抗体为有效成分，所述 转基因鸟类导入有编码IgG抗体的基因。
2.根据权利要求1中所述的细胞毒性组合物，其以从卵清得到的抗体为有效成分。
3.根据权利要求1或2中所述的细胞毒性组合物，其中，IgG抗体的恒定区是人源IgG类。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，转基因鸟类是转基因 家禽鸟类。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，抗体的N-糖苷键复 合物糖链中的岩藻糖含量为CHO细胞来源抗体的五分之一以下。
6.根据权利要求1 5中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，抗体的CDC活性是用 CHO细胞产生的抗体的五倍以上。
7.根据权利要求1 6中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，IgG抗体是识别在癌 细胞中特异性表达的抗原的抗体。
8.—种癌症疾病的改善或治疗剂，其含有权利要求1 7中任意一项所述的细胞毒性 组合物。
9.根据权利要求1 6中任意一项所述的细胞毒性组合物，其中，IgG抗体是中和或抑 制与自体抗原发生反应的效应器细胞的抗体。
10.一种自体免疫疾病的改善或治疗剂，其含有权利要求1 6或者9中任意一项所述 的细胞毒性组合物。
全文摘要
本发明涉及一种细胞毒性组合物，其以从转基因鸟类产出的卵中得到的抗体为有效成分，所述转基因鸟类导入有编码IgG抗体的基因。该IgG抗体的蛋白质一级结构未发生改变，其呈现出比CHO细胞来源的IgG抗体更高的CDC活性，可望具有高抗肿瘤效果且副作用少。此外，本发明提供含有该细胞毒性组合物的癌症改善或治疗剂，或者抗自体免疫疾病的治疗剂。
文档编号A61K39/395GK102036683SQ20098011859
公开日2011年4月27日 申请日期2009年5月19日 优先权日2008年5月20日
发明者山下敬 申请人:株式会社钟化