专利名称：具有提高的细胞毒性和产量的抗EGFRvIII的scFv、基于其的免疫毒素、及其应用方法
相关申请的交叉引用本申请要求于2001年2月25日提交的美国临时专利申请第60/185,039号的权利，相关内容在此结合作为参考文献。
关于政府支持的研究开发相关的发明的权利声明不适用。
免疫毒素是由靶部分(如抗体或其一部分)融合蛋白毒素部分(如假单胞菌外毒素)组成。已证明免疫毒素具有抗人固体肿瘤的活性。一个I期临床试验表明免疫毒素可使肿瘤瘤体缩小，此研究采用抗体为抗多种肿瘤上高表达的Lewis Y-相关抗原抗体(Pai等，Nat Med.2350-353(1996))。先前免疫毒素制备(如Pai等人的研究)采用完整小鼠单克隆抗体，确有一定不足。由于它们的分子相对较大，限制了其对肿瘤的穿透性。另外，抗体和毒素的连接常存在着异质性，故很难获得大量的产物。同样，在论文中提到的各种各样抗EGFRvIII的抗体(例见美国专利编号5,212,290，WO96/16988，及Reist等，癌症研究(Cancer Res.)。554375-4382(1995))，在构建免疫毒素上均存在一些问题。曾希望通过制备以克隆Fvs为靶向目标的完全重组的抗体毒素来克服该缺陷，但是因为抗体的大多可变区作为Fvs的功能较差(因为较弱的VH-VL较弱的相互作用及两者间较弱的结合力)，这种尝试没有取得成功。
MR1是一单链的抗体可变区(scFv)，它与EGFRvIII特异性结合。MR1 scFv是从一个抗体噬菌体呈示库中分离的(Lorimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314815-14820(1996))。这个包括MR1的scFv库是通过被一种EGFRvIII特异性肽和EGFRvIII细胞外结构区(通过亲和色谱法对EGFRvIII表达的肿瘤移植物进行纯化所得)进行免疫的小鼠的脾脏mRNA制备而来(Lorimer等，Clin.Cancer Res.1859-864(1995))。MR1被期望发展为一种以EGFRvIII阳性的癌细胞为靶向目标的治疗药物。MR1序列已被存放于GenBank中，登记号为U76382。
免疫毒素MR1(Fv)-PE38是通过将MR1 scFv融合于一个截短形式的假单胞菌外毒素A(PE38)来形成的，PE38中所有的Ia区和Ib区的365-380氨基酸被去除(Lorimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314815-14820(1996))。其它几种重组PE38免疫毒素正在进行临床试验(Kreitman等，Blood94(10)3340-48(1999)；Pai-Scherf等，Clin.Cancer Res.(in press)(1999)；Pai等，Clin.Application Immunotoxins 23483-96(1998))。通常scFv基因通过一个短连接子与PE38基因结合并且克隆成一个基于T7的表达载体。重组免疫毒素在E.coli中表达后，富集在其包涵体中。在包涵体被简单洗涤后，用盐酸胍溶解，然后蛋白复性并通过离子交换柱层析和凝胶过滤进行纯化。所得分子是具活性的，并且可以通过scFv细胞特异性抗原直接连接。毒素的活性可细胞死亡。
要成为有效的治疗性药物，免疫毒素必须具备强的抗原亲和力，以便对表达此种抗原的细胞产生强的细胞毒性。为简化生产流程和降低成本，免疫毒素的高产量是非常重要的。MR1(scFv)-PE38在可获得的免疫毒素中，对表达EGFRvIII的细胞具有最高的亲和力和最强的细胞毒性，但仍不够理想。它的分离常数(Kd)值为8nM，产量低于3％。因此有必要开发这样一种抗体它具有更强的EGFRvIII亲合力的，并且，它与PE38或其它毒素结合后形成的免疫毒素对EGFRvIII表达细胞也具有更强的细胞毒性。此外，寻找能够提高免疫毒素产量的抗体也是有益的。
一些试图通过从抗EGFRvIII的单克隆抗体开发新的scFv，从而解决上述问题的尝试均告失败。MR1仍为目前唯一可获得的以制造抗EGFRvIII免疫毒素为目标的scFv。
发明简述在一个方面，本发明提供了能与突变形式的上皮生长因子受体(即EGFRvIII)更好结合的抗体。特别地，本发明提供了带有一个突变抗体重链(VH)可变区或一个突变抗体轻链(VL)可变区的多肽，或者二者兼具，这些多肽的Kd值为7nM、6nM、5nM、4nM、3.5nM、3nM，或更低，突变的VH或VL分别通过在互补决定区(CDR)至少一个氨基酸替代而具有不同于母抗体MR1的VH或VL的序列结构，编码这个氨基酸的密码子包含一个选自AGY或RGYW热点区的核苷酸，该处R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。在一些实施例中，该替代会发生在CDR3VH或CDR3VL。在另一些情况，替代会发生于CDR1VH或CDR2VH，或二者兼具，或是在CDR1VL或CDR2VL，或兼具，或是CDR1、2、3VH及VL的任意组合。例如，在一种情况下，替换可发生于CDR3VL、CDR2VL和CDR1VH。
在一个优选的实施例中，此多肽在CDR3VH至少有一个氨基酸一个替换，该替换从S98和T99中选择。在其它优选的实施例中，替换从P98-Y99、P98-N99、P98-w99、P98-I99、P98-F99、和P98-V99中选择。该多肽可在CDR3VL有一个进一步的替换，此时92位的W被F替代。在一个特别优选的实施例中，该多肽在重链有S98P-T99Y替换，并且在轻链包含一个F92W替换(这种抗体被定义为“MR1-1”)。
以上描述的多肽可为一个抗体的单链可变区(一个“scFv”)、一个双硫键稳定的Fv段、一个Fab段、一个F(ab’)2段、或者抗体的其它保留有识别和结合抗原能力的片段。它们也可包括一个噬菌体的表面蛋白。
在优选的实施例中，上述多肽对EGFRvIII的Kd值至少比MR1低1nM。它们的Kd值为7、6、5、4、3.5、3或更低。
以上所述多肽也可以通过偶联、粘附或其它方式与一个效应分子、具疗效的组分或者检测标记相连接。此种具有疗效的组分可以是毒素或毒素中具有细胞毒作用的部分(一种“毒性部分”)，它与多肽连接构成一种免疫毒素。毒性部分可以是白喉毒素或者其细胞毒片段，皂草素(saporin)，商陆抗病毒蛋白，蓖麻毒素或其细胞毒性片段，以及泽泻提取物1(bryodin 1)。在优选的实施例中，毒素为一种假单胞菌外毒素(“PE”)或它的一个细胞毒性片段。在特别优选的实施例中，PE为PE38。由多肽和毒性部分结合而成的免疫毒素的IC50为7ng/ml或更低、6ng/ml或更低、5ng/ml或更低、4ng/ml或更低、或是3.5ng/ml或更低。该免疫毒素的重组表达量至少为3％，可为4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，或更高。
本发明进一步提供了可编码有如下结构多肽的核苷酸分子，该多肽带有一个突变抗体重链(VH)可变区或一个突变抗体轻链(VL)可变区的多肽，或者二者兼具，这些多肽的对EGFRvIII的Kd为7nM或更低，突变的VH或VL分别通过在互补决定区(CDR)至少一个氨基酸替代而具有不同于母抗体MR1的VH或VL的序列结构，编码这个氨基酸的密码子包含一个选自AGY或RGYW热点区的核苷酸，此时R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。在一些实施例中，该替代会发生在CDR3VH或CDR3VL。在另一些实施例，替代会发生于CDR1VH或CDR2VH，或二者兼具，或是在CDR1VL或CDR2VL，或兼具，或是CDR1、2、3 VH及VL的任意组合。例如，在一种情况下，替换可发生于CDR3VL、CDR2VL和CDR1VH。
在一个优选实施例中，与MR1相比，核苷酸编码一种多肽在CDR3VH从S98和T99的基团中至少选择一个氨基酸替换。在其它优选的实施例中，替换可从P98-Y99、P98-N99、P98-W99、P98-I99、P98-F99、和P98-V99中选。该核苷酸亦可同样编码一种多肽在CDR3VL有一个不同于MR1的替换，此时92位的W被F替换。
该核苷酸可编码的多肽为一个抗体的单链可变区(一个“scFv”)、一个双硫键稳定的Fv段、一个Fab段、一个F(ab’)2段、或者抗体的其它保留有识别和结合抗原能力的片段。这些多肽还可包含一个噬菌体的表面蛋白。上述核苷酸分子可以与一个启动子相连接。
在另一组实施例中，本发明提供了杀死带有一种抗原的细胞的方法，包括用由一个毒性部分和一个靶部分组成的免疫毒素与细胞接触，靶部分包含一个多肽，它带有一个突变抗体重链(VH)可变区或一个突变抗体轻链(VL)可变区的多肽，或者二者兼具，这些多肽对EGFRvIII的Kd值为7nM或更低，突变的VH或VL分别通过在互补决定区(CDR)至少一个氨基酸替代而具有不同于亲代抗体MR1的VH或VL的序列结构，编码这个氨基酸的密码子包含一个选自AGY或RGYW热点区的核苷酸，此时R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。在一些情况下，该替代会发生在CDR3VH或CDR3VL。在另一些情况，替代会发生于CDR1VH或CDR2VH，或二者兼具，或是在CDR1VL或CDR2VL，或兼具，或是CDR1、2、3VH及VL的任意组合。
在一个优选的实施例，此方法包含这样一个靶部分，其中的多肽在CDR3VH有一个与MR1不同的替换，该替换至少有一个氨基酸从S98和T99选择。在其它优选的实施例中，靶部分包含的多肽中的替换从P98-Y99、P98-N99、P98-W99、P98-I99、P98-F99、和P98-V99中可选。在一个特殊优选的实施例中，靶部分为MR1-1。
靶部分可以是一个抗体的单链可变区(一个“scFv”，)、一个双硫键稳定的Fv段、一个Fab段、一个F(ab’)2段、或者抗体的其它保留有识别和结合抗原能力的片段。
带有特定抗原的细胞可能是恶性细胞，例如胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、或者卵巢癌细胞。
图2.MR1、MR1-1和在VHCDR3中有S98P-T99Y突变的MR1的BIACore传感3.患有颅内肿瘤(为经EGFRvIII转染的人胶质母细胞瘤细胞)的无胸腺小鼠，用以MR1-1作为靶部分的免疫毒素治疗后的存活情况。Y轴表示在所给时间点的动物存活率。X轴表示以天数计算的存活时间。图标MR1-1代表MR1-1-PE38免疫毒素。填充的菱形表示动物被施予6μg的MR1-1-PE38免疫毒素，7天24小时注入。空白三角形动物被给予2μg的MR1-1-PE38免疫毒素，给药的方法同前组。空白圆形动物被给予对照盐水，给药方法同前组。
图4.患有颅内肿瘤(为经EGFRvIII转染的人胶质母细胞瘤细胞)的无胸腺小鼠，用以MR1-1作为靶部分的免疫毒素和生理盐水治疗后的存活情况。Y轴表示在所给时间点的动物存活率。X轴表示以天数计算的存活时间。图标MR1-1代表MR1-1-PE38免疫毒素。空白菱形表示动物被施予0.2μg的MR1-1-PE38免疫毒素，在7天用24小时注入(在200μl含0.2％HAS的PBS中)。空白三角形动物被给予0.6μg的MR1-1-PE38免疫毒素，给药的方法同前组。空白圆形动物被给予2.0μg的MR1-1-PE38免疫毒素，给药的方法同前组。X动物被给予对照盐水，给药方法同前组。
图5.患有肿瘤性脑膜炎(通过鞘内注射EGFRvIII转染的人胶质母细胞瘤细胞而致病)的无胸腺小鼠，用以MR1-1作为靶部分的免疫毒素和生理盐水治疗后的存活情况。Y轴表示在所给时间点的动物存活率。X轴表示以天数计算的存活时间。图标MR1-1代表MR1-1-PE38免疫毒素。三角形表示动物在致病的第3、5和7天，被给予2μg的MR1-1-PE38免疫毒素(在40μl含0.2％HA的PBS中)，共计6μg。菱形动物在致病的第3、5和7天，被给予1μg的MR1-1-PE38免疫毒素(在40μl含0.2％HA的PBS中)，共计3μg。圆形在被致病的第3、5和7天，给予动物40μl含0.2％HA的PBS，作为对照。
图6.右胁部被注射EGFRvIII转染的人胶质母细胞瘤细胞的无胸腺小鼠，用以MR1-1作为靶部分的免疫毒素和生理盐水治疗后，瘤体大小随时间的变化。Y轴表示瘤体大小，以mm3为单位。X轴表示距初始治疗的天数(动物在“0”天前即被注射肿瘤细胞)。图标MR1-1代表MR1-1-PE38免疫毒素。方形在第0、2和4天，动物被注射1μg的MR1-1-PE38免疫毒素(在20μl盐水中)，总计3μg。直立三角形在第0、2和4天，动物被注射2μg的MR1-1-PE38免疫毒素(在20μl盐水中)，总计6μg。倒三角形在第0、2和4天，动物被注射3μg的MR1-1-PE38免疫毒素(在20μl盐水中)，总计9μg。菱形在第0、2和4天，动物被注射20μl盐水，作为对照。
发明详述I.介绍本发明提供了scFv抗体和其它与MR1相比对EGFRvIII有更高亲合力的抗体。还进一步提供了与以MR1作为分子靶部分的免疫毒素相比，对EGFRvIII表达的细胞具有更强细胞毒性的免疫毒素。这些抗体用MR1制造，但在它们的互补决定区(CDR)的热点区有突变。令人惊奇的是，以这些MR1的突变形式作为靶部分的免疫毒素不仅对EGFRvIII有高的亲合力，而且同以MR1作为分子靶部分的免疫毒素相比，产量有明显提高。
CDRs中存在着大量氨基酸，这是CDRs的随机化构建抗体文库的限定因素。由于大多数抗体还没有得到X-射线空间结构，通常很难识别CDR中那些经过突变后可能产生高亲和力抗体的少数氨基酸。所以，要想确保得到具有很高亲和力的抗体，就必须构建庞大的随机抗体文库。
在具有代表性的研究中，突变发生在MR1重链可变区(VH)的CDR3。MR1的VHCDR3有11个氨基酸。VH区的最末两个残基，D101和Y102，在诱变研究中被去除，因为它们被认为不参与抗原结合，共有两个原因。第一个原因是，这两个残基通常位于与VL的接点处，因而它们不会被暴露。另一个原因是，它们是通过J段促成并且紧随VHCDR2的3’-结合区，因而与VHCDR3的其余部分相比，它们被遮掩得更好。
CDR3VH其它位点上的9个氨基酸被它们各自相应的天然氨基酸替换。本研究显示只有在已知的热点区(在抗体亲和性形成过程中发生高度突变的区域，其最鲜明的体现是RGYW和AGY区，此处R是A或G，Y是C或T，W是A或T)发生的突变才能使抗体具有与作为亲代抗体的MR1相比更强的细胞毒性。还发现，由突变的scFv参与形成的免疫毒素同由亲代抗体MR1scFv参与形成的同样的免疫毒素相比，这些突变体使免疫毒素产量有所提高。在另一个典型研究中，突变发生在MR1轻链可变区的CDR3。在这些研究中，突变只发生在一个热点区内的氨基酸上。同样地，这些突变生成的抗体与亲代抗体MR1相比，细胞毒性和产量都有提高。
基于以上研究结果，毋需随机化CDR的每个氨基酸来确定哪些突变会得到具有更高亲合力的突变产物。认为在VH和VLCDRS1和2的热点区发生的突变，产生的抗体产物参与形成免疫毒素后，可能具有对EGFRvIII更强的亲合力和对表达EGFRvIII的细胞更高的细胞毒性，并且此种scFv参与形成的免疫毒素与MR1形成的免疫毒素相比具有更高的产量。由于这些氨基酸替换导致了良好的特性改善，当这些MR1的突变形式(包括那些在CDR3的VH和VL区发生的突变)发生在双硫键稳定的Fvs(dsFvs)、Fab’、F(ab’)2或者Fab片段时，会产生同样的阳性效果。
增加的细胞毒性并非必然伴随增加的亲合力(表4和5，infra)。对此种不相关性尚无明确的解释。除了亲合力(标准的测量是在22℃下进行)之外，毒性作用过程的许多方面都受到“热点”突变的影响。这些方面包括37℃下的稳定性、进入的速率、蛋白分解进程和向目标部位的转移。可能一个或多个这些方面受到影响。EGFRvIII的高亲合力抗体具有多种不同的用途，特别用于诊断和体外化验，来检测样品中是否存在表达EGFRvIII的细胞。例如，在体外的应用中，可将对EGFRvIII有较高亲合力的抗体(如scFv)同放射性同位素或其它任何可检测标记物相连接，用来检测从病人身上取得的活检标本中是否存在EGFRvIII表达的细胞，从而判断患者是否罹及此种细胞的癌症，或者用于判断癌症是否根除。与此类似，在体内的应用中，scFv、dsFv以及其它此发明涉及的抗体可被同放射性同位素或其它可检测标记物相结合，用于检测病人体内是否存在EGFRvIII表达的细胞，从而诊断病人是否患有以此种细胞为特征的癌症，或者曾患有的此种癌症是否被根除。
最后一点，CDR突变体中存在的一个惊人差别是活性单体蛋白的产量。重组毒素以不溶的聚合蛋白(免疫毒素)的形式聚积于包涵体内。活性单体的制备过程是先将包涵体在6M盐酸胍中溶解，之后在一个氧化还原系统中进行可控制的复性，并将单体自多聚体和聚合体中分离出来。这些研究显示在CDR中1至2个氨基酸的替换可明显增加免疫毒素的产量(表6)，描述及解释见后。MR1(FV)-PE38的产量仅为2％，但CDR3重链区发生S98P-T99S突变后，产量令人吃惊地增加至17％。据推测，这些替换对折叠途径有深刻的影响。通常，所有在诱变初期重链上发生的突变都会产生与亲代MR1相比较高的产量。然而，CDR3重链在正确折叠的环节上非常重要，噬菌体表达系统可能会选择那些折叠较充分的蛋白。因此，含有折叠较好的Fvs的噬菌体的数量大大增加，并且在抗原筛选过程中被优选。
基于这些结果，可用噬菌体来挑选在VH和VL的CDR1或2上有替换的Fvs，并且得到与亲代MR1scFv相比更高的产量。
用载人类肿瘤的动物模型进行了体内试验，来验证以MR1-1为靶向目标的示范性免疫毒素的疗效。为建立动物肿瘤模型，无胸腺大小鼠颅内、鞘内、或皮下注射人类神经胶质瘤细胞系(U87MG)，这些瘤细胞已经转染，可表达EGFRvIII(被转染的EGFRvIII表达细胞系被定义为U87MG.ΔEGFRvIII，并且已在Nishikawa等的文献中描述，Proc Natl Acad Sci(USA)91(16)7727-7731(1994))。一旦肿瘤模型被建立，这些大鼠或小鼠即被注射或者持续融合不同剂量的免疫毒素。如以下实施例和图3-6所述，不管肿瘤的位置和给予免疫毒素的方式如何，与给予对照盐水的动物相比，被施予1或2μg免疫毒素的动物的肿瘤生长明显减慢并且存活时间延长。II.定义单位、前缀和符号均按照国际单位系统(SI)的规定表示。定义范围内的数字包括在这一范围内。除非特别说明，核酸按照5’至3’的方向从左至右书写；氨基酸序列按照氨基至羧基的方向从左至右书写。这里所提到的标题不是对本发明中各个方面或结构的限制，它们的含义要根据被叙述的语境而定。因此，下面将要提到的词汇的更为确切的含义需要要参照其语境上下文确定。
按照传统方法，一个已知序列的氨基酸突变通常以出现在某特定位点的氨基酸的单字母缩写、突变的氨基酸位点，和用于替换的氨基酸代号来表示。因而，以MR1 CDR3VH为例，“S98P”表示通常在MR1的重链区CDR3第98位上的丝氨酸被脯氨酸替换。象“S98”这样数字后面没有跟随氨基酸缩写的表示方法，表示该氨基酸正常地出现在其通常所在的位点或是此位置现已存在的特定的氨基酸(即，标定的氨基酸已将该位置通常存在的氨基酸取代)。其具体含义根据上下文确定。这里用作参考的MR1-1的氨基酸的编号依照Kabat等人的SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICALINTEREST，U.S.Department of Health Human Services，(1987)，进行修订；此参照之后被称作“Kabat”，其内容当scFv序列进行调整并依据Kabat系统进行编号时，用来作为参考。
“EGFRvIII”是指一种可被MR1scFv识别的表皮生长因子受体的突变形式，其特征是靠近氨基端2-7个外显子的801个框架区碱基对的缺失。这种受体在专业领域被熟知，可参看在背景资料中涉及的Wickstrand等，Moscatello等，及Lorimer等的文章。因专业术语经过了一次改动，在先前的一些工作中EGFRvIII被称为II型突变，例如编号5,212,290的美国专利。
在此处用到的“抗体”包括对特定抗原具有免疫活性的免疫球蛋白分子，以及某种多克隆和单克隆抗体。此术语还包括一些遗传工程产物，例如嵌合抗体(如鼠抗人抗体)以及杂合抗体(如双特异性抗体)。此处本术语特指重组单链Fv片段(scFv)，双硫键稳定的FV片段(dsFv)(见U.S.S.N.08/077,252，此处用作参考)，或pFv片段(见美国临时专利申请书60/042,350及60/048,848)。术语“抗体”还指抗原结合形式的抗体，包括有抗原结合能力的片段(如，Fab’、F(ab’)、Fab、Fv和rIGg。又见Pierce Catalog andHandbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)。以及Kuby，J.，Immunology，3rdEd.，W.H.Freeman&Co.，New York(1998))。其具体含义根据上下文确定。
一个对特定抗原具有免疫活性的抗体可通过诸如从噬菌体或类似载体的重组抗体库中挑选的重组方式产生，例如，Huse等，Science 2461275-1281(1989)；Ward等，Nature 341544-546(1989)；及Vaughan等，Nature Biotech.14309-314(1996)，或是通过用抗原或用编码抗原的DNA免疫动物产生。
典型地，一个免疫球蛋白有一条重链和一条轻链。每条重链和轻链包括一个恒定区和一个可变区，(这些区也被称为“域”)。轻链和重链可变区包括四个“骨架”区，它们被又名“互补决定区”或“CDR”的三个高变区分隔。骨架区和CDR的界限已被划分(见Kabat，supra)。不同轻链和重链中的骨架区的氨基酸序列在同一种属中相对稳定。一个抗体的骨架区，也就是由轻链和重链的骨架区结合而成的部分，可在三维空间中对CDR进行定位和调整。
CDR是与抗原决定簇相结合的主要部位。每条链上的CDR依惯例从N末端开始依次被编号为CDR1、CDR2和CDR3，并且通常该CDR所在的链也被标明。因此，VHCDR3位于所在抗体的重链可变区，而VLCDR1则是指位于所在抗体的轻链可变区上的CDR1。
符号“VH”或“VH”是指一个抗体免疫球蛋白重链(包括一个Fv、scFv、dsfv或Fab的重链)上的可变区。符号“VL”或“VL”指一个免疫球蛋白轻链(包括一个Fv、scFv、dsfv或Fab的轻链)的可变区。
短语“单链Fv”或“scFv”指的是传统的双链抗体上的轻链和重链的可变区相结合形成的一条单链抗体。典型地，两条链被一个接连肽相连，以进行适当折叠和形成活性结合位点。
术语“连接肽”指在一个抗体结合片段(如Fv片段)上间接地将重链和轻链可变区相连接的一种蛋白质。
术语“母代抗体”通常指一个常被用于突变或变异为一些新的抗体或抗体片段的抗体，而这些新的抗体或片段可结合的抗原决定簇与其相同。除非特别指出，这里提到的术语“亲代抗体”指的是名为“MR1”的scFv。
术语“热点”是指一个可变区的CDR或骨架区的一部分核苷酸序列，是一个具有极高自然突变性的部位。尽管CDR被认为是高变区，但已发现突变的发生在CDR上的分布并非均匀一致。特殊的部位，或称热点，已被证实具有很强的易突变性。热点具有特定的结构特征和序列。这些“热点区”可用作鉴别热点。两个公认的极具代表性的区是四核苷酸序列RGYW和丝氨酸序列AGY，此处R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。
“靶部分”或“靶分子”是一个免疫结合部位，它对相应靶细胞具有免疫结合能力。典型地，靶部分是一个可识别特定细胞上特定抗原的抗体、scFv、dsFv、Fab或F(ab’)2。
“毒性部分”是一种细胞毒素或细胞毒素的一部分，当被结合形成免疫毒素后，可使该免疫毒素对相应细胞具有细胞毒性。
“免疫毒素”是一个包括一个靶分子(如一个scFv)和一个毒性部分(比如一个假单胞菌外毒素(“PE”)或其细胞毒片段)的分子。
这里讨论的免疫毒素通常在E.coli的包涵体中表达，之后包涵体被纯化，在6M盐酸胍中溶解，并进行蛋白重折叠。这里用到的术语“产量”是指在此过程中收集到的正确折叠的单体免疫毒素的量。它用百分比来表示，计算方法是MonoQ离子交换色谱分析之后的蛋白量(mg)/包涵体重组蛋白量(mg)。
“治疗部分”是指免疫结合物中具有疗效作用的部分。
术语“治疗药物”包括所有已知的或将被开发的具有抗肿瘤药、抗炎药、细胞活素、抗感染药、酶的活化剂或抑制剂、变构修饰物、抗生素或其它可对病人产生某种疗效的药物作用的化合物。治疗药物也可以是一种毒素或放射性同位素，其具有某种治疗作用，比如杀死癌细胞。
“可检测标记物”对一个免疫结合物而言，能检测其存在的部分。比如，可检测到放射性同位素标记的免疫结合物在其靶细胞上的含量。
术语“效应部分”和“效应分子”是指免疫结合物中与相应靶细胞作用或确定免疫结合物存在的部分。因此，效应部分可以是一个治疗部分、一种毒素、一种放射性标记物、或一种免疫荧光标记物等。
术语“免疫结合物”是指由一个靶分子(如一个scFv)直接(如通过一个共价连接)或间接(如通过一个连接肽)结合一个效应分子而形成的嵌合分子。在一个免疫结合物的子集中，效应分子是一种毒素，而这种嵌合分子被特别命名为“免疫毒素”。
术语“有效剂量”或“有效的剂量”或“治疗有效剂量”是指足以获得期望结果(例如，至少50％抑制细胞蛋白合成，或者杀死细胞)的治疗药物的剂量。
术语“毒素”包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒毒素、或它们被修饰后的产物。例如，PE和DT是剧毒化合物，通常可因肝毒性导致死亡。然而，修饰后PE和DT可成为免疫毒素的一部分，即去除毒素原有的靶部分(如，PE的Ia区或DT的B链)，采用其它靶部分所替换(比如一种抗体)。
术语“IC50”指能50％抑制蛋白合成的毒素或免疫毒素的浓度(用ng/ml表示)。
术语“接触”是指直接物理性结合的状态。
“表达质粒”包括同启动子相连的编码目标分子的一段核苷酸序列。
这里所提到的“多肽”、“肽”和“蛋白质”是可以互换使用的，是指一种氨基酸聚合物。这些词汇适用于其中一个或多个氨基酸是相应的天然氨基酸的人为化学类似物的氨基酸聚合物，以及那些天然的氨基酸聚合物。还适用于其中有保守氨基酸被替换而蛋白质依然保持其功能性的多聚体。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”包括可构成蛋白质、多肽、或肽(均可用“肽”表示)的氨基酸。这种氨基酸可以是天然氨基酸，而且除非特别限制，可包括与天然氨基酸功能相类似的天然氨基酸的类似物。
这里提到的氨基酸及其类似物的简写见表1
表1 氨基酸专用缩写名称 3字母 1字母丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酸 Glu E谷胺酰胺 Gln Q甘氨酸 Gly G组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K蛋氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V“保守替换”用于描述一种蛋白质时，是指构成这种蛋白质的氨基酸组分所发生的不影响蛋白质活性的改变。因此，特定氨基酸序列的“保守修饰突变”是指对蛋白质活性影响不大的那些氨基酸的替换，或指用性质(如，酸性、碱性、带正电或负电、极性或非极性等)相似的氨基酸进行的替换，如此以来，即便替换发生于那些重要的氨基酸也不致影响蛋白活性。保守替换表给出了专业领域中熟知的功能近似的氨基酸。下方表2中的6组氨基酸中，每组中的氨基酸互相之间都可进行典型的保守替换。
表21)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
还可参见，Creighton，PROTEINS，W.H.Freeman and Company，New York(1984)。然而需要指出的是，尽管苯丙氨酸和色氨酸通常被认为可以相互进行保守替换，但在scFv MR1的VLCDR3热点处进行的色氨酸对苯丙氨酸的替换所产生的免疫毒素却具有比其亲代scFv更强的活性。因此，尽管这两个氨基酸被认为在一个抗体CDR区之外的部分可发生相互的保守替换，但在本发明中，它们在热点区内的相互替换却不是保守的。基于这些结果，除非被验证(例如，在本研究中，来检测替换是否影响了分子的亲合力或者以此种蛋白作为靶部分的免疫毒素的产量，或两者都进行检测)，热点区发生的氨基酸替换都被认为是不保守的。
词语“基本相似”在描述一种肽时，表示的是在一个10-20个氨基酸的比较窗中，一种肽至少有90％、若优选则至少有95％的序列与参照序列一致。序列一致率是通过在一个比较窗口中对两个进行了最佳排列的序列进行比较得出的，其中在比较窗口中可能含有增加或缺失(即，缺口)的多聚核苷酸序列同参考序列(不包含增加或缺失)相比较，以得到最佳对比效果。百分比的计算是，确定两个序列中相同的核苷酸或氨基酸位点的数目，得到相配位点的数量，用比较窗口中的总位点数去除相匹配的位点数，再乘以100就得到一致序列的百分率。
术语“双硫键”或“半胱氨酸-半胱氨酸双硫键”是指两个半胱氨酸之间的共价结合，其中半胱氨酸的硫原子被氧化形成一个双硫键。双硫键的平均键能是大约60kcal/mol，而一个氢键的键能为1-2kcal/mol。在本发明中，形成双硫键的半胱氨酸位于单链抗体的骨架区，对抗体的构象起稳定作用。
术语“结合”、“联接”、“连接”或“链接”是指将两个多肽相接触形成一个连续的多肽分子。本发明中，此术语包括将一个抗体部分与一个效应分子(EM)相连接。连接可以用化学或重组的方式。化学方式指抗体部分和效应分子发生反应，在两个分子之间产生一个共价键从而将二者合并成一个分子。
这里提到的“重组”是指一种蛋白质从在天然状态下不具有内源性表达此种蛋白的DNA的细胞中产生。这种细胞能产生重组蛋白，是因为它们已经因适当的被分离出的核酸序列导入而发生了遗传改变。此术语还可指这样一种细胞、核酸、或载体，它们是通过异种核酸的导入或天然核酸的变更被修饰，从而产生的一种非此细胞天然状态的形式，该细胞也可以是从被修饰的细胞中衍生而来。因此，比如，重组细胞表达此细胞天然状态(非重组)下没有的基因、天然形态下不存在的基因突变、或者是那些异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
这里提到的“核酸”或“核酸序列”，指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，除非特别限制，也包括能以与天然核苷酸相类似的方式杂交形成核酸的天然核苷酸类似物。除非特别声明，一个特有的核酸序列包括其互补序列和保守突变体(即，在密码子和突变体多变部位出现的核酸，当被翻译成蛋白质时，产生一个氨基酸的保守替换)。
在此处，对一个特定的的核酸来讲，“编码”是指该核酸含有翻译为特定蛋白质的信息。这种信息通过密码子来确定。典型地，氨基酸序列被核酸应用“通用的”遗传密码来编码。然而，通用密码的突变体，比如可出现在一些植物、动物、和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 822306-2309(1985))、或纤毛虫大核中，当核酸应用这些有机体的翻译结构进行表达时，可利用突变密码子。
短语“框架融合”是指链接编码多肽的两个或多个核酸序列，从而使被链接的核酸序列翻译形成包含初始多肽链的一单链蛋白。
此处应用的“表达”是指一个核酸翻译形成一种蛋白质。蛋白质可被表达并保留在细胞内、变成细胞膜的组分或者分泌到细胞外的基质或介质中。
“宿主细胞”是指一个可支持表达载体的复制和表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞(如E.coli)或真核细胞(如酵母菌、昆虫、两栖动物、或哺乳类动物的细胞)。
短语“噬菌体呈示库”是指这样一类细菌噬菌体的总体，它们中的每一个都含有重组融合入一种表面蛋白框架结构的一种外源cDNA。在宿主细胞(以E.coli为典型)中复制之后，含有特定外来cDNA的噬菌体可通过其表面异种蛋白的表达被挑选。
术语“一致性”或“一致”百分率，出现于两个核酸或多肽序列进行比较时，指的是有一定的比例相同或者全部相同的两个或多个氨基酸或核苷酸序列或亚序列，当对其进行比较和校准以获得最大相似性，可以采用下列序列比较算法中的一种或通过观察进行计算。
在比较两个核酸或多肽序列时，词语“基本一致”代表两个或多个序列或亚序列中至少有60％、更好80％、最好90-95％的核苷酸或氨基酸是一致的，当对其进行比较和排列来得到最大相似性时，采用下列序列比较算法中的一种或通过观察进行计算。优选地，基本一致的序列区的长度至少有50个氨基酸，100个氨基酸以上更好，最佳在150个氨基酸以上。在一种优选的情况下，整个编码区的序列均基本一致。
在序列比较中，典型地是将一个序列作为参照序列，被测序列与其进行比较。当使用一种序列比较算法时，将被测和参照序列输入计算机，一致的序列被列出，如果有必要，序列算法程序参数也被列出。序列比较算法根据得出的程序参数，计算被测序列相对于参照序列的序列一致百分率。许多这种算法程序在专业领域已熟知。
两个核酸序列或多肽基本一致的一个深层含义是，一个核酸编码的多肽和另一个核酸编码的多肽具有免疫交叉活性，具体描述见后。这样，一个多肽通常与另一个多肽基本一致，例如，两个多肽只存在保守替换上的差别。两个核酸序列基本一致的另一个含义是这两个分子在特定条件下可相互杂交，具体描述见后。
术语“体内”是指在具有所需细胞的生物体内。“在体外”或“体外”表示在具有所需细胞的生物体外。
短语“恶性细胞”或“肿瘤”是指具有攻击性和/或可转移的肿瘤或肿瘤细胞，亦即，癌细胞。
此处用到的“哺乳动物细胞”指来自包括人类、大鼠、小鼠、豚鼠、黑猩猩、或猕猴等哺乳动物的细胞。这些细胞可在体内或体外进行培养。
对一个抗原来讲，术语“选择活性”是指与其相匹配的抗体全部或部分与带有这种抗原的细胞或组织结合，而不结合那些缺乏这些抗原的细胞或组织。当然，在一个分子和一个非靶细胞或组织之间也会有一定程度的非特异性相互作用。尽管如此，选择活性也可以通过对抗原的特异性识别来加以区分。尽管具选择活性的抗体结合抗原，但其亲合力可能很低。另一方面，抗体在和带有相应抗原的细胞之间产生的特异性结合的结合力比和缺乏此抗原的细胞之间的结合力要强得多。带有EGFRvIII的细胞或组织由于特异性结合而导致的抗体结合量(每单位时间)同缺乏EGFRvIII的细胞或组织相比，一般高出2倍以上，5倍以上较好，10倍以上更好，100倍以上最好。这种情况下同蛋白的特异结合需要一个被挑选出的对特定蛋白具有特异性的抗体。许多免疫测定法适用于挑选对特定蛋白具有特异的免疫活性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法是常规用于挑选对某种蛋白具特异免疫活性的单克隆抗体的方法。参见Harlow&Lane，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Publications，纽约(1998)，其中描述了用于检测特异免疫活性的免疫检测方法和条件。
术语“免疫反应条件”是指在该条件下，特定抗原的抗体与该抗原决定簇结合的程度可被检测的高于抗体与所有其它抗原决定簇结合的程度，和/或排斥后一种结合情况。免疫活性条件决定于抗体结合反应的方式，具代表性的是那些用于免疫检测的或体内本身的条件。参见Harlow&Lane，supra，其中描述了免疫检测的方法和条件。优选地，本发明检测方法中用到的免疫反应条件是参照活体哺乳动物体内或哺乳动物细胞内的“生理性条件”(如，温度、渗透压、pH)。虽然已经认识到有些器官需要特殊的条件，生物体内和细胞外的环境一般在pH7左右(即，从pH6.0至pH8.0，最常见为pH6.5至pH7.5)、以水作为主要溶剂、并且温度高于0℃低于50℃。渗透压维持在能使细胞生存和繁殖的范围内。III.比MR1具有更强EGFRvIII亲合力的抗体的制备抗体通过CDR3上的氨基酸同抗原结合。因此CDR诱变被广泛用于增加抗体Fab和Fv片段的亲合力。有多种不同的CDR诱变方法。其中的大部分，比如以密码子为基础的突变(Yelton等，J.Immunol.1551994-2004(1995))、CDR漂移(Barbas等，TrendsBiotech.14230-234(1996)；Yang等，J.Mol.Biol.254392-403(1995))、错误复制(Low等，J.Mol.Biol.260359-368(1996))以及人工CDR构建(de Kruif等，J.Mol.Biol.24897-105(1995))，需要构建技术上很难操作和控制的大型抗体库。抗体亲合力成熟化的趋势已经倾向从较小规模的的抗体库中分离高亲合力结合物(Pini等，J.Biol.Chem.27321769-21776(1998)；Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 956037-6042(1998)；Chowdhury等，Nature Biotechnol.17568-572(1999))。所有这些方法都包括通过CDRs突变构建抗体表达库和选择较好的结合物。
噬菌体呈示技术已成为用来筛选大分子肽或蛋白库的有效工具(Winter等，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)；McCafferty，J.，Nature 348552-554(1990)；Babas等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA887978-7982(1991))。通过在噬菌粒载体中和M13噬菌体的第三基因蛋白融合表达，单链Fvs可以被表达在噬菌体病毒颗粒上。融合蛋白可在大肠杆菌中表达，并且在辅助噬菌体存在的条件下，融合蛋白被呈示在可以在培养液中收集到的M13噬菌体的末端。可呈示同特定抗原相结合的scFv融合蛋白的噬菌体，通过在表达此种抗原的细胞上或是偶联了此种抗原的某个表面(如磁头)上筛选噬菌体库的方法进行筛选。没有结合的噬菌体被冲洗掉，结合了的噬菌体被洗脱并通过重新感染E.coli的方法进行扩增。多次筛选可使特异性结合物得以富集。通过严格控制筛选条件，可以更有效地将较好的结合物同较差的结合物相分离。
噬菌体呈示技术可被用作开发对EGFRvIII的亲合力比MR1更强的抗体。专业领域内众所周知，一个完整的抗体包括两条重链和两条轻链；每条链上有3个CDR，分别叫做1，2，和3。每个CDR均参与抗原结合，它们的作用却很不平衡。通常可参见Kuby，J.，Immunology，W.H.Freeman&Co.，纽约(3rdEd.1998)。虽然任何一个CDRs中的氨基酸均可被突变形成亲合力提高的突变体，但平均来讲，每条链的CDR3在抗原结合中的分布远大于这条链中的CDR1和CDR2。通常参见Kuby，supra，117页。因此，在CDR3VH和VL链上的突变更为有益。此外，鼠的MR1CDR3VH相对比较长，这使得同其它scFv相比，MR1scFv可能会相对稳定。
去除VHCDR3最后的两个不太可能参与抗原结合(在简介中已讨论其原因)的氨基酸后，保留的VHCDR3的9个氨基酸被其它19种天然氨基酸中的任何一种替换。只有丝氨酸和苏氨酸分别在98和99位上的突变能使相应免疫毒素的细胞毒性增加(CDR3的VH和VL的氨基酸序列以单个字母代码在表5、6和7中列出。所列出的VH序列中没有D101和Y102这两个氨基酸，它们被认为不可能参与抗原结合)。VHCDR3优选的替换是P98-Y99，它所形成的PE38免疫毒素的IC50为3.5ng/ml，P98-N99、P98-W99、和P98-I99的IC50都为4.5ng/ml，P98-F99的IC50为6ng/ml，而P98-V99的IC50为6.5ng/ml。四种克隆P98-S99、W98-V99、S98-W99和P98-T99的IC50与亲代克隆相同。(根据惯例，象“P98-Y99”这样的符号表示，脯氨酸出现在特定多肽(此处为MR1VHCDR3)的98位，酪氨酸出现在99位，但其余分子与正常状态下的多肽相同，在此处指亲代抗体MR1)。
至于VLCDR3，只有一个F92W的突变使相应的免疫毒素与亲代抗体相比更具活性。它的IC50为1.3ng/m1。这里的“亲代”分子是指在VHCDR3发生了P98-Y99替换的MR1，它在没有VLCDR3突变时的IC50为3.5ng/ml。这个突变了的MR1，包括VH链和VL链上CDR3的突变(VHS98P-T99Y-VLF92W)，当其作为一个免疫毒素的靶部分时，具有所检测过的最强的细胞毒性，现命名为“MR1-1”。
这些结果显示各种CDR中的突变可产生附加的效应，并且使相应免疫毒素的细胞毒性增加。考虑到这些结果，与MR1相比，MR1上发生在VH和VL的CDR1和CDR2热点区的突变，同样地也会使相应免疫毒素对EGFRvIII的亲合力和细胞毒性增强。
最佳的分析克隆的时间是早期。在富集峰出现后进行的筛选是有害的，因为有丢失克隆的危险。有可能具有低亲和力但高表达力的Fv优先剧增而好的结合物被丢失。当筛选轻链CDR3库时已观察到支持此观点的证据三轮后，具有低亲和力(Kd22nM)的突变F92S的克隆在10个被检测克隆中占7个，而最佳结合物F92W在其中只有一个。与之相反，在第二轮，F92S在17个克隆中只有2个，而F92W有6个。IV.抗-EGFRvIII抗体本发明提供了一种对EGFRvIII具有比已知抗体更高的亲和力的抗体，并且对EGFRvIII具有选择活性。特别地，同已知最好的抗-EGFRvIII的抗体MR1相比，本发明提供了对其具有更低Kd的抗体。此外，同由MR1参与形成的同类免疫毒素相比，这些抗体参与形成的免疫毒素对EGFRvIII表达的细胞具有更强的细胞毒性。本发明还进一步提供了一种方法，可以获得比MR1对EGFRvIII具有更强亲合力和细胞毒性的抗体。下面将要提到的免疫结合物是利用本发明的抗体同EGFRvIII结合获得的。这些抗体在免疫条件下，对在哺乳动物细胞表面暴露，并可接受来自细胞外抗体的EGFRvIII抗原决定簇具有选择性免疫活性。
本发明的优选实施例中，这种抗EGFRvIII抗体是一个重组的抗体，如一个scFv或一个双硫键稳定的Fv抗体。典型的Fv抗体大约为25kDa，并具有可以与重链和轻链上的3个CDR结合的一个完整抗原结合位点。如果VH和VL被非连续地表达，Fv抗体的链则典型地通过非共价交互作用进行结合。然而，这些链在被稀释时趋向分离，所以开发了一些方法，如通过戊二醛、分子间双硫键或一种连接肽将这些链进行交联。双硫键稳定的Fvs的制备方法被教导，例如，美国专利第5,747,654号。
在一个特别优选的实施例中，抗体是一条单链Fv(scFv)。一个scFv中的VH和VL区由一条单链构成，它可折叠形成同双链抗体相似的抗原结合位点。一旦被折叠，非共价相互作用稳定了这个单链抗体。在一个更为优选的实施例中，这种scFv是重组产生的。专业人员应该意识到本发明的抗体可发生保守突变。这种在scFv片段中的保守突变会保留对正确折叠和稳定VH和VL区起主要作用的氨基酸。
在本发明的一些实施例中，scFv抗体通过轻链直接与效应分子(EM)连接。然而，scFv抗体也可通过它的氨基或羧基末端同EM相连。
虽然一些抗体形式的VH和VL区可直接相连接，专业人员能够估计到这些区之间可能会含有一个或多个氨基酸的连接肽。连接肽及其用途在专业领域已被熟知。参见例如，Huston等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 85879(1988)；Bird等，Science 2424236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry 291362(1990)；美国专利编号4,946,778、美国专利编号5,132,405以及Stemmer等，Biotechniques14256-265(1993)，在此处均被用作参考。通常，除了将VH和VL区域相连或是维持它们的某种最小距离或其它空间关系外，连接肽没有特别的生物活性。然而，有些发生了氨基酸替换的连接肽可影响分子的一些特性，比如折叠、净电荷、或疏水性。单链Fv(scFv)抗体可随意地包含一个长度不超过50个氨基酸的连接肽，通常不超过40个，优选地不超过30个，不超过20个更佳。在一些实施例中，连接肽是一个有着Gly-Gly-Gly-Gly-Ser序列的多联体，优选地含有2、3、4、5、或6个这样的序列。然而，已知这些联接子中可以发生氨基酸替换。例如，一个缬氨酸可以替换一个甘氨酸。
A.scFv的制备如上所述，在优选实施例中，该抗体(例如，一种免疫毒素的靶部分)是一个scFv。制造scFv抗体的方法已有介绍。参见Huse等，supra；Ward等，Nature 341544-546(1989)；以及Vaughan等，supra。简言之，来自B细胞的mRNA被分离并且cDNA被制备。可采用众所周知的技术扩增cDNA(例如PCR，通过免疫球蛋白重链和轻链多变区的特异性引物)。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳等方法被纯化，并进行核酸测序。如果想要一个连接肽，可将编码该多肽的核酸序列插入到重链和轻链核酸序列之间。连接这些序列可采用专业领域中熟知的技术，例如，平端连接，在PCR产物末端插入限制性位点或者通过重叠序列的剪切(Chowdhury等，Mol.Immunol.349(1997))。扩增后，编码scFv的核酸被插入到一个载体中，其技术同样是专业领域所熟知的。优选地，该载体能够在原核细胞中进行复制并且在真核和原核细胞中都能被表达。在一个优选实施例中，scFv基因与PE38基因通过一个短的连接子相连并克隆为一个基于T7的表达载体。在特别优选的实施例中，scFv在E.coliBL21(λDE3)中在T7启动子的控制下被表达。
如前所述，能特异地同EGFRvIII结合的scFv是通过筛选获得的。筛选可通过多种方法进行。在本发明的一种优选方法中，筛选可方便地通过表面表达有EGFRvIII的细胞进行。一种利用细胞实施筛选的操作规程将在下面的例子中列出。筛选还可在固体表面进行，该固体表面包被了EGFRvIII，并且噬菌体在适当的条件下在固体表面孵育合适的时间。为了方便，该表面也可是一个磁头。未结合的噬菌体被冲掉而结合了的噬菌体被洗脱得到。
找到具高亲和力的抗体取决于选择过程的效率和能够被筛选出的克隆数以及操作的严格性。典型地，较高的严格性与筛选的选择性相关。然而，如果条件过于苛刻，噬菌体不会结合。在一轮筛选后，与EGFRvIII包被的平板或在其表面表达EGFRvIII的细胞相连接的噬菌体在E.coli中进行扩增并接受下一轮的筛选。用此方法，3次筛选可产生多倍的产量。因此，即便每一轮的富集量较低，多次的筛选也可分离出那些稀有噬菌体及那些其中的遗传物质编码的scFv具有最高的亲合力，或者能在噬菌体内较好表达的噬菌体。
不管选择何种筛选方法，由噬菌体展示所提供的基因型和表型之间的自然联系可以实现对cDNA文库所有个体抗原结合能力的测试，甚至对大的克隆文库也可以实现。
B.抗体的结合力本发明的抗体与EGFRvIII的一个抗原决定簇结合，其Kd值至少比亲代抗体MR1低1nM。对靶抗原的结合力通常通过标准的抗体-抗原测定法进行测量，例如竞争测定、饱和测定、或象ELISA或RIA的免疫检测法。
这些检测法用于测定抗体的分离常数。术语“分离常数”是衡量抗原和抗体结合力的尺度。如果抗体的分离常数(Kd＝1/K，这里K是亲和常数)以微摩尔计，抗原和抗体的结合特异性是存在的，较好＜100nM，优选＜0.1nM。典型地，抗体分子具有较低的Kd值。Kd＝[Ab-Ag]/[Ab][Ag]，其中[Ab]是抗体的平衡浓度，[Ag]是抗原的平衡浓度，而[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的平衡浓度。典型地，抗原和抗体之间连接的交互作用包括可逆的非共价结合，比如静电吸引、范德华力和氢键。这种定义结合特异性的方法适用于对EGFRvIII具有特异性的单条重和/或轻链，CDR、融合蛋白或重和/或轻链的片段。
C.免疫测定法这些抗体可被多种已熟知的免疫结合测定法所检测和/或定量(例见美国专利编号4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。要回顾常用的免疫测定法，还可参见METHOD IN CELLBIOLOGY，Vol.37，Asai，ed.Academic Press，Inc.纽约(1993)；BASICAND CLINICAL IMMUNOLOGY 7THEdition，Stites & Terr，eds.(1991)。免疫结合测定法(或免疫测定法)典型地应用一个配体(例如，EGFRvIII)去结合并常常固定一个抗体。本发明涉及的在免疫测定法中所用的抗体已在前面进行了详尽的描述。
免疫测定法也经常利用一种标记物来同配体和抗体形成的结合物进行特异结合，从而对其进行标记。标记物可能本身就是组成抗体/被分析复合体(即，抗EGFRvIII抗体)的一部分。另一种情况是，标记物可以是第三部分，比如另外一种抗体，它可以特异性地同抗体/EGFRvIII蛋白复合物相结合。
一方面，在一种竞争测定法中，标记物一般是EGFRvIII的第二种抗体，它带有检测标记。两种抗体竞争地同被固定的EGFRvIII结合。在比较第一抗体和MR1对抗原的亲合力的实施例中，所指的二抗即MR1。另一方面，在非竞争测定法中，EGFRvIII抗体不带有检测标记，但一种对来自某个种属(如，鼠类)的抗EGFRvIII抗体具有特异性的二抗标记，它能同抗EGFRvIII抗体相结合。
其它能与免疫球蛋白恒定区进行特异结合的蛋白质，比如A蛋白或G蛋白也可被用作标记物。这些蛋白是葡萄球菌细胞壁的常见组成成分。它们对许多种属来源的免疫球蛋白恒定区都显示出了很强的非免疫性反应能力(例见Kronval等，J.Immunol.1111401-1406(1973)；以及Akerstrom等，J.Immunol.1352589-2542(1985))。
在这些检测法中，每一种试剂结合后都需要进行孵育和/或洗涤步骤。孵育可进行5秒左右至数小时，优选大约5分钟至大约24小时。然而，具体孵育时间要根据测定方法、抗体、溶液的量、浓度等条件确定。通常这些测定在室温下进行，尽管它们在一定的温度范围内都可进行，比如4℃至40℃。
尽管本发明中各种免疫测定的具体步骤根据所采用的具体方法而有所不同，但从一种含有EGFRvIII抗体的样品中测定EGFRvIII抗体的方法通常包含的步骤是，在免疫反应条件下，将样品同其特异性抗体相接触形成EGFRvIII/抗体复合物。V.免疫结合物的产生本发明中的抗EGFRvIII抗体可通过效应分子(EM)羧基端、氨基端、EM内部的一个氨基酸(如半胱氨酸)、或它们的组合同效应分子相连接。同样地，EM可直接同抗体的重链、轻链、Fc(恒定区)或骨架区相连接。连接可发生于抗体的氨基或羧基末端，或通过一个内部的氨基酸进行。如果PE或其一个细胞毒片段被用作EM，发生在羧基末端或靠近羧基末端的连接从某种意义上讲应该保持、或增加(如果连接发生在C末端)一个序列，它具有引导分子进入细胞内的信号序列的功能。合适的信号氨基酸序列在专业领域内被熟知，例如REDLK(PE本身的序列，用单个字母表示)、KDEL、RDEL、以及KDEL的重复序列。例见WO91/18099。进一步讲，多个EM分子(如，2至10个)可同一个抗EGFRvIII抗体结合，而多个抗体(如，2至5个)也可同一个EM分子相结合。在一个具体优选的实施例中，KDEL是C末端序列。由一个效应分子同一个抗体相结合形成的分子被称作一个免疫结合物。
一种治疗药物是对一个特殊靶分子或带有特殊靶分子的细胞具有特殊生物学活性的一种药物。专业人员应该知道，这些治疗药物可包括许多种，比如长春碱、柔红霉素一类、天然或经过改造的假单胞菌外毒素或白喉毒素一类的细胞毒素、包裹有药理作用成分的药物(如脂质体)、放射活性药物如125I、32P、14C、3H、35S及其它标记物、靶部分和配基。
挑选特定的治疗药物依赖于特定的的靶分子或细胞以及预期的生物效应。因此，如果想要致死某种特定的靶细胞，可选择一种细胞毒素作为治疗药物。相反地，若只想引起一种非致死性生物学反应，治疗药物可同一种非致死性药物、或包含非致死性药物的脂质体相结合。
利用这里提供的治疗药物和抗体，专业人员可很容易地构建多种包含功能等效核酸的克隆，例如那些序列上存在差别但编码同种EM或抗体的核酸。因此，本发明提供编码抗体及其结合物和融合蛋白的核酸。
A.重组方法本发明提供的核酸序列可用任何一种适合的方法进行制备，如相应序列的克隆技术或用直接化学合成技术，例如磷酸三酯法(Narang等，Meth.Enzymol.6890-99(1979))；磷酸二酯法(Brown等，Meth.Enzymol.68109-151(1979))；氨基磷酸二乙酯法(Beaucage等，Tetra.Lett.22(20)1859-1862(1981))；固相氨基磷酸三酯法(见于Beaucage & Caruthers，Tetra.Letts 22(20)1859-1862(1981)，比如利用其中描述的自动合成仪，见Needham-Vandevanter等，Nucl.Acids Res.126159-6168(1984))；以及编号4,458,066的美国专利中的固相支持法。化学合成产生一个单链寡核苷酸。通过同一个互补序列的杂交或以其为模板利用一种DNA多聚酶进行的聚合反应，该单链寡核苷酸可被转化成双链DNA。专业人员应意识到，虽然DNA的化学合成被限制为只能合成100个碱基左右的序列时，但是可通过较短序列的连接反应得到更长的序列。
在优选实施例中，本发明的核酸序列通过克隆技术制备。适合的克隆和排序技术的事例，以及通过许多克隆操作足以指导专业人员的技术指导可见于，Sambrook等，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL(2nd Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory(1989)、Berger and Kimmel(eds.)，GUIDE TO MOLECULARCLONING TECHNIQUES，Academic Press，Inc.，San Diego CA(1987)、或Ausubel等(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NY(1987)。生物制品和试验设备的生产厂家提供的产品介绍也可提供有用的信息。此类制造商包括SIGMA化学药品公司(Saint Louis，MO)、R&D系统(Minneapolis，MN)、LKB生物制药公司(Piscataway，NJ)、CLONTECH试验室有限公司(Palo Alto，CA)、Chem Genes公司、Aldrich化学药品公司(Milwaukee，WI)、Glen研究有限公司、GIBCOBRL生物技术有限公司(Gaithersberg，MD)、FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、Invitrogen(San Diego，CA)、以及PE应用生物体系(Foster City，CA)，还包括专业人员了解的其它供应商。
编码天然效应分子(EM)或抗EGFRvIII抗体的核酸可被修饰形成本发明中的EM、抗体、或免疫结合物。定点诱变修饰在专业领域是熟知的。编码EM或抗EGFRvIII抗体的核酸可通过体外技术进行扩增。扩增技术包括多聚酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的扩增系统(TAS)、以及可自我维持序列复制系统(3SR)。很多种克隆方法、宿主细胞、及体外扩增方法为专业人员所熟知。
在一优选实施例中，免疫结合物的制备是通过将编码抗EGFRvIII scFv抗体的cDNA插入到一个含有编码EM的cDNA的载体中。该插入使得scFv和EM被读入一个框架，即获得一条包括一个功能性scFv区和一个功能性EM区连续的多肽。在一个具体优选实施例中，编码一个白喉毒素片段的cDNA被连接到一个scFv上，从而毒素被置于此scFv的氨基末端。在一个最优选实施例中，编码PE或其细胞毒性片段的cDNA被连接到一个scFv上，从而毒素被置于该scFv的羧基末端。在优选实施例中，细胞毒性片段是PE38。
本发明中，编码一种EM、一种抗EGFRvIII抗体、或一种免疫复合物的核酸一旦被分离和克隆后，便会在一个经过重组改造的细胞(比如细菌、植物、酵母菌、昆虫以及哺乳动物细胞)中进行表达。专业领域人士应该对大量可用于蛋白表达的表达系统有足够的了解，其中包括E.coli、其它细菌宿主、酵母菌、以及多种诸如COS、CHO、Hela肿瘤细胞株和骨髓癌细胞系的高等真核细胞。已被熟知的多种原核和真核细胞内的蛋白表达技术将不再详细描述。简言之，本发明中编码分离蛋白的天然或人工合成核酸的表达的实现，典型地是通过将DNA或cDNA与同一个启动子(是组成性的或可诱导的)进行可实施的连接，之后并入一个表达框。这种盒适用于原核或真核细胞内的复制和整合。典型的表达框包括转录和翻译终端、启动序列和用来对编码蛋白的DNA的表达起调节作用的启动子。表达盒一般被方便地置于含有一个或多个抗生素抗性基因的质粒中。要得到一种克隆基因的高度表达，需要构建至少含有一个指导转录的强的启动子、一个用于翻译启动的核糖体结合位点以及一个转录/翻译终止子框。对于E.coli，这包括一个诸如T7、trp、lac、或λ的启动子、一个核糖体结合位点、优选地还包括一个转录末端信号。对于真核细胞，控制程序可包括一个启动子、优选一个来自免疫球蛋白基因、SV40或巨细胞病毒的增强子、以及一个多聚腺苷酸序列，还可能包括拼接供体和受体的序列。本发明的表达框可通过众所周知的方法(例如，用于E.coli的氯化钙转移或电穿孔法、用于哺乳类细胞的磷酸钙处理、电穿孔、或脂质体融合法)转移入所选择的宿主细胞。转入了表达框的细胞可通过对抗生素的抗药性而被选择，这些抗药性来自于表达框所包含的抗性基因，例如amp、kan、gpt、neo和hyg基因。在利用噬菌体进行工作时，优选卡那霉素和氨苄青霉素耐药基因。
专业人员可知对编码本发明中一种多肽(即抗EGFRvIII抗体、PE、或由它们结合而成的免疫结合物)的核酸可进行不影响其生物活性的修饰。一些修饰可促进克隆、表达、或靶分子整合入融合蛋白的过程。此类修饰为专业人员所熟知，例如包括，在氨基末端加上一个蛋氨酸来提供一个启动位点、或者在两个末端的任一个添加氨基酸(如，多聚组氨酸)来创建方便定位的限制位点或终止密码子或纯化序列。
除了重组方法之外，本发明中的免疫结合物、EM、和抗体的全部或一部分也可利用标准的肽合成技术来构建。本发明中长度短于50个氨基酸的多肽的固相合成的完成过程是，将序列的C端氨基酸附着于一种不溶的支持物上，之后对序列中剩余的氨基酸进行顺序添加。对固相合成技术的描述见于，Barany & Merrifield，THEPEPTIDESANALYSIS，SYNTHESIS，BIOLOGY.Vol.2SPECIAL METHODS INPEPTIDE SYNTHESIS，Part A.pp.3-284；Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.852149-2156(1963)，以及Stewart等，SOLID PHASE PEPTIDESYNTHESIS，2nded.，Pierce Chem.Co.，Rockford，I11.(1984)。较长的蛋白质可通过较短片段的氨基和羧基端之间的缩合作用来合成。通过活化一个羧基末端(例如，可利用耦合试剂N，N’-二环己基碳二甲胺)来形成肽键的方法已为专业人员所熟知。
B.纯化一旦被表达，本发明中的重组免疫结合物、抗体、和/或效应分子可通过专业上标准的程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀法、亲和柱层析法、离子交换和凝胶过滤柱法以及间歇层析法，等等(通常参见R.Scopes，PROTEIN PURIFICATION，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。一般对于药学应用来讲，纯化组分的同质性的在90％至95％较好，98％至99％或以上为优选。一经被纯化(部分地或期望的完全同质性)，若为治疗所用，这些肽应该基本上对内毒素没有反应。
从细菌中(如E.coli)将单链抗体表达和/或重折叠形成相应的活性形式(包括单链抗体)的方法已被描述并熟知，也适用于本发明中的抗体。参见，Buchner等，Anal.Biochem.205263-270(1992)；Pluckthun，Biotechnology 9545(1991)；Huse等，Science2461275(1989)以及Ward等，Nature 341544(1989)，在此均被引用。
通常，来自E.coli或其它细菌的功能性异种蛋白被从包涵体中分离并且需要用强的变性剂溶解，之后重折叠。在溶解的步骤中，专业领域众所周知，必须有一种还原剂来还原双硫键。一种典型的含有一种还原剂的缓冲液是0.1M Tris pH 8，6M胍，2mM EDTA，0.3M DTE(二硫赤藓糖醇)。双硫键的还原在有低分子量的还原和氧化形式的硫醇试剂存在时可以发生，描述见Saxena等，Biochemistry 95015-5021(1970)，此处结合作为参照，更为详尽的描述可见Buchner等，supra。
复性通常是通过用重折叠缓冲液稀释(例如，100倍)变性和还原了的蛋白质来完成。一种典型的缓冲液是0.1M Tris，pH8.0，0.5M左旋精氨酸，8mM氧化谷胱甘肽(GSSG)，以及2mM EDTA。
作为双链抗体纯化程序的改进，重链区和轻链区被分别被溶解和还原，之后在重折叠溶液中相结合。当两种蛋白按照一定的摩尔比混合在一起时，比如说一种蛋白的摩尔数不超过另一种蛋白摩尔数的5倍时，可以得到较高的产量。当氧化还原反应完成后，向重折叠溶液加入过氧化谷胱甘肽或其它低分子量氧化化合物是有必要的。VI.假单胞菌外毒素及其它毒素毒素可被用来同本发明的抗体一起形成免疫毒素。典型的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素以及它们的亚单位，还有肉毒毒素A至F。这些毒素很容易从商业途径购得(例如，Sigma化学药品公司，St.Louis，MO)。白喉毒素是从白喉棒状杆菌中分离的。蓖麻毒素是来自蓖麻(蓖麻子)的植物凝集素RCA60。此术语还包括这些物质的毒性突变体。例见编号为5,079,163和4,689,401的美国专利。蓖麻子(Ricinus communis)凝集素(RCA)有两种形式，由于其各自的分子量分别大约为65和120kD，它们分别被称为RCA60和RCA120(Nicholson & Blaustein，J.Biochim.Biophys.Acta266543(1972))。A链用于抑制蛋白合成和杀死细胞。B链将蓖麻毒素结合到细胞表面的半乳糖，从而促进A链向细胞质中的运输(Olsnes等，Nature 249627-631(1974)以及编号3,060,165的美国专利)。
相思豆毒素含有来自相思子(Abrus precatorius)的植物凝集素。这些毒素，植物凝集素a、b、c和d具有大约63至67kD的分子量，并且由通过双硫键相连接的A链和B链构成。A链抑制蛋白合成；B链(植物凝集素b)与D-半乳糖基结合(见Funatsu等，Agr.Biol.Chem.521095(1988)；以及Olsnes，Methods Enzymol.50330-335(1978))。
在本发明的优选实施例中，毒素为一种假单胞菌外毒素A(PE)。天然PE是一种非常活跃的单体蛋白(分子量66kD)，由绿脓假单胞菌分泌，可抑制真核细胞的蛋白合成。编号5,602,095的美国专利提供了天然PE序列，在此处被引用。其作用方式是通过ADP-核糖基化作用灭活延长因子2(EF-2)。外毒素含有共同引起细胞毒性的三个结构区。Ia区(氨基酸1-252)介导细胞结合。II区(氨基酸253-364)负责向细胞质内的转移，III区(氨基酸400-613)介导延长因子2(EF-2)的ADP核糖基化。Ib区(氨基酸365-399)的功能尚不明确，尽管已知其中的大部分(氨基酸365-380)删除后并不会导致细胞毒性的减低。
这里提到的术语“假单胞菌外毒素”指的是，PE的天然序列、天然序列的细胞毒性片段、经保守修饰的天然PE的突变体及其细胞毒性片段。在优选实施例中，PE分子通过去除Ia区进行修饰，来减少或消除毒素的非特异性结合。PE的细胞毒性片段包括那些在靶细胞中经过或无需经过后续的蛋白分解或其它过程而具有细胞毒性的片段(如，作为一种蛋白质或蛋白前体)。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。PE40是PE的一种截短形式的衍生物，在以往的专业文献已被描述。例见，Pai等，Proc.Nat’l Acad.Scad.Sci.USA 883358-62(1991)以及Kondo等，J.Biol.Chem.2639470-9475(1988)。PE35是PE的一个35kD的羧基端片段，由PE蛋白第280位的蛋氨酸和其后的第281-364及381-613的氨基酸组成。PE38是一个由PE的281-364和381-613位的氨基酸组成的截短形式的PE蛋白前体。PE38通过在细胞内的处理被活化为其细胞毒性形式(参见编号5,608,039美国专利，此处结合作为参考文献)。
在特别优选的实施例中，PE38是本发明中的免疫毒素的毒性部分。然而，细胞毒性片段PE35和PE40也可被采用；这些片段在编号5,602,095和4,892,827的美国专利中被披露，此处均被引用。对基于MR1的免疫毒素的研究表明，KDEL是C末端序列的一个优选修饰(见Lorimer等，Proc Natl Acad Sci USA 9314815-14820 at14818(1996))。
A.PE的保守修饰突变体PE的保守修饰的突变体或其细胞毒性片段在氨基酸水平上与相应PE相比(如PE38)，至少有80％的序列相似性，较好为至少85％，超过90％更好，优选为95％以上。
术语“保守修饰的突变体”用于氨基酸和核酸序列。对特定的核酸序列来说，保守修饰的突变体是指编码一致或基本一致的氨基酸序列的核酸，若此核酸不编码某个氨基酸序列，则指基本一致的核酸序列。由于遗传密码的简并性，许多功能一致的核酸可编码一种给定的多肽。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码丙氨酸。因此，在任何一个编码丙氨酸的位置上，密码子可被其它相应的密码子替代而不改变所编码的多肽。这样的核酸突变体为“沉默突变体”，是保守突变的一种。这里提到的每个编码一种多肽的核酸序列也包括任何可能的此核酸的沉默突变体。熟练的专业人员会意识到在一个核酸中的每个密码子(除AUG外，它是唯一编码蛋氨酸的密码子，还有UGG，它是色氨酸唯一的密码子)均可被修饰而得到一个功能一致的分子。因此，每个编码一种多肽的核酸的沉默突变体均被所描述的序列所包含。
至于氨基酸序列，专业人员可知，编码序列中能改变、增加或删除单个或小部分氨基酸的一种核酸、肽、多肽、或蛋白序列的单一的替换、缺失或增加是一个“保守修饰突变”，可导致一个化学性质类似的氨基酸的替换。
B.PE的细胞毒性测定本发明用到的假单胞菌外毒素可通过专业人员熟知的测定法对其细胞毒性水平进行测定。例如，常利用假单胞菌外毒素对蛋白合成的抑制程度作为细胞毒性测定的替代尺度。例见，Lorimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314815-14820(1996)at 14818。可以方便地通过测定正常状态下不表达EGFRvIII但已经被EGFRvIII cDNA转染的细胞对一种带有放射标记的氨基酸(参考Prior等，Cell641017-1023(1991))的摄取来进行。在下面的例子中，对氚标记的亮氨酸的摄取在NR6M细胞(瑞士3T3细胞，不表达鼠EGFR并被人EGFRvIII cDNA所转染)中被测量。如此以来，PE的毒性片段及其保守修饰突变体可以很容易地进行细胞毒性测定。
大量候选的PE分子的细胞毒性可通过专业领域中熟知的方法同时进行检测。例如，候选分子亚群的细胞毒性可被测定。候选分子的阳性反应亚群可被进一步分类并进行再检测，直到理想的细胞毒片段被鉴定。这样的方法可对大量的PE细胞毒性片段或保守突变体进行快速筛选。
C.其它治疗部分本发明中的抗体也可被用于使具有不同诊断或治疗作用的化合物同表面表达有EGFRvIII的细胞相结合。因此，本发明中的一种抗体，例如抗EGFRvIII scFv，可被直接或通过一个接头连接到一种将被递送到带有EGFRvIII的细胞的药物上。治疗药物包括这样一些化合物，例如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸或其衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂类、碳水化合物、或重组的病毒。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、单链或双链DNA进行共价交联所衍生的寡核苷酸、和三股螺旋寡核苷酸。
另外，连接一个抗EGFRvIII抗体的分子可以是一个包裹系统，比如，一个脂质体或分子团，它包含的一种治疗组分(例如一种药物、一个核酸(比如反义核酸)、或另一种治疗部分)被很好地保护，避免向循环系统的直接暴露。制备连接于抗体的脂质体的方法已被熟练的专业人员所熟知。例见，编号4,957,735的美国专利；以及Connor等，Pharm.Ther.28341-365(1985)。
D.可检测标记物本发明中的抗体可随意共价或非共价地同一个可检测标记物连接。适用的可检测标记物包括可被光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法所检测的任何组分。本发明中有益的标记物包括磁珠(如DYNABEADS)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明、绿荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶类(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、及其它在ELISA中常用的酶)、以及诸如胶体金和有色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠的比色标记物。
检测这些标记物的方法已为专业人员所熟知。因此，例如，放射性标记物可用胶卷或闪烁计数器所检测，荧光标记物则通过可检测所发射光线的光检测器进行检测。酶标记物典型地是通过向酶提供底物并检测酶和底物的反应产物的方法进行检测，显色标记物是通过简单观察显色标记物的方法检测。
E.同抗体的结合在本发明的一个非重组实施例中，效应分子(例如治疗、诊断或检测部分)通过专业人员所熟知的多种方式被连接到本发明的抗EGFRvIII抗体上。共价及非共价的连接方式均可被用于本发明的抗EGFRvIII抗体。
将一个效应分子与一个抗体分子连接的过程依据该EM的化学结构而有所变化。多肽通常包含多种官能团，例如羧酸(COOH)、自由胺(-NH2)或硫氢基(-SH)，它们被用在同抗体的反应中，从而导致效应分子的连接。
可选择地，抗体可被衍生以暴露或附着另外的活性功能基。衍生作用可附加一系列连接分子中的一个分子(比如那些可购自Pierce化学药品公司、Rockford Illinois的连接分子)。
此处用到的“连接子”，是指一个用来连接抗体和效应分子的分子。连接分子能同抗体以及效应分子形成共价键。合适的连接子为专业人员熟知，包括但不限于，直链或支链碳连接分子、杂环碳连接分子、或肽连接分子。在抗体和效应分子为多肽的情况下，连接子可通过侧向基团(如，对半胱氨酸通过一个双硫键)连接到组分氨基酸。然而，在一个优选实施例中，连接子分别同末端氨基酸的α碳氨基和羧基相结合。
在一些情况下，当免疫结合物到达其靶位点时，希望从抗体中释放效应分子。因此，在这些情况下，免疫结合物应含有在邻近靶位点处可以裂开的连接。从抗体中释放效应分子的连接分子分裂可被酶活性或免疫复合物所处的靶细胞内部或邻近目标位点处的条件所触发。当目标位点是一个肿瘤，可采用会在肿瘤部位的环境中裂开(例如，当暴露于肿瘤相关的酶或酸性条件时)的连接子。
由于有大量的被报告的将各种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、药品、毒素、以及其它药物同抗体相附着的方法，专业技术人员将能够确定一种适合的方法来使给定药物附着于抗体或其它的多肽。VII.药学成分及给药本发明中的抗体和/或免疫结合物成分(即，PE同一种抗体相连接，该抗体对EGFRvIII的一个抗原决定簇的Kd比MR1至少低1nM)，颅内给药是有效。最近关于颅部肿瘤的免疫毒素治疗的综述见Oldfield，E.，and Youle，R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.23497-114(1998)。小的多肽可穿越血脑屏障。向脑中施入那些不能穿越血脑屏障的长的多肽的方法已被熟知。例如，蛋白质、多肽、其它化合物和细胞可通过脑室内(ICV)注射或通过一个插管被输入哺乳类的脑部(例见，Motta & Martini，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.16862-64(1981)；Peterson等，Biochem.Pharamacol.312807-2810(1982)；Rzepczynski等，Metab.Brain Dis.3211-216(1988)；Leibowitz等，Brain Res.Bull.21905-912(1988)；Sramka等，Stereotact.Funct.Neurosurg.5879-83(1992)；Peng等，Brain Res.63257-67(1993)；Chem等，Exp.Neurol.12572-81(1994)；Nikkhah等，Neuroscience 6357-72(1994)；Anderson等，J.Comp.Neurol.357296-317(1995)；以及Brecknell & Fawcett，Exp.Neurol.138338-344(1996))。
因此，例如胶质母细胞瘤，可以通过经插管或注射器对肿瘤周围的组织进行定位给药，或是通常所采用的通过ICV进入到中枢神经系统腔隙中给药的方法进行治疗。另外，在有些情况下免疫结合物可全身给药，比如病人的胶质母细胞瘤破坏了上皮细胞足以使血脑屏障产生缺口。
本发明的抗体或免疫结合物还可通过局部或全身给药来治疗乳腺、卵巢以及肺肿瘤。例如，可通过直接的肿瘤内注射来治疗那些不适于外科手术切除的恶性肿瘤。这些肿瘤还可通过这些免疫结合物的胃肠道外给药来进行治疗，比如，定位并杀死任何转移性的细胞，它们尚未形成足够大小的可进行放射线或手术治疗或易被检测到的肿瘤。
施药的组分通常包括一种溶液，抗体和/或免疫结合物溶解于一种药学可接受的载体，水性载体为优选。许多种水性载体可被应用，如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常无不良物质。这些组分可通过常规的、众所周知的消毒技术进行消毒。这些组分可包括药学可接受的近似生理条件所需要的辅助物质，比如调节pH的缓冲剂、毒性调节剂等等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些组分中融合蛋白的浓度变化很大，主要根据与所选的特定给药方式和病人需要相一致的液体量、粘度、体重等等进行选择。
因此，本发明中的一个典型的向脑部给药的药学免疫毒素组分应该每天施入大约1.2至1200ug。一个典型的通过静脉给药治疗乳腺、卵巢以及肺肿瘤的组分，每个病人每天给入大约0.1至10mg。每人每天0.1至100mg的给药量可以使用，尤其当药物要施入一个隐蔽的位置，并且没有进入血液循环或淋巴系统时，例如施入一个体腔或一个器官的腔隙。制备可施药组分的实际操作方法为专业人员了解或掌握，在一些出版物中有详尽描述，例如Remington’sPHARMACEUTICAL SCIENCE，19thed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1995)。
本发明中的组分可用于治疗处理。在治疗应用中，组分被施入一名患有某种疾病(比如一个胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌以及肺癌)的病人，其剂量要足以至少能够减缓或部分控制该种疾病及其并发症。足以完成这些任务的剂量被称为“治疗有效剂量”。应用的有效剂量依赖于疾病的严重程度和病人的一般健康状况。该组分的有效剂量能够提供某种症状的主观可确认的缓解，抑或是被临床医师或其他有资格的观察者所记录的客观改善。
患者需要和耐受的剂量及频率决定是否单次或多次给药。无论如何，应当提供足够量该免疫毒素，以有效地治疗患者。优选地，药物剂量一次性给入，但也可能周期性地给入，直至达到某种治疗效果或不良反应阻止了治疗的继续。通常，这些剂量足以治疗或改善疾病的症状而不引起病人不能耐受的毒性。
本发明的免疫结合物可制备成胃肠外缓释剂型(如植入物、油注射液、或微粒子系统)。对蛋白递送系统的全面了解可参见Banga，A.J.，THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINSFORMULATION，PROCESSING，AND DELIVERY SYSTEMS，Technomic Publishing Company，Inc.，Lancaster，PA，(1995)。微粒子系统包括微球体、微粒、微胶囊、纳米微胶囊、纳米微球体、以及纳米微粒。微胶囊以疗效蛋白作为一个核心。在小球体中，治疗性物质分散于粒子中。小于大约1μm的粒子、微球体、以及微胶囊通常分别被称为纳米微粒、纳米球体、和纳米微胶囊。毛细血管的直径大约为5μm，所以只有纳米微粒可经静脉给药。微粒子的直径大约为100μm，通过皮下或肌肉注射给药。例见，Kreuter，J.，COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS，J.Kreuter，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，pp.219-342(1994)；以及Tice& Tabibi，TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY，A.Kydonieus，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，pp.315-339，(1992)，二者在此均被引用。
多聚体可被用于本发明中的免疫结合物组分的离子控制释放。多种可用以药物控制释放的可降解和不可降解的多聚体系在专业领域众所周知(Langer，R.，Accounts Chem.Res.26537-542(1993))。例如，阻滞多聚体polaxamer 407在低温下是粘性但可流动的，但在体温下形成半固体凝胶。它被证明是重组白细胞介素-2和尿素酶的形成和持续输送的一个有效载体(Johnston等，Pharm.Res.9425-434(1992)；及Pec等，J.Parent.Sci.Tech.44(2)58-65(1990))。同样地，羟基磷灰石也已被用作蛋白控制释放的一个微载体(Ijntema等，Int.J.Pharm.112215-224(1994))。然而另一方面，脂质体被用于脂类包被的药物的控制释放和靶向运输过程(Betageri等，LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。许多其它的治疗蛋白控制释放系统已被了解。例见，美国专利，编号5,055,303，5,188,837，4,235,871，4,501,728，4,837,028，4,957,735和5,019,369，5,055,303；5,514,670；5,413,797；5,268,164；5,004,697；4,902,505；5,506,206，5,271,961；5,254,342以及5,534,496，其中任何一个都在此被引用。
本发明的免疫毒素可治疗特异性表达EGFRvIII的人类细胞所导致的疾病，免疫结合物的毒性作用可消除该疾病状态。此免疫结合物的一种优选的应用是治疗表达EGFRvIII的恶性肿瘤细胞。可作为例证的恶性肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、和肺癌细胞。VIII.诊断试剂盒和体外应用在另一实施例中，本发明提供了用于检测一个生物样品中EGFRvIII的试剂盒。这里提到的一个“生物样品”是指含有EGFRvIII的生物组织或体液的样品。这类的样品包括但不仅限于，来自活检、痰液、羊水、血液、及血细胞(例，白细胞)的组织。液体样品可以但在此通常不优选使用，因为在这类样品中的EGFRvIII浓度极少达到可检测水平。生物样品也包括组织切片，如组织学用到的冰冻切片。一个生物样品典型地来自一个多细胞真核生物，优选地来自一个哺乳类动物比如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠、或兔子，更好是一个灵长类动物比如猕猴和黑猩猩。最为优选地，来自人类。
试剂盒典型地包括本发明中的一种抗EGFRvIII scFv，它与MR1 scFv相比，对EGFRvIII具有更强的亲合力。
此外，这种试剂盒通常包括讲解本发明的一种抗体的使用方法的指导材料(例，检测一个样品中含EGFRvIII细胞的方法)。这种试剂盒还包括附加成分，用以帮助完成该试剂盒所具的特殊用途。因此，例如，此试剂盒可能包含测定标记物的方法(例，用于酶标记物的酶底物、用于检测荧光标记物的滤光装置、适合的二次标记物比如羊抗鼠HRP，等等)。此试剂盒还包括缓冲液和其它在某种特定方法中常规用到的试剂。类似的试剂盒和相应的内容物为专业人员所熟知。
在本发明的一个实施例中，诊断试剂盒包括一种免疫检测法。如上所描述，尽管本发明的免疫检测法的细节根据特定的具体形式而有所变化，从一个生物样品中检测EG FRvIII的方法通常包括的步骤是，将生物样品与一种能在免疫反应条件下与EGFRvIII发生特异性反应的抗体相接触，此抗体对EGFRvIII具有比MR1scFv更强的亲合力。此种抗体在免疫反应条件下同EGFRvIII相结合，可直接或间接检测结合了的抗体。
鉴于通过本发明所述方法制造的抗体和指定的MR1-1scFv具有提高了的亲合力，这里提供的抗体尤其可以作为诊断试剂和用于体外检测中来检测生物样品中的EGFRvIII的存在。例如，MR1-1及其它通过此处所教导的方法制造的抗体，可在免疫组织化学测定法中用作免疫结合物的靶部分，来检测样品中是否含有EGFRvIII表达细胞。如果样品来自一个病人的正常情况下不表达EGFRvIII的组织，EGFRvIII的发现可显示此病人患有以EGFRvIII表达细胞的出现为特征的癌症，或者对此种癌症的治疗还没有成功地根除。专业人员也会了解，本发明的抗EGFRvIII抗体与一个适合的标记物相偶联，可用于体内检测EGFRvIII表达细胞的存在，从而显示此病人患有以EGFRvIII表达细胞的出现为特征的癌症，或者对此种癌症的治疗还没有成功地根除癌症。
在第一步PCR中，50pg噬菌粒pCANTAB 5 E-MR1在三个彼此独立的反应中被用作模板，利用20pmol DNA寡聚引物S1连同20pmol的DNA寡聚引物CDR3Hb、CDR3Hd或CDR3Hf作为引物。模板和寡聚引物用2个Ready-To-Go PCR Bead(Pharmacia)混合成50μl溶液，再用以下流程进行循环95℃5分钟进行1个周期，之后94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟进行30个周期。这些反应产生407bp的产物，其中包括突变体。第一步反应的产物接下来连同引物AMBN在三个独立的反应体系中被用作引物，用MR1噬菌粒为模板。在这些反应中，1ul第一步反应的产物连同20pmol DNA寡聚引物AMBN被使用，以50pg噬菌粒pCANTAB作为模板。这些引物和模板用2个PCR Bead混合成50ul，并用上述流程进行循环。这些PCR产物用限制性酶SfiI和NotI进行酶切并被纯化。150ng纯化的PCR产物被连接至250ng的噬菌体呈示载体DNApCANTAB5E(Pharmacia提供，已被预先降解)。连接反应混合物被除去盐分，每个反应中有40ng连接物被用于转化E.coliTG1。每个转化可生成大约1.5×106个克隆。之后噬菌体库被从转化细菌中提取出来。来自每个转化的细胞生长于含有2％葡萄糖的10ml 2×YT(16g bacto-胰蛋白胨，10g bacto-酵母菌提取物，5gNaCl于每升水中)中，温度37℃，摇床速率250RPM。一小时后，氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)和1×1010噬斑形成单位(pfu)的M13KO7辅助噬菌体被加入。培养物生长1个小时，被沉淀，然后重悬于加有氨苄青霉素(100ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的10ml 2×YT中生长16小时，温度37℃，摇床速率250RPM。这些细菌经离心被沉淀，采用Sorval SS34离心机，8000RPM离心20分钟。含有噬菌体的上清液用0.45微米注射过滤器进行过滤。之后这些噬菌体通过加入2ml PEG，NaCl(20％PEG8000于2.5M NaCl中，w/v)被沉淀，继而在冰中孵育30分钟。这些沉淀了的噬菌体用Sorvall SS34离心机进行离心，条件是10 KRPM 20分钟，之后转移入1ml NTE(100mM NaCl，10nM TRIS pH7.5，1mM EDTA)。所得噬菌体库被测定效价并保存于4℃。
筛选VHCDR3库。生长于含有10％胎牛血清加750ug/ml G418的DMEM中的NR6M细胞用0.02％EDTA(Sigma#E-8008)进行收集。2×107的细胞被沉淀并转移入10ml冷冻抑制缓冲液(2％BSA，0.02％NaN3于DPBS中)中并在4℃缓慢旋转1小时。这些细胞被沉淀并传入5ml冷冻抑制缓冲液中。1×109个来自各个重链CDR3库的噬菌体被加入细胞悬液，混合物在4℃缓慢旋转2小时。这些细胞用10ml冷冻抑制缓冲液冲洗两次并转入5ml冷冻抑制缓冲液中。MR1dsFvPE38(终浓度2uM)作为一种竞争性抑制物被加入，细胞悬液在4℃缓慢旋转2小时。这些细胞用10ml冷冻抑制缓冲液冲洗三次。附着噬菌体的洗脱是通过向1.5ml 50mM冰盐酸中转入冲洗过的细胞，并在冰中孵育10分钟来实现的。NR6M细胞被沉淀，被洗脱的噬菌体被转移至一个盛有200μl 1M Tris pH8.0的新管中。被洗脱的噬菌体被测定效价，来确定捕获噬菌体的数量。然后0.5ml被洗脱的噬菌体通过重感染E.coli进行扩增并用于下一轮筛选。
构建VL突变库。在轻链CDR3热点区随机化的两步PCR中，模板采用重链CDR3突变体(S98P-T99Y)。在第一次反应中，采用50pg含有重链突变的噬菌粒(S98P-T99Y)同20pmol DNA寡聚分子VLMUT(5’-GATTACTACTGTTTGCAANNSNNSAACGTGCCT CTTACA-3’)以及AMBN混合成50μl体积的溶液。混合物用同产生重链CDR3库同样的流程进行循环。反应产生150个碱基对的产物，其中包括轻链CDR3热点区的随机化产物。提纯后，1μl第一次反应的产物连同20pmol低聚体S1被用于第二次PCR，利用50pg含有重链突变(S98P-T99Y)的噬菌粒DNA作为模板。模板和引物用2PCRBead混合成50μl，再用以上流程进行循环。反应生成一个876个碱基对的文库，其中含有VHCDR3突变(S98P-T99Y)以及CDR3L热点区的随机化。这些PCR产物用限制性酶SfiI和NotI进行酶切、提纯并与pCANTAB5E载体进行连接，如同重链CDR3库。连接物被除去盐分，并且反应产物的1/10(40ng)被用来转化E.coli TG1。此噬菌体库包含个3×105克隆被提取，如同重链CDR3构建中所描述。其中的四分之一被增殖并用于第一轮筛选。
筛选VLCDR3库。采用VHCDR3筛选流程中同样的方法收集NR6M细胞。所有步骤及冲洗都在冷冻抑制液中进行，除非另外注明。将5×106个细胞转入在1ml冷冻抑制液中并旋转1小时。细胞被沉淀并转入新的培养液，加入被提取的噬菌体库，悬液在4℃缓慢旋转2小时。这些细胞被冲洗三次，转入2pM MR1重链突变体(S98P-T99Y)scFv-PE的冷冻抑制液中，并在4℃缓慢旋转2小时。这些细胞被冲洗三次，附着噬菌体按照构建重链CDR3库的方法被洗脱和中和。洗脱的噬菌体被测定效价并提取，准备进入下轮筛选。
噬菌体提取。每轮筛选捕获的噬菌体均被扩增并用于下一轮筛选。为了提取，E.coli TG1生长于含有2％葡萄糖的10ml 2×YT中，在37℃、250RPM条件下孵育。当OD600到达0.3时，0.5ml收集到的噬菌体被加入培养液，孵育继续进行。一小时后，氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)和1×1010pfu的M13KO7辅助噬菌体被加入并继续孵育一小时。之后培养液被离心，沉淀了的细菌转入加有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的10ml新鲜2×YT培养基中，并在37℃、250RPM条件下孵育16小时。细菌用一台Sorvall SS34离心机在8K RPM、20分钟条件下离心沉淀。含有噬菌体的上清液用0.45微米注射过滤器进行过滤。之后这些噬菌体通过加入2ml PEG/NaCl(20％PEG8000于2.5M NaCl中，w/v)被沉淀，并在冰上孵育30分钟。这些沉淀了的噬菌体用Sorvall SS34离心机进行离心，条件是10K RPM 20分钟，之后再次转入1ml NTE(100mM NaCl，10mM TRIS 1mM EDTA pH7.4)中。所提取的噬菌体库被测定效价并保存于4℃。
阳性克隆的检测。三轮筛选后，运用ELISA法，对来自重链CDR3库的48个克隆同EGFRvIII多肽(LEEKKGNYVVTDHSGGK-biotin)的结合进行了分析。对22个显示最强信号的克隆进行DNA测序和进一步分析。四轮筛选后，48个克隆进行了ELISA分析，其中表现出最强信号的10个克隆进行了DNA测序。对于轻链库，两轮筛选后，48个克隆进行了ELISA分析，其中表现出最强信号的17个克隆被测序。三轮后，20个克隆被进行分析而表现出最强信号的10个克隆进行了DNA测序。为从个别克隆中提取噬菌体，单个克隆从最后筛选的测定效价盘中被选出，并接种至含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的150μl 2×YT的96孔板中。96孔板在37℃、150RPM下进行孵育。3小时后，20μl此培养液被转移至含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素加上1×108M13KO7辅助噬菌体的100μl2×YT的新的96孔板的孔中，孵育2小时。培养液被沉淀并转入加有氨苄青霉素和卡那霉素的新鲜的2×YT，生长16小时。细胞被沉淀而50至100μl的含有噬菌体的上清液被进行ELISA分析。除100μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(BM蓝，Boehringer Mannheim)被用作检测底物之外，噬菌体ELISA的进行参照以往的描述(Lorimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314815-14820(1996))。蓝/绿色出现后，加入100μl 2MH2SO4来终止显色反应。在450nM下进行吸光度测量。
DNA测序。DNA测序是利用一个适于PE Applied Biosystems(Foster City，CA)提供的试剂盒(Rhodamine Terminator CycleSequencing Kit)来进行。样品在PE Applied Biosystems的310型自动测序仪中进行测序和分析。
ScFv免疫毒素质粒的构建、表达和纯化。来自被挑选出来的噬菌粒克隆的scFvs利用引入NdeI和HindIII限制性位点的引物进行PCR扩增。产物被酶切并克隆入一个基于T7的表达载体，在载体中scFv已事先融合入一个截短形式的假单胞菌外毒素A。该质粒被转入表达宿主BL21(λDE3)。MR1突变免疫毒素按照以前描述的方法(Buchner等，Anal.Biochem.205263-270(1992))进行表达和制备。
表面等离子体共振。利用一个BIAcore生物传感器(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)对结合过程动力学进行测量。抗生蛋白链菌素通过BIAcore提供的胺连接试剂附着于CMS研究分级传感芯片。生物素标记的EGFRvIII多肽通过在芯片上注入10μl10nM的多肽溶液而与抗生蛋白链菌素结合。免疫毒素在hepes缓冲盐溶液(HBS)中稀释至25μg/ml。以10μl/min的速度向芯片表面注入50μl稀释了的免疫毒素，之后使附着物质在5分钟或更长时间内进行分离，在此过程中速率被连续测量。保留的附着物通过注入5μl100mM磷酸的方法从EGFRvIII多肽上去除。用软件BIAevaluation2.1分析该过程结合动力学。
细胞培养和细胞毒性检测。NR6M细胞被培养于含有10％小牛血清和750μg/ml G418的DMEM中。细胞毒性检测法测量[3H]-亮氨酸的抑制作用，引用以前的描述(Prior等，Cell 641017-1023，1991)。
细菌和细胞系。E.coli TG1；K12Δ(lac-pro)，supE，thi，hsdΔ5/F’[traD 36，proAB，lacIq，lacZΔM15]。E.coli BL21(λDE3)；带有DE3的F-ompT[lon]hsdSB(rB-mB-；一个E.coliB菌株)，一个带有T7 RNA多聚酶基因的λ前噬菌体。NR6是一个瑞士3T3成纤维母细胞突变细胞系，不带有EDFR。NR6M是NR6细胞系在β-肌动蛋白启动子控制下，用突变EGFRvIII受体cDNA进行转染形成的。NR6M和NR6的来源已被描述(Lorimer等，Clin.Cancer Res.1859-864(1995))。实施例3构建VHCDR3库。为增加MR1(Fv)的亲合力以及相应免疫毒素MR1(Fv)-PE38的活性，我们将VHCDR3和VHCDR3进行突变，因为抗体的这些部分与抗原有明显的接触(MacCallum等，J.Mol.Biol.262732-745(1996))。VHCDR3的11个氨基酸的前9个在表5被列出(最后2个，D101和Y102因被认为不参与抗原结合而被去除)。因为一个包含所有这9个氨基酸随机重排的完整的文库需要多于5×1011种克隆，我们制备了分别包含95-97、98-100和101A-101C位氨基酸的三个不同的文库来替代，如实施例1中所述。文库H-CDR3 95-97中包含1.6×106种克隆，文库H-CDR3 98-100包含4×105种克隆，而文库H-CDR3 100A-100C包含1×106种克隆。为了验证文库的正确性，每个文库中的5个克隆被测序。正如所期望的，每个克隆在所要突变的区域都有不同的氨基酸组合形式。因为一个完全随机排列3个氨基酸的文库只需要8×103种不同的克隆，这些文库的大小确定了所有可能的DNA序列均被包括。
筛选VHCDR3库及所选克隆的分析。因为一种改进了的MR1突变体的最终的计划用途是将一种毒素靶向EGFRvIII阳性的癌细胞，因此我们利用EGFRvIII阳性的NR6M细胞进行筛选。筛选过程中用到免疫毒素MR1(Fv)-PE，希望其作为从库中选择出来的野生型MR1 Fv的竞争者。来自每个文库的噬菌体都被提取，每个文库中都有相同数量的噬菌体(1×109)被用于第一轮筛选。洗脱的噬菌体被测定效价并进入下一轮筛选。接下来的筛选不需要确定提取出的噬菌体效价直至筛选开始。这样做是为了节省时间，并减少在进行测定效价的24小时中可能丢失的不稳定结合物的量。典型的提取产量为1×1012cfu/ml。表3总结了在4轮筛选中每轮的噬菌体捕获量。富集在第三轮达到高峰，在第四轮有所下降。
我们初始检测了四轮筛选后选出的噬菌体。48种克隆株通过一种噬菌体ELISA法对结合力进行检测，其中具有最强信号的克隆株中的10种被进行DNA测序。如表6所示，所发现的仅有的突变存在于98和99位。DNA测序分析显示这些克隆株分属5个不同的组亲代S98-T99；以及突变体P98-N99、P98-Y99、P98-F99和P98-W99。我们还检测了三轮过后筛选出的噬菌体，来观察在三、四轮之间是否存在好的结合物的丢失。我们通过ELISA法检测了一种噬菌体对48个独立克隆株的结合力，并对其中具有最强信号的22种克隆株进行DNA测序。又一次发现仅有的突变存在于98和99位。多种氨基酸在这两个位置上出现。出现频率最高的是S98-T99(野生型)，其次是P98-S99、P98-Y99、P98-N99和A98-D99。第四轮筛选导致了P98-N99和P98-Y99两种克隆株的富集高于野生型(S98-T99)，引起了几种克隆株的丢失，但也产生了一个包含P98-F99的新的克隆株。
VHCDR3突变体的细胞毒性和亲合力。从MR1 VHCDR3库中筛选出的12个突变体中的每一个都可用于制备免疫毒素。每个免疫毒素通过PCR扩增来自噬菌体呈示载体的Fv和亚克隆它们进入免疫毒素表达载体的方式构建。所有这些免疫毒素(除了一种在VHCDR3存在A98-D99突变的类型)可被高度纯化至具有高于90-95％的同质性。纯化了的免疫毒素被用于在NR6M细胞上确定它们的细胞毒性。使用Biacore方法，通过多肽固定于一个芯片上(或者EDFR细胞外区的一个突变形式附着于一个芯片上)测定结合亲和力。表6为其中的一个试验的结果；与具有8.0ng/ml IC50的亲代克隆株(S98-T99)相比，有6种克隆株具有更强的细胞毒性。它们是具有3.5ng/ml IC50的P98-Y99及其后的具有4.5ng/mlIC50的P98-N99、P98-W99和P98-I99、具有6ng/ml IC50的P98-F99以及具有6.5ng/ml IC50的P98-V99。四种克隆株，P98-S99、W98-F99、S98-W99和P98-T99具有与亲代克隆株一致的IC50。
构建VLCDR3库。所有从VHCDR3库中筛选出的突变均位于98和99位。这两个氨基酸残基的DNA序列构成一个热点，它是一个抗体在体内亲合力成熟的过程中历经突变的区域。来自VH文库的具有最强细胞毒性的突变体被使用并经历了仅在VLCDR3热点区发生的诱导突变。VLCDR3的序列在表3中被列出。此文库引入了编码91和92位氨基酸残基的热点区的随机化。VLCDR3噬菌体库的构建在实施例1中描述，包含3×105个克隆株。因为一个只含有400个克隆株文库便可以得到在这两个突变选择位点上所有可能的氨基酸组合，所以可以确定所有可能的DNA序列在这个文库中都有充足的含量。
筛选VLCDR3库及所选克隆的分析。表3列出在三轮筛选中，每轮捕获的噬菌体数量。对这个文库来说，第二轮比第三轮筛选得到了更高的富集量。在第二轮筛选后，提取48个不同的克隆株，用ELISA法检测同多肽的结合，对信号最强的17个克隆进行DNA测序。如表7所示，得到了5种突变体。所有的突变体保留了野生型在91位上的丝氨酸而在92位产生突变。发生频率最高的是F92W(6/17)，随后是F92R(3/17)、F92S(2/17)、F92L(1/17)以及F92M(1/17)。在17个被分析的克隆中，4个为亲代克隆。
第三轮之后分离出的克隆的特性也被进行分析(表7)。随机挑选出20个克隆，噬菌体被提取并用ELISA法检测同多肽的结合。显示最强信号的10个克隆进行了DNA测序。DNA序列显示存在3种不同的克隆株，所有这些克隆在第三轮中都具有代表性。除了一个亲代克隆外，分别为F92S(7/10)、F92W(1/10)、以及F92R(1/10)。没有发现新的突变体，并且没发现F92L和F92M突变体。
VLCDR3突变体的细胞毒性和结合特性。各种不同的Fvs用于制备免疫毒素，并检测了纯化重组蛋白的细胞毒活性和结合亲合力。只有一种突变体F92W得到了与亲代抗体相比活性更强的免疫毒素。它的IC50为1.3ng/ml，而亲代抗体为3.5ng/ml(表7)。其它突变体具有较低活性。表7中的数据还显示F92W同亲代克隆F92(Kd6nM)相比具有较强的亲合力(Kd3nM)。另一种突变体F92L，具有稍微增强的亲合力(Kd4nM)，但其细胞毒性没有增加。图2是一个显示结合特性的BIACore传感图，它比较了亲代克隆和能制造最具活性的免疫毒素的来自VHCDR3文库中的Fv(VHS98P-T99Y)以及来自VLCDR3文库的最为活跃的克隆(VHS98P-T99Y-VLF92W)，后者称之为MR1-1。该图显示这两种突变体与亲代Fv相比具有较慢的分离速率。对同时包含VH和VL突变体的免疫毒素(MR1-1-(Fv)-PE38)的分析显示，它具有降低了的koff以及轻度降低的kon，导致了其Kd为3nM。
表4显示了两个试验，它们对MR1(Fv)-PE38同两种改良的突变体MR(Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38及MR1-1(Fv)-PE38的细胞毒性进行了对比。两个试验均显示MR1(Fv)-PE38活性最弱而MR1-1(Fv)-PE38最强。实施例4免疫毒素的产量。提纯过程中观察到，不同突变体的免疫毒素产量有明显的提高。重折叠之后，蛋白被透析并通过层析进行提纯(Buchner等，Anal.Biochem.205263-270(1992))。这些蛋白首先在Q-琼脂糖阴离子交换树脂上进行批量提纯，除去粗大的蛋白质聚集物、核酸和其它杂质。接下来这些被提取的蛋白质被加载于MonoQ柱内，通过0-0.3M的NaCl连续梯度洗脱。这个步骤去除了小的聚集物。适当折叠的单体免疫毒素在具特征性的280mM NaCl的条件下，从MonoQ中提取。从MonoQ中收集的成分的纯度的确认是通过从TSK G3000SW尺寸分离柱观察到单个的单体峰和SDS-PAGE来实现的。每种MR1(Fv)-PE38突变体免疫毒素的产量通过从MonoQ峰部分收集到的蛋白质量和在依尺寸分离色谱柱中(TSK 3000)出现的单峰来进行计算。表6和表7显示100mg包涵体蛋白经过提纯后的产量。显然免疫毒素的产量在很大程度上受CDR突变的影响，其产量从亲代MR1(Fv)-PE38的2％提高到许多突变体的10-17.5％。实施例5通过放置于小鼠前囟之前1mm和旁侧4mm位置的导管注入105个U87MG.ΔEGFRvIII细胞(一种人胶质母细胞瘤细胞系，经EGFRvIII转染U87MG而形成，见Nishikawa等，Proc Natl Acad Sci(USA)917727-7730(1994))，诱发无胸腺小鼠EGFRvIII颅内肿瘤。通过经导管直接向肿瘤内注射MR1-1-PE38免疫毒素或对照注射生理盐水的方法进行治疗。免疫毒素的施入方法是，2或6μg溶于含有2％人血清白蛋白(“HSA”)的200μg磷酸盐缓冲液(“PBS”)中的免疫毒素，在一个7天的周期内用一个Alzet2M1渗透泵(Durect Corp.，Cupertino，CA)给入，对照动物被给予200μlPBS-HAS溶液。治疗从肿瘤细胞被接种后的第三天开始。如图3所示，所有接受盐水对照治疗的动物在20天内死亡。10％接受6μg剂量治疗的动物在第160天时依然存活。30％接受2μg剂量治疗的动物在第160天时依然存活。2μg和6μ治疗量在存活率上的差距显示，对于一个颅内装置，6μg剂量产生的免疫毒素浓度高至足以引起对脑组织的非特异性细胞毒性，这种情况在2μg剂量下被减轻或者不存在，但在这两种剂量下，免疫毒素均可延长存活时间。实施例6通过放置于小鼠前囟之前1mm和旁侧4mm位置的导管注入105个U87MG.ΔEGFRvIII细胞，诱发EGFRvIII颅内肿瘤在无胸腺小鼠形成。通过经导管直接向肿瘤内注射MR1-1-PE38免疫毒素或对照生理盐水的方法进行治疗。免疫毒素(0.2、0.6及2μg)在200μl含HAS的PBS中在一个7天的周期内被给入，利用一个如前例所述的Alzet2M1渗透泵(Durect Corp.，Cupertino，CA)。治疗从肿瘤细胞被接种后的第三天开始。
如图4所示，只有10％接受0.2μg或0.6μg免疫毒素治疗的动物存活超过25天，而大约22％接受盐水治疗的动物可存活至此日。与之相反，接受2μg治疗剂量的动物有大约55％，超过接受盐水治疗动物的2倍，可存活至此日。该结果显示0.2μg及0.6μg的剂量太小而不足以影响存活期，而2μg剂量的免疫毒素则能够明显延长存活时间。实施例7通过一个置于小鼠神经鞘内的导管注入溶于40μl PBS-HAS溶液中的5×106个U87MG.ΔEGFRvIII细胞，诱发EGFRvIII肿瘤性脑膜炎在无胸腺小鼠中形成。对肿瘤携带动物的治疗从被接种后的第三天开始。溶于40μl PBS-HAS溶液中的MR1-1-PE38免疫毒素在接种后的第3、5及7天给入。对照动物在同样时间给予40μlPBS-HAS溶液。
如图5所示，所有接受盐水对照治疗的动物于10天内死亡。与之相反，所有接受免疫毒素治疗的动物的生存时间延长最短至第14天，30％接受1μg剂量的动物和50％接受2μg治疗的动物存活直至第60天。实施例9开始治疗前7天(本试验中，开始治疗的时间被定为第“0”天)，通过一个导管注入50μl的U87MG.ΔEGFRvIII细胞匀浆，诱发肿瘤在无胸腺小鼠中形成。用分别在第0、2、和4天三次向肿瘤内注射20μl分别含1、2、或3μg的MR1-1-PE38免疫毒素、或对照盐溶液(前面实施例中提到的PBS-HBA溶液)的方法进行治疗。在开始治疗的第0天，肿瘤的平均体积为600mm3。
如图6所示，用任何剂量的免疫毒素治疗的动物的肿瘤大小与第一次给药后的第2天所测得肿瘤大小基本相同，有效地阻滞了肿瘤的生长。与之相反，仅用对照盐水治疗的动物显示了肿瘤的快速生长，到第7天肿瘤增加至大约7500mm3。
本说明书中提到的所有的出版物和专利在此被结合作为参考，即每一份出版物或专利在本说明书中都特定并独立地被参考引用。
表3通过筛选富集噬菌体筛选轮次 加入噬菌体总量洗脱噬菌体量VHCDR313×1091.5×10523×10111.0×10635×10111.5×10845×10112.0×107VLCDR311×10102.4×10521×10105.5×10631×10102.0×107表4实验1 实验2免疫毒素 IC50IC50MR1(Fv)-PE38 9.2±2.16.6±.2MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38 6.0±.394.6±.7MR1-1(Fv)-PE38 2.6±6.22.0±1比较MR1(Fv)-PE38和两种对EDFRvIII具有更强亲和力的突变体的细胞毒活性。IC50通过采用不同剂量的免疫毒素的方法来计算。数值的表示方式是平均值±标准偏差(S.D.)，当分别在实验1和实验2中对MR1(Fv)-PE38同MR1-1(Fv)-PE38以及MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38同MR1-1(Fv)-PE38进行比较时，P值＜0.01。
表5MR1 Fv*的重链和轻链CDR3的DNA和氨基酸序列MR1 CDR3HGGC TAT TCTAGT ACC TCT TAT GCT ATGGYSSTSYAM位点 95 96 97 98 99 100 100A 100B 100CMR1 CDR3L TTG CAAAGT TTT AAC GTG CCT CTT ACALQSFNVPLT位点 89 90 91 92 93 94 95 96 97*下划线是具有Pu G Py A/T序列的热点区。
表6从重链CDR3文库中分离的突变噬菌体及该突变scFv参与形成的免疫毒素的序列和特性位点 95 96 97 98 99 100 100 100 100 出现 IC5 KD 产量AB C频率 0nM ％(总ng/量ml22)初始 G Y S S T S Y A M8.0 8.0 2.0氨基酸第三 S T*5 8.0 8.0 2.0轮氨基酸P S 4 8.0 N.D. 17.5P Y 3 3.5 6.0 7.0P N 2 4.5 11.0 10.0P W 2 4.5 4.0 10.0A D**2 N.D. N.D. N.D.
P I 1 4.5 5.0 10.0W F 1 8.0 N.D. 10.0P V 1 6.5 N.D. 7.0W 1 8.0 N.D. 5.0P 1 8.0 8.0 ？出现频率(总量10)第四 S T*1 8.0 8.0 2.0轮氨基酸P N 34.5 11.0 10.0P Y 33.5 6.0 7.0P F 26.0 20.0 3.0P W 14.5 4.0 10.0*野生型**不能制备免疫毒素表7从轻链CDR3文库中分离的突变噬菌体及该突变scFv参与形成的免疫毒素的序列和特性位点89 90 91 92 93 94 95 96 97 出现频 IC50 KD产量率 ng/ml nM％(总量17)初始氨 LQSFNVPLT 3.56 7基酸第二轮SF 4 3.56 7氨基酸SW 6 1.33 7SR 3 6.09 8SS 2 15.0 22 16SL 1 5.54 8SM 1 9.06 2出现频率(总量10)SF 3.56 7第三轮1氨基酸SS 715.0 2216SW 11.33 7SR 16.09 8
权利要求
1.一种多肽，包括突变抗体重链(VH)可变区或突变抗体轻链(VL)可变区，所述多肽具有7nM或更低的对于EGFRvIII抗原的分离常数(Kd)，所述突变的VH或VL分别通过在互补决定区上至少一个氨基酸的替换而具有不同于亲代抗体MR1VH或VL的序列结构，所述氨基酸被一个密码子编码，所述密码子中包含一个属于热点区AGY或RGYW的核苷酸，其中R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述的替换发生于一个重链可变区的CDR3。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述的替换发生于一个轻链可变区的CDR3。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述的替换发生于一个轻链可变区的CDR1或CDR2。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述的替换发生于一个重链可变区的CDR1或CDR2。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述的VH链和VL链都发生在一个CDR区的至少一个氨基酸的替换突变。
7.根据权利要求2所述的多肽，其中所述突变的VH所具有的序列通过一个氨基酸替换而不同于MR1，替换至少发生于一个氨基酸选自由S98和T99组成的组。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述的替换选自由P98-Y99、P98-N99、P98-W99、P98-I99、P98-F99和P98-V99组成的组。
9.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是一个scFv。
10.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽是一个scFv。
11.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是一个dsFv、一个Fab、或一个F(ab’)2。
12.根据权利要求1所述的多肽，其中所述发生于重链的替换是S98P-T99Y并且发生于轻链的替换是F92W(MR1-1)。
13.根据权利要求1所述的多肽，进一步包括一个效应分子、治疗部分、或一个可检测标记物。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述的治疗部分是一个毒性部分。
15.根据权利要求14所述的多肽，其中所述的毒性部分是假单胞菌外毒素或其细胞毒性片段。
16.根据权利要求14所述的多肽，其中所述的毒性部分是一个细胞毒性片段，即PE38。
17.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽的IC50为7ng/ml或更低。
18.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽的IC50为5ng/ml或更低。
19.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽的IC50为3.5ng/ml或更低。
20.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽在VH具有至少一个氨基酸替换，其中所述替换选自由P98-S99、W98-V99、S98-W99、以及P98-T99组成的组。
21.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽具有至少3％的产量。
22.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽具有大约为7％的产量。
23.根据权利要求14所述的多肽，其中所述毒性部分选自由白喉毒素或它的一个细胞毒性片段、皂草素或它的一个细胞毒性片段、商陆抗病毒毒素或它的一个细胞毒性片段、蓖麻毒素或它的一个细胞毒性片段、以及泽泻提取物1(bryodinl)或它的一个细胞毒性片段组成的组。
24.根据权利要求15所述的多肽，其中所述发生于重链的替换是S98P-T99Y，以及发生于轻链的替换是F92W(MR1-1)。
25.根据权利要求1所述的多肽，进一步包括一个噬菌体的一种表面蛋白。
26.一个包含编码一多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽由一个突变抗体重链可变区、或一个突变抗体轻链可变区构成，具有6nM或更低的对EGFRvIII的Kd值，所述多肽通过在互补决定区(CDR)上至少一个氨基酸分子的替换而具有不同于MR1的序列结构，所述氨基酸被一个密码子编码，所述密码子中包含一个属于热点区AGY或RGYW的核苷酸，其中所述的R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述的多肽通过在重链多变区或轻链多变区的CDR1或CDR2的至少一个氨基酸的替换而具有不同于MR1 scFv的序列结构。
28.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述的多肽通过选自VHCDR3区的S98和T99或VLCDR3区的F92的至少一个氨基酸的替换而具有不同于MR1 scFv的序列结构。
29.根据权利要求28所述的核酸分子，其中所述VH链的替换选自S98P-T99Y、S98P-T99W、S98P-T99I、和S98P-T99V。
30.根据权利要求28所述的核酸分子，其中所述发生于重链的替换是S98P-T99Y，以及发生于轻链的替换是F92W(MR1-1)。
31.根据权利要求26所述的核酸分子，可以与一个启动子连接。
32.根据权利要求27所述的核酸分子，可以与一个启动子连接。
33.根据权利要求28所述的核酸分子，可以与一个启动子连接。
34.根据权利要求29所述的核酸分子，可以与一个启动子连接。
35.根据权利要求30所述的核酸分子，可以与一个启动子连接。
36.一种杀死带有一种抗原的细胞的方法，包括用一种含有一个毒性部分和一个靶部分的免疫毒素同所述细胞接触，所述靶部分包括由突变抗体重链可变区或突变抗体轻链可变区构成的多肽，所述多肽具有7nM或更低的对EGFRvIII抗原的Kd值，所述多肽通过在互补决定区(CDR)上至少一个氨基酸的替换而具有不同于MR1的序列结构，所述氨基酸被一个密码子编码，密码子中包含一个属于热点区AGY或RGYW的核苷酸，其中所述的R是A或G，Y是C或T，并且W是A或T。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述在突变重链可变区的CDR1或CDR2或突变轻链可变区的CDR1或CDR2上至少一个氨基酸被替换。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述突变重链可变区CDR3包括一个氨基酸突变，选自由P98-Y99、P98-N99、P98-W99、P98-I99、以及P98-V99组成的组。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述突变轻链可变区CDR3包括92位上一个色胺酸对一个苯丙胺酸的替换。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述的靶部分是MR1-1。
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述的细胞是一种恶性肿瘤细胞。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述的恶性肿瘤细胞是神经胶质瘤细胞。
43.根据权利要求36所述的方法，其中所述的恶性肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
44.根据权利要求36所述的方法，其中所述的恶性肿瘤细胞是肺癌细胞。
45.根据权利要求36所述的方法，其中所述的恶性肿瘤细胞是卵巢癌细胞。
全文摘要
本发明提供了表皮生长因子受体的一种突变形式(EGFRvIII)的抗体。该突变形式目前仅仅或主要存在于成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌及非小细胞肺癌细胞的表面。相对于以前技术制备的抗体(包括名为MR1的scFv)，本发明提供的抗体对EGFRvIII有更高的结合力，形成的免疫毒素有更高的细胞毒性和产量。特别地，本发明提供一种名为MR1－1的抗体，该抗体由MR1的CDR3V
文档编号A61K47/48GK1427891SQ01807175
公开日2003年7月2日 申请日期2001年2月23日 优先权日2000年2月25日
发明者艾拉·帕斯坦, 理查德·贝尔斯, 帕萨·S·乔杜里, 达雷尔·比格纳 申请人:美国政府由(美国)卫生和福利部部长代表, 杜克大学