另外一种可供选择的方式，在这些检测中对所述的自体同源性人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型CD4+T细胞的使用进行探索；首先对这些细胞所具有的细胞因子曲线进行评价是必要的，从而避免利用所述的细胞溶解性细胞对它们的曲线进行回旋。用于对非细胞溶解性人类T细胞进行克隆的目前的效率是大约75-90%。由于某些细胞溶解性细胞可能经受到程序化的细胞死亡，所述的效率可能会减小，但是所述的细胞被得以延伸，因此可以在每一种克隆物上进行进一步的分析。对于所述的先天性系统细胞以及效应器存储单元细胞而言，对与有效的抗病毒应答相关联的精确的功能性差异进行的定义将能够建立一种基准性的标准，用以对疫苗或者其他的干预手段进行评价。
[0064]实施例5.在所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的急性阶段过程中，存在于表型标记物与所述的天然杀伤(NK)细胞所具有的功能性行为之间的关联性
在上文所描述的所述检测方法被用于对细胞因子进行多元化的检测，用以针对天然杀伤(NK)细胞建立详细的表型、功能、以及基因型曲线，其中所述的细胞因子是由单个细胞所分泌出的，所述的天然杀伤(NK)细胞来自于发生了急性人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者以及长期的非恶化者。正如上文中所概括的，所述的方法在解决细胞对于宿主的免疫应答所起到的作用而言是非传统性的，但是却是一种能够对稀有细胞所具有的特征进行识别的方法，其中对稀有细胞所具有的特征进行识别对于已有的工具而言是困难的，所述的已有的工具例如是流式细胞术以及酶联免疫斑点检测(ELISpot)。在感染的不同阶段中存在不同子集的天然杀伤(NK)细胞，并且在经过所述的感染的急性阶段之后，它们的功能性的行为(或者功能的缺失)提供了对这些细胞所具有的减少的作用进行了洞察。
[0065]在这项研宄中所需要的细胞是循环的天然杀伤(NK)细胞，所述的细胞来自于人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性患者。利用到了来自于急性感染的患者以及长期非恶化者/杰出的控制者(elite controller)的纵向样本。
[0066]已经报道过在人类中存在天然杀伤(NK)细胞的两种重要的子集(参见Cooper，Μ.A., Fehniger, Τ.A.& Caligiuri, M.A.(于 2001 年)在 Trends Tmmunol《免疫学趋势》22，633-640 中发表的文章 The b1logy of human natural killer-cell subsets《人类天然杀伤细胞子集的生物学》)。细胞溶解性的天然杀伤(NK)细胞(NKp46wtt⑶⑶56wtt⑶16
能够分泌出大量的干扰素-γ (1刚-丫)，肿瘤坏死因子-(1 (TNF-α )，巨噬细胞炎性蛋白-1 β (ΜΙΡ-1 β )，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF).与之形成对照的是，免疫调节性的天然杀伤(NK)细胞(NKp46wtt⑶⑶56wtt /Ktt⑶16wtt )能够制造出大量的白细胞介素-10 (IL-10)以及白细胞介素-17 (IL-17)。健康的个体通常情况下拥有大量的细胞溶解性天然杀伤(NK)细胞以及低水平的免疫调节性天然杀伤(NK)细胞。然而，在怀孕的过程中以及在牵扯到黏膜感染的过程中，所述的免疫调节性天然杀伤(NK)细胞所具有的群体扩大了。不能够确定在人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)感染的过程中存在于这两种天然杀伤(NK)细胞群体之间的平衡是否发生变化，以及天然杀伤(NK)细胞的特定克隆物是否能够生成与多种T辅助细胞应答相关的细胞因子类型。
[0067]利用上文中所描述的微雕刻方法在一个单一的检测中对五种细胞因子(干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α，巨噬细胞炎性蛋白-1 β，白细胞介素-10以及白细胞介素-17)进行检测。为了对所述的检测进行最优化处理，通过阴性选择(干细胞技术)将天然杀伤(NK)细胞从健康对照的外周血中被提取出来。将这样的天然杀伤(NK)细胞分成两个部分，并且利用白细胞介素-12 (IL-12)以及白细胞介素-18 (IL-18)(对于所有的天然杀伤细胞功能而言是一种有效的刺激)对它们进行共同培养或者将它们保持在未进行刺激的状态下。经过了 4小时的刺激作用之后，将天然杀伤(NK)细胞沉积于一种微孔阵列之上(大约15个具有30微米直径的孔)。进行动力学研宄，用以对所述的最佳的培养时间进行评价，用以测量天然杀伤(NK)细胞功能的峰值。在所述的玻璃上对所述的细胞因子进行捕获之后，为了获得天然杀伤(NK)细胞的活化作用所具有的典型标记物而对存在于所述孔内的所述细胞进行染色(Hoescht 33324 (核)，NKp46_Cy3，CD107a_Alexa647，以及 CD69_Alexa488)，并且在一种定制的高速成像系统上对其进行成像。将所述的检测到的来自于每一个孔内的细胞因子曲线与这些数据相关联，并且通过主要成分分析法对其进行聚类，从而对细胞的共同子集进行识别(每个细胞8项参数)。天然杀伤(NK)细胞是从10个发生了人类免疫缺陷病毒(HIV)的急性感染的患者以及10个长期的非恶化者处分离得到的。对所述的检测进行重复，用以对存在于这些组中的所述的细胞子集所发生的变化进行评价，其中所述的这种变化是相较于彼此以及所述的对照组而言的。最终，在所述的细胞子集中对所述的差异进行纵向的检查，其中所述的细胞子集是存在于发生了急性感染的患者中的，用以评价伴随着所述疾病的恶化而发生的所述子集的变化。
[0068]实施例6.对存在于细胞溶解性天然杀伤(NK)细胞间的克隆多样性所进行的评价
不同于表达一种单一的抗原特异性受体的T细胞以及B细胞，天然杀伤(NK)细胞能够以随机组合的方式表达许多种不同的受体。存在于个体天然杀伤(NK)细胞克隆物之上的所述的受体的组合允许它们能够差异化的识别出病毒感染的细胞或者恶性细胞。伴随着人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染，所述的天然杀伤(NK)细胞受体的表达以及所述的天然杀伤(NK)细胞所具有的子集的分布均发生了戏剧性的变化。发生了急性人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染的个体表现出了天然杀伤(NK)细胞的显著的扩大:在所述的感染作用的前几周的时间内，高达50%的所述的循环的外周血单核细胞(PBMC)是天然杀伤(NK)细胞。通过进行比较，恶化性的感染作用是通过无能性的CD56_4天然杀伤(NK)细胞的积累而显现出来的。没有对下述情形进行理解:所述的多种多样的受体怎样发生了克隆性的变化，以及所述的受体与能够发挥抗病毒性控制作用的功能的天然杀伤(NK)细胞之间存在怎样的关联性，特别是对于那些能够表现出显著的细胞溶解性能力的克隆物而言。
[0069]在人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)感染的不同阶段中对杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的曲线进行确定，其中所述的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是由个体细胞溶解性天然杀伤(NK)细胞所表达的，以急性感染为开始。使用一项利用微孔阵列的检测对细胞溶解性功能进行测量。通过显微操作器对个体的细胞毒性天然杀伤(NK)细胞进行回收，用以对它们所具有的受体的全部功能进行随后的量化，其中所述的量化是通过逆转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)来实现的。为了进行所述的单个细胞的细胞溶解性检测，将天然杀伤(NK)细胞与主要组织相容性复合体(MHC)缺乏型靶向细胞(K562或者221)进行共同装载，其中利用CD56-Alexa 647或者细胞溶质性着色剂(细胞示踪红)对所述的天然杀伤(NK)细胞进行染色，并且利用钙黄绿素AM对所述的主要组织相容性复合体(MHC)缺乏型靶向细胞进行染色。对这些检测进行5-6小时的培养，同时对其进行周期性的成像，用来对细胞溶解作用进行评价(这是通过来自于靶向细胞的钙黄绿素的损失来显现的)。为了确保活化作用，同样获得存在于所述的天然杀伤(NK)细胞的表面之上的CD107a。
[0070]这种类型的检测所取得的初步结果在附图5中被表示出来，其中在所述的检测中使用到了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以及一种靶向T细胞系。或者可供选择的，可以使用自体同源性的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型CD4+T细胞，作为这项检测中的靶向。在对存在于所述的阵列之中的含有个体的细胞溶解性细胞的所述孔的位置进行打分之后，通过自动化的显微操作器(Aviso CellCelector)对细胞进行回收，并且使用重组的白细胞介素-2 (IL-2)在96孔培养板内对其进行克隆性的扩展。经过扩展之后，利用一组针对12个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的特异性引物在每一个克隆物上对所述的天然杀伤(NK)细胞受体的全部功能进行量化，其中所述的量化是通过逆转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)来实现的。
[0071]通过下述方式在不进行扩展的情况下来实现对细胞的直接的单个细胞分析:将所述的细胞放置于SuperScript-3逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) mastermix(Invitrogen)中，其中含有一组oligo_dt引物，所述的引物中含有用于嵌套引物的植入型的扩增结合序列，此后进行热循环，使用所述的12个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)引物组在cDNA上进行定量聚合酶链式反应(qPCR)。在10个健康的对照组，10个急性人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性感染个体，10个人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性自发性非恶化者(病毒负载量低于2000个拷贝/毫升)，以及10个人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性未经治疗的恶化者(病毒负载量大于10000个拷贝/毫升)中，将对来自于分离的天然杀伤(NK)细胞中的所述的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的全部功能中存在的多样性进行定义。
[0072]实施例7.对天然杀伤(NK)细胞所具有的影响抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)的变化的能力所进行的确定，这种变化是伴随着感染作用的恶化而发生的
到目前为止，作用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的大多数的备选疫苗均已经尝试过广泛的引发出作用于所述病毒的中和抗体(参见Barouch, D.H.(于2008年)在Nature《自然》455，613-619 中发表的文章Challenges in the development of an HIV-1 vaccine《在研发人类免疫缺陷病毒-1疫苗中所存在的挑战》)。使用一种抗体应答来介导保护作用的一种可供选择的策略是抗体依赖性的细胞毒性作用(ADCC)。来自于急性感染型患者的血清转移研宄表明，天然杀伤(NK)细胞的活化作用可以发生，但是迄今为止不能利用任何检测来识别这样的B细胞克隆物，其中所述的B细胞克隆物能够生成有效的诱导抗体依赖性的细胞毒性作用(ADCC)的抗体，所述的抗体依赖性的细胞毒性作用(ADCC)是通过天然杀伤(NK)细胞来进行介导的。按照下面的描述通过这样的克隆物来建立重组的抗体能够促进新的研宄，其中所述的研宄针对的是用于进行疫苗接种的免疫原的基本原理设计(参见Walker，B.D.& Burton, D.R.(于 2008 年)在 Science《科学》320，760-764 中发表的文章 Toward anAIDS vaccine《获得性免疫缺陷综合症疫苗的方向》)。
[0073]将这些细胞群体从发生急性感染的患者以及长期非恶化者体内分离出来一一⑶56?⑶16+天然杀伤(NK)细胞，⑶4 +T细胞，以及⑶20+B细胞。通过利用植物血红素凝集素(PHA)以及白细胞介素-2 (IL-2)进行培养的方式对所述的CD4+T细胞进行扩展，并且利用人类免疫缺陷病毒(HIV)对其进行外生性的感染。利用白细胞介素-2 (IL-2)对所述的天然杀伤(NK)细胞进行活化，并且利用CD40L以及抗-B细胞抗原受体(BCR)对所述的B细胞进行活化。将B细胞(利用细胞示踪红对其进行标记)与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型T细胞(利用钙黄绿素AM对其进行标记)共同装载于一种微孔阵列之中。利用玻璃盖玻片对所述的阵列进行一小时的密封。在这个时间阶段内，在所述的分离的反应器内，所述的B细胞能够生成这样的抗体，其中所述的抗体能够结合在所述的感染型T细胞的表面之上。在此之后将所述的阵列从所述的玻璃上去除并且对其进行洗涤。
[0074]将上述经过活化的天然杀伤(NK)细胞(利用细胞示踪蓝对其进行标记)添加到所述的孔内并且进行4-6小时的培养。在进行培养之前以及之后，对所述的阵列进行成像处理，用以对经过培养之后含有下述细胞的孔进行打分，其中所述的细胞是:1)B细胞，2)天然杀伤(NK)细胞，以及3)发生细胞溶解的T细胞。从这些孔中对细胞进行回收并且使用一种退化的引物组在编码所述抗体的所述基因所具有的VDJ区域上进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。存在于所述的阵列之上的内在对照是那些随机的不含有B细胞或者不含有天然杀伤(NK)细胞的孔。同样对那些只含有天然杀伤(NK)细胞以及T细胞的阵列进行了打分。经过回收的所述抗体所发生的重组性的表达能够对所述的结合于感染型细胞之上的表位进行映射，以及对在所述的B细胞中引发的克隆多样性进行评价，其中所述的克隆多样性与生成性的抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)之间存在相关性。
[0075]另外一种可供选择的方式是将所述的检测分割成为两个部分。首先，使用所述的微雕刻技术生产富集的B细胞群体，并且使用所述的B细胞群体来生成抗体微阵列。利用细胞的溶解产物对这些阵列进行染色，其中所述的溶解产物来自于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染型细胞以及抗免疫球蛋白G3。对那些能够映射出双阳性孔的B细胞进行回收，用以进行遗传学分析。向感染型细胞施用来自于这些细胞的重组抗体，并且在一项类似于上文中所描述的细胞溶解性检测中将其与天然杀伤(NK)细胞进行混合。
[0076]在本发明中所描述的方法允许直接在细胞内对宿主-病原体之间的相互作用进行鉴定，并且促进用于传染性疾病的疫苗以及免疫疗法的发展，其中所述的细胞是从临床人类样本中直接获取的，在所述的免疫疗法中使用量化的免疫学曲线进行探索、评价、以及监测。除了人类免疫缺陷病毒(HIV)之外，所述的方法可以被扩展到其他的传染性疾病中，包括在免疫胁迫人群中成为感染的主要诱因的病原体，无论是作为人类免疫缺陷病毒(HIV)的结果或者是预备性的抑制性干预的结果。这包括，例如，新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
[0077]其他的实施方式存在于所述的权利要求的范围之内。
【主权项】
1.用以在宿主体内识别⑶8+细胞的方法，其中所述的⑶8+细胞能够⑶4+人类免疫缺陷病毒感染型细胞进行溶解，所述的方法包括: 提供一种效应器CD8+细胞以及来自于宿主的靶向细胞的悬浮液，其中所述的悬浮液被沉积于一种可模压成型的平板之上，所述的平板上含有至少一个存在于微孔阵列之中的微孔，其中在所述的微孔阵列中的至少一个微孔中含有一个效应器细胞； 在允许利用所述的CD8+细胞对所述的靶向细胞进行溶解的条件下对所述的悬浮液进行培养； 对利用所述的效应器细胞对所述的靶向细胞所产生的溶解进行检测，并且 识别出那些能够对CD4+人类免疫缺陷病毒感染型细胞进行溶解的CD8+细胞。
2.根据权利要求1中所述的方法，进一步的包括对溶解了所述的靶向细胞的效应器细胞进行回收。
3.根据权利要求2中所述的方法，进一步的包括对已经溶解了所述的靶向细胞的效应器细胞进行培养。
4.根据权利要求1中所述的方法，其中在将细胞沉积于所述的微孔内之前，对所述的效应器细胞以及靶向细胞进行混合。
5.根据权利要求1中所述的方法，其中在将细胞沉积于所述的微孔内之后，对所述的效应器细胞以及靶向细胞进行混合。
6.根据权利要求1中所述的方法，其中对溶解作用进行检测，所述的检测是通过对一种被标记细胞所具有的荧光性所发生的变化进行监测的方式来实现的。
7.根据权利要求1中所述的方法，其中对溶解作用进行检测，所述的检测是通过对所述的靶向细胞所具有的细胞内的钙水平所发生的变化进行监测的方式来实现的。
8.根据权利要求7中所述的方法，其中利用一种钙敏感型荧光染料对所述的钙进行检测。
9.根据权利要求8中所述的方法，其中所述的染料是Fura2AM(Invitrogen)。
10.根据权利要求1中所述的方法，进一步的包括 将所述的微孔阵列与一种底物进行接触，其中利用至少一种试剂对所述的底物进行了预处理，所述的试剂能够特异性的检测出所述的效应器细胞所具有的产物；并且 利用所述的试剂进行检测。
【专利摘要】本发明涉及用于对单个细胞所具有的细胞毒性进行评价的组合物以及方法。本发明提供了用以对存在于靶向细胞以及效应器细胞对之间的相互作用进行分析的方法，所述的方法利用到了高通量的筛选方法，用以对存在于微阵列之中的大量的单个细胞进行描绘。
【IPC分类】G01N33-569, C12Q1-04
【公开号】CN104745669
【申请号】CN201510140107
【发明人】J.C.洛夫, N.范阮达若詹, B.居尔格, B.沃克
【申请人】麻省理工学院, 综合医院公司附属马萨诸塞州综合医院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2009年7月13日
【公告号】CA2689681A1, CN102388145A, EP2389446A1, EP2389446A4, US20120149592, WO2010085275A1