专利名称：抗原特异性t细胞受体和t细胞表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于免疫治疗的T细胞受体和T细胞表位的提供。
背景技术：
免疫系统的进化使得脊椎动物处于基于两种类型的防御(先天和获得性免疫)的高效网络中。
与依赖于不变受体(其识别与病原体相关的常见分子模式)的在进化上古老的先天免疫系统相比，获得性免疫基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体以及克隆选择。
B细胞通过分泌抗体引起体液免疫应答，而T细胞介导导致所识别细胞被破坏的细胞免疫应答。
T细胞在人和动物的细胞介导免疫中发挥核心作用。在T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)介导特定抗原的识别和结合。
T细胞的T细胞受体(TCR)能够与结合于主要组织相容性复合体(MHC)分子并且在靶细胞表面上呈递的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。为了能够靶向大量的多种抗原，T细胞受体需要具备极大的多样性。
通过编码TCR不同结构区域之基因的不同不连续区段的基因重排获得该多样性。TCR由一条α-链和一条β-链或者一条Y-链和一条δ链构成。TCRa/β链由参与抗原识别的N端高多态性可变区和不变的恒定区构成。在基因水平上，这些链被分成几个区，可变(V)区，多样⑶区(仅和δ-链)，结合(J)区和恒定(C)区。人β-链基因包含超过60个可变(V)，2个多样(D)，超过10个结合(J)区段和2个恒定区区段(C)。人a -链基因包含超过50个V区段，以及超过60个J区段但是没有D区段，以及一个C区段。鼠β -链基因包含超过30个可变(V)，2个多样(D)，超过10个结合(J)区段和2个恒定区区段(C)。鼠a -链基因包含几乎100个V区段，60个J区段，没有D区段，但有一个C区段。在T细胞分化过程中，通过重排一个V，一个D(仅β-和3-链)，一个和一个(:区基因产生特异性T细胞受体基因。通过不精确的V-(D)-J重排进一步扩大TCR的多样性，在所述重排中随机核苷酸在重排位点被引入和/或缺失。由于TCR基因座重排发生在T细胞成熟过程中的基因组中，所以每个成熟T细胞仅表达一种特定的α/β TCR或y/STCR。
MHC和抗原结合是通过 TCR的互补决定区1，2和3 (CDR1，⑶R2，⑶R3)介导的。通过重排的TCRi1-链基因的V-D-J连结编码对于抗原识别和结合最关键的β -链⑶R3。
TCR是复杂的信号转导装置的一部分，其包括TCR a -和β -链的异源二聚体复合物，辅助受体⑶4或0)8以及0)3信号转导模块(Q)3signal transduction modul)(
图1)。⑶3链转移细胞内激活信号，而TCRa/β异源二聚体仅负责抗原识别。因此，TCRa/β链的转移为T细胞向任何的目的抗原重定向提供了机会。
免疫治疗
抗原特异性免疫治疗旨在提高或诱导患者体内的特异性免疫应答以控制感染性或恶性疾病。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定产生了一大批用于免疫治疗的合适靶标。可通过主动或被动的免疫策略特异性靶向呈递源自这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。
主动免疫倾向于诱导患者的抗原特异性T细胞并使其扩增，所述T细胞能够特异性识别和杀死病变细胞。相反，被动免疫依赖于T细胞的过继转移，其在体外被扩增并任选地进行遗传改造(过继T细胞治疗)。
疫苗接种
肿瘤疫苗旨在通过主动免疫诱导内源性肿瘤特异性免疫应答。可以用于肿瘤疫苗接种的不同抗原形式包括全癌细胞、蛋白质、肽或免疫载体(如RNA、DNA或病毒载体)，其可在体内直接施用或在体外通过致敏DC随后转移入患者。
鉴于免疫策略和抗原特异性免疫应答检测方法的改进，可鉴定治疗诱导之免疫应答的临床研究的数目正在稳定增长(Connerotte, T.等.(2008).Cancer Res.68,3931-3940 ；Schmitt, Μ.等.(2008)Bloodlll, 1357-1365 ；Speiser, D.E.等.(2008)Proc.Nail.Acad.Sc1.U.S.A105，3849-3854 ；Adams, S.等.(2008) J, Immunol.181,776-784)。
然而，在大多数情况下，检测到的免疫应答不完全与临床结果相关(Curigliano，G.等.(2006) Ann.0ncol.17,750-762 ；Rosenberg, S.A.等.(2004) Nat.Med.10,909-915)。
因此来自肿瘤抗原的肽表位的准确确定可有助于提高疫苗接种策略和免疫监测方法的特异性和效力。
过继细胞转移(Adoptivecell transfer, ACT)
基于ACT的免疫治疗可以被广义地定义为用先前致敏的T细胞进行的被动免疫形式，所述T细胞从低前体频次离体扩增至临床相关的细胞数后被转移至未免疫接受者或自体宿主。已被用于ACT实验的细胞类型是淋巴因子激活的杀伤(lymphokine-activated killer, LAK)细胞(Mule, J.J.et al.(1984)Science225,1487-1489 ；Rosenberg, S.A.et al.(1985) N.Engl.J.Med.313，1485-1492)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-1nfiltratinglymphocyte, TIL)(Rosenberg, S.A.et al.(1994)J.Nail.Cancer Inst.86，1159-1166)、造血干细胞移植(HSCT)后的供体淋巴细胞以及肿瘤特异性 T 细胞系或克隆(Dudley, M.E.et al.(2001) J.1mmunother.24，363-373 ；Ye ；C.etal.(2002) Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A99,16168-16173)。
证明过继T细胞转移对人的病毒感染(如CMV)具有治疗活性。虽然健康个体的免疫系统控制CMV感染和内源潜伏病毒的再活化，但在免疫受损的个体(如移植接受者或AIDS患者)中导致显著的发病率和死亡率。Riddell和他的同事证明在转移来自HLA匹配的CMV血清阳性移植供体的CD8+CMV特异性T细胞克隆之后，在免疫抑制患者中通过过继T 细胞治疗重建病毒免疫(Riddell, S.R.(1992) Science257，238-241)。
作为一种替代方法，多克隆供体来源的CMV或EBV特异性T细胞类群被转移到移植接受者，导致转移T细胞的持久性的增加(Rooney, C.M.et al.(1998)Blood92,1549-1555 ；Peggs, K.S.et al.(2003)Lancet362，1375-1377)。
对于黑色素瘤的过继 免疫治疗，Rosenberg和他的同事建立了一种ACT方法，其依赖于输注分离自切除肿瘤的体外扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与非清髓性淋巴细胞删除性化学疗法和高剂量IL-2的组合。最近发表的临床研究的结果是治疗的转移性黑色素瘤患者有约50%的客观反应率(Dudley, M.E.et al.(2005) J.Chin.0ncol.23:2346-2357)。
然而，患者必须满足几个前提以适于ACT免疫治疗。他们必须具有可切除的肿瘤。肿瘤必须在细胞培养条件下生成有活力的TIL。TIL必须针对肿瘤抗原有反应性，并且必须在体外扩增至足够的数量。特别是在除黑色素瘤外的其他癌症中，难以获得这样的肿瘤反应性TIL。此外，正常人T淋巴细胞的反复体外刺激和克隆扩增导致端粒酶活性逐渐减少和端粒缩短，从而导致复制性衰老和转移T细胞持久能力的下降(Shen，X.et al.(2007)J.1mmunother.30: 123-129)。
克服ACT局限性的一种方法是自体T细胞的过继转移，所述T细胞在短时间的离体培养中被重新编程以表达具有确定特异性的肿瘤反应性TCR，然后回输到患者体内。这种策略使ACT适用于多种常见的恶性肿瘤，即使在患者体内缺乏肿瘤反应性T细胞时也适用。由于T细胞的抗原特异性完全依靠T CR α -和β -链的异源二聚体复合物，克隆的TCR基因向T细胞的转移提供了将它们重定向为任何目的抗原的潜力。因此，TCR基因治疗提供了具有吸引力的策略以开发用自体淋巴细胞作为治疗选择的抗原特异性免疫治疗。TCR基因转移的主要优点是在几天之内产生治疗量的抗原特异性T细胞，以及可以引入在患者的所有内源性TCR中不存在的特异性。
几个小组证实，TCR基因转移是重定向原发T细胞的抗原特异性的有吸引力的策略(Morgan, R.A.et al.(2003) J.Tmmunol.171,3287-3295 ；Cooper, L.J.et al.(2000)J.Virol.74,8207-8212 ；Fujio,K.et al.(2000)J.1mmunol.165,528-532 ；Kessels,H.ff.etal.(2001)Nat.Tmmunol.2,957-961 ；Dembic, Z.et al.(1986)Nature320,232-238)。
Rosenberg和他的小组最近在恶性黑色素瘤治疗的临床试验证实了在人中进行TCR基因治疗的可行性。用黑色素瘤/黑色素细胞抗原特异性TCR进行逆转录病毒转导的自体淋巴细胞的过继转移导致在高达30%的所治疗黑色素瘤患者中癌症消退(Morgan，R.A.et al.(2006)Science314,126-129 ；Johnson, L.A.etal.(2009)Bloodll4，535-546)。
抗原特异性免疫治疗的靶结构
多个肿瘤相关抗原(TAA)的发现为抗原特异性免疫疗法的概念提供了基础(Novellino,L.et al.(2005)Cancer Immunol.1mmunother.54,187-207)。由于遗传不稳定性，TAA是在肿瘤细胞上表达的不常见蛋白质，其在正常细胞中没有或有有限的表达。这些的TAA可以导致免疫系统特异性识别恶性细胞。
通过使用自体肿瘤特异性T细胞(vander Bruggen, P.et al.(1991) Science254,1643-1647)或循环抗体(Sabin，U.et al.(1995) Proc.Natl.Mad.Sc1.U.S.A92,11810-11813)筛选肿瘤衍生的cDNA表达文库进行TAA分子克隆、反向免疫学方法、生物化学方法(Hunt, D.F.et al.(1992) Science256，1817-1820)、基因表达分析或用计算机进行的克隆策略(Heiftenbein，G.et al.(2008) Gene414，76-84)产生了用于免疫治疗策略的显著数量的靶候选物。TAA分为几个类别，包括分化抗原，过表达的抗原，肿瘤特异性的剪接变体，突变基因的产物，病毒抗原和所谓的癌睾丸抗原(CTA)。由于其表达限于睾丸和多种不同的肿瘤实体，癌症睾丸家族是非常有前途的TAA类别(Scanlan，M.J.etal.(2002) Tmmunol.Rev, 188, 22-32)。至今为止，已经描述了超过 50 种 CT 基因(Scanlan,M.J.et al.(2004) Cancer Inimun.4,1)并且其中一些已在临床研究中使用(Adams,S.et al.(2008)J.1mmunol.181, 776-784 ；Atanackovic, D.et al.(2004)J.Tmmunol.172，3289-3296 ；Chen, Q.et al.(2004) Proc.Natl.Acad.Sci , U.S.AlO I，9363-9368 ；Connerotte,T.et al.(2008).Cancer Res.68，3931-3940 ；Davis,1.D.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A101，10697-10702 ； Jager, E.(2000) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A97，12198-12203 ；Marchand, M.et at.(1999) hit.J.Cancer80, 219-230 ；Schuler-Thurner,B.et al.(2000)J.Tmmunol.165,3492-3496)。
尽管用于免疫治疗方法的有吸引力的靶结构越来越多，但仅对于它们中的几个存在确定HLA限制性的T细胞克隆或系(Chaux, P.et al.(1999) J.1mmunol.163，2928-2936 ；Zhang, Y.at al.(2002)Tissue Antigens60,365-371 ；Zhao, Y.et al.(2005)J.1mmunol.174，4415-4423)。对于大多数的CTA (包括TPTE)，即便连存在特异性T细胞应答的迹象都不存在。
发明描述
发明概述
免疫治疗策略是治疗感染性疾病和癌症的有前景选择。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原的鉴定产生了用于免疫治疗的大量合适靶标。
通过过继转移经改造以表达确定抗原特异性T细胞受体(TCR)的T细胞，这些抗原可以被特异性靶向，从而导致所靶向的恶性或受感染细胞的选择性破坏。由于TCR特异性由高度多态性的MHC分子限制，过继TCR转移的广泛应用依赖于“现成(off the shelf)"使用的多种TCR试剂(覆盖宽范围的抗原和MHC限制性)的产生。然而，至今为止仅鉴定了有限数量的合适TCR候选物。这主要是由于用于TCR基因分离的T细胞克隆的建立费力。
本发明涉及用于提供抗原特异性淋巴样细胞的有效方法。这些淋巴样细胞可以用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体，以及用于鉴定免疫相关T细胞表位。
一方面，本发明涉及用于提供抗原特异性淋巴样细胞的方法，其包括以下步骤:
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸,所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；以及
(C)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供所述抗原特异性淋巴样细胞。
在一个实施方案中，该方法还包括确 定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性的步骤和/或确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性的步骤。
另一方面，本发明涉及用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体的方法，其包括以下步骤:
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸,所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(C)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性。
在一个实施方案中，该方法还包括确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性的步骤。
另一方面，本发明涉及用于鉴定抗原中的T细胞表位的方法，其包括以下步骤:
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸,所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性。
在一个实施方案中，该方法还包括确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性的步骤。
在一个优选的实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞和所述编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸对施用给对象的抗原有反应性。在一个优选的实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞通过分离提供。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述表位是MHC呈递的肽。在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性的步骤包括:确定所述抗·原特异性淋巴样细胞对MHC分子的反应性，所述MHC分子暴露于(优选致敏(pulse)，即装载)来自所述抗原的肽。优选地，所述MHC分子是在对象中表达的MHC分子。优选地，所述MHC分子存在于靶细胞上。所述肽可以是源于所述抗原的肽文库的一部分，并且肽文库可以包含来自所述抗原的一组重叠肽。优选地，所述重叠肽的组覆盖该抗原的完整序列。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，确定所述抗原特异性淋巴细胞的MHC限制性的步骤包括:确定所述抗原特异性淋巴样细胞对选定MHC分子的反应性。优选地，所述选定MHC分子存在于靶细胞上。优选地，所述选定MHC分子是在对象中表达的MHC分子。优选地，所述选定MHC分子存在于表达所述抗原或其一部分的靶细胞上。优选地，所述抗原特异性淋巴样细胞或其T细胞受体受在对象中表达的MHC分子的限制。
优选地，确定抗原特异性淋巴样细胞的反应性包括确定淋巴样细胞的细胞因子分泌，其中所述细胞因子可以是干扰素-Y (IFNY)。可以使用的另一些活化标志物是例如CD 154 和 / 或 CD137。
在根据上述所有方面的方法的一个特别优选实施方案中，所述编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸是RNA (优选体外转录的RNA)。优选地，所述淋巴样细胞缺乏内源性TCR的表面表达或者对不相关抗原特异。在一个实施方案中，淋巴样细胞是淋巴细胞，优选T细胞。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述提供编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸的步骤包括提供编码这样的T细胞受体的核酸,其包含所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的至少CDR序列、优选至少可变区。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述提供编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸的步骤包括从所述单一抗原反应性T细胞或其克隆群中分离RNA (优选多聚A+-RNA)，并且优选还包括从所述RNA获得CDNA0在一个实施方案中，所述提供编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸的步骤还包括扩增cDNA的至少一部分，所述部分包含编码至少CDR序列(优选至少所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的可变区)的核酸序列。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述对象对所述抗原或包含所述抗原的物质(agent)呈血清学阳性。对象的血清学阳性可通过测定对抗原或物质或其组分的免疫应答来确定。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，在提供单一抗原反应性T细胞之前对所述T细胞进行抗原特异性扩增和再攻击(rechallenge)，其中抗原特异性扩增和再攻击可以通过将T细胞暴露于优选呈递抗原之自体抗原呈递细胞来实现。在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞为活化标志物(如IFNy或CD137 和 CD8 或 CD4)阳性。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞使用流式细胞术从包含T细胞的样品中分离。分选优选根据对于活化标志物(尤其IFN Y或⑶137，和⑶8或⑶4)呈阳性而进行。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述T细胞受体包含T细胞受体α -和β -链。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸包含编码至少⑶R序列(优选至少所述单一抗原反应性T细胞 的T细胞受体的可变区)的核酸序列。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。优选地，所述对象具有涉及表达抗原的细胞的疾病，优选T细胞相关疾病。所述疾病可以选自免疫系统疾病、感染和恶性疾病。
此外，本发明涉及对病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY_ES0_1、TPTE或PLACl (尤其是在呈递于细胞如病变细胞或抗原呈递细胞表面上时)特异的T细胞受体，以及包含被这些T细胞受体识别的表位的肽。
一方面，本发明涉及包含以下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列的变体。
在一个实施方案中，所述肽是MHC I类或II类呈递肽，优选MHC I类呈递肽，或者，如果存在于细胞内，所述肽可以被加工产生其加工产物，所述加工产物是MHC I类或II类呈递肽，优选MHC I类呈递肽。优选地，所述MHC I类或II类呈递肽具有基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列变体的氨基酸序列)的序列。优选地，本发明所述的肽能够刺激针对这样的疾病的细胞应答，所述疾病涉及特征为呈递肽所源自的抗原(即具有MHC I类的CMV-pp65、NY-ES0-1、TPTE 或 PLACI)的细胞。
另一方面，本发明涉及编码本发明肽的核酸以及包含该核酸的细胞。该核酸可以存在于质粒或表达载体中并且可以与启动子功能性连接。优选地，所述细胞表达所述肽。所述细胞可以是重组细胞并且可分泌编码的肽或其加工产物，可在表面表达它并且优选地可以额外表达MHC分子，该MHC分子结合所述肽或其加工产物并且优选地在细胞表面上呈递所述肽或其加工产物。在一个实施方案中，所述细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，所述细胞以重组方式表达MHC分子和/或所述肽。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突细胞，单核细胞或巨噬细胞。
另一方面，本发明涉及呈递本发明肽或其加工产物的细胞，其中该加工产物优选是具有给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列变体的氨基酸序列)的肽。该细胞可通过其表面的MHC分子呈递所述肽或其加工产物。在一个实施方案中，所述细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，所述细胞重组表达MHC分子。在一个实施方案中，通过向细胞添加肽使细胞的MHC分子加载(致敏)所述肽。所述细胞可以重组表达所述肽并且在细胞表面呈递所述肽或其加工产物。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞，单核细胞或巨噬细胞。
另一方面，本发明涉及对本发明的肽有反应性的免疫反应性细胞，尤其是当所述肽在细胞表面上呈递时。所述免疫反应性细胞可以是已在体外致敏以识别所述肽的细胞。所述免疫反应性细胞可以是T细胞，优选细胞毒性T细胞。优选地，所述免疫反应性细胞结合基本对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列的变体的氨基酸序列)的肽中的序列。
另一方面，本发明涉及对本发明的肽或其多肽链有反应性的T细胞受体。
另一方面,本发明涉及T细胞受体α -链或包含所述T细胞受体α-链的T细胞受体，所述 T 细胞受体 α -链包含选自 SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88， 90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194 或其变体的 T 细胞受体α -链的至少一个、优选两个、更优选全部三个⑶R序列。⑶R序列在本文给出的上述T细胞受体α-链序列中用下划线显示。
另一方面,本发明涉及T细胞受体α -链或包含所述T细胞受体α-链的T细胞受体，其中所述T细胞受体α -链序列选自SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194 或其变体。
另一方面，本发明涉及T细胞受体β -链或包含所述T细胞受体β -链的T细胞受体，所述 T 细胞受体 β-链包含选自 SEQ ID NO:5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，177，189，191，193，和 195 或其变体的 T 细胞受体β -链的至少一个、优选两个、更优选全部三个⑶R序列。⑶R序列在本文给出的上述T细胞受体链序列中用下划线显示。
另一方面，本发明涉及T细胞受体β -链或包含所述T细胞受体β -链的T细胞受体，所述 T 细胞受体 3 -链序列选自 SEQ ID NO:5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，177，189，191，193 和 195 或其变体。另一方面，本发明涉及T细胞受体，其包含:⑴T细胞受体a -链，其包含SEQ ID NO:x或其变体的T细胞受体a -链的至少一个、优选两个、更优选全部三个⑶R序列，和(ii) T细胞受体￠-链，其包含SEQ ID NO:X+1或其变体的T细胞受体￠-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个⑶R序列；其中X选自4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，3040，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194。另一方面，本发明涉及T细胞受体，其包含:⑴T细胞受体a -链，其包含SEQ ID NO:x或其变体的T细胞受体a -链序列，以及(ii)T细胞受体@ -链，其包含SEQ ID NO:X+1或其变体的T细胞受体@ -链序列；其中X 选自 4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94,96,98,100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194。上述T细胞受体优选对病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY_ES0_1、TPTE或PLACl (尤其当它们呈递于细胞(如病变细胞或抗原呈递细胞)表面时)具有特异性。另一方面，本发明涉及编码根据上述任一方面的T细胞受体链或T细胞受体的核酸。另一方面,本发明涉及包含根据上述任一方面的T细胞受体链或T细胞受体或者编码根据上述任一方面之T细胞受体链或T细胞受体的核酸的细胞。所述细胞可以是效应细胞或干细胞，优选是免疫反应性细胞。所述免疫反应性细胞可以是T细胞，优选是细胞毒性T细胞。优选地，所述免疫反应性细胞与病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY-ES0-1、TPTE或PLACl (尤其是当它们呈递在细胞(如病变细胞或抗原呈递细胞)表面上存在时)有反应性，特别是对本发明的肽有反应性并且优选与基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体)的肽中的序列结合。另外，本发明一般地包括通过靶向病变细胞治疗疾病。所述方法提供了对呈递抗原(即病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY-ES0-1、TPTE或PLAC1)的细胞的选择性消除，从而将对不呈递所述抗原的正常细胞的不良影响降到最低。因此，治疗的优选疾病是表达和呈递本文所述抗原之一的疾病，例如病毒感染性疾病或恶性疾病，特别是病毒疾病和癌症疾病，例如在本文中描述的 那些。一方面，本发明涉及药物组合物，其包含以下一种或更多种:
(i)上述的肽；(ii)上述编码肽的核酸或编码T细胞受体链或T细胞受体的核酸；(iii)上述包含编码肽的核酸的细胞,上述呈递肽或其加工产物的细胞,或者上述包含T细胞受体链或T细胞受体或核酸的细胞；(iv)上述T细胞受体；或者(V)上述免疫反应性细胞。本发明的药物组合物可以包含可药用载体并且可任选地包含一种或更多种佐剂，稳定剂等。该药物组合物可以为治疗或预防性疫苗的形式。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗或预防本文所述的病毒疾病(如hCMV感染)或恶性疾病。施用上述药物组合物可提供MHC 11类呈递表位，其能够引发针对本文所述抗原的CD4+辅助T细胞应答和/或CD8+T细胞应答。作为替代的或另外的，施用如上所述的药物组合物可提供MHC I类呈递表位，其能够引发针对本文所述的肿瘤抗原的CD8+T细胞应答。在一个实施方案中，相关的抗原是hCMV_pp65，并且本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防hCMV感染。在一个实施方案中，相关的抗原是NY-ES0-1、TPTE或PLAC1，并且本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防恶性疾病。另一方面 涉及在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象施用本发明的药物组合物。另一方面涉及用于刺激，引发(priming)和/或扩增T细胞的方法，其包括将T细胞与以下的一种或更多种接触⑴上述肽；(ii)上述编码肽的核酸；以及(iii)上述包含编码肽的核酸的细胞或者上述呈递肽或其加工产物的细胞。在这方面，本发明可涉及用于制备抗原特异性T细胞的方法。所述T细胞可以在体外或体内被刺激，引发和/或扩增。优选地，所述T细胞存在于从对象获得的样品中。被刺激，引发和/或扩增的T细胞可以向对象施用并且对于对象可以是自体(autologous)、异体(allogeneic)、同基因(syngeneic)的。用于在对象中诱导免疫应答的方法或者用于刺激，引发和/或扩增T细胞的方法的本发明上述方面可以涉及用于治疗对象的hCMV感染或恶性疾病的方法。在一个实施方案中，相关抗原是hCMV_pp65并且所述治疗是对hCMV感染的治疗或预防性治疗。在一个实施方案中，相关抗原是NY-ES0-1、TPTE或PLACl并且所述治疗是对恶性疾病的治疗或预防性治疗。在治疗恶性疾病的情况下，本文所述的物质(agent)和组合物优选这样的方式施用，其使得治疗活性物质不或基本上不被递送到这样的组织或器官，其中的细胞在所述组织或器官(尤其是睾丸组织)没有恶性疾病时表达本文所述的肿瘤相关抗原。为此,本文所描述的物质和组合物可以局部施用。本文所述的组合物和物质优选能够诱导或促进针对以下疾病的细胞应答(优选细胞毒性T细胞活性)，所述疾病的特征为以MHC I类呈递本文所述的抗原，例如病毒性疾病或恶性疾病。
一方面，本发明提供了用于本文所述治疗方法的本文所述的物质和组合物。本文所述的恶性疾病的治疗可与手术切除和/或放射和/或传统的化学治疗相联
八
口 ο另一方面，本发明涉及确定对象中免疫应答的方法，其包括在从所述对象分离的生物样品中测定T细胞与上述肽或者上述呈递肽或加工产物之细胞的反应性。所述方法可包括以下步骤:(a)用以下的一种或更多种孵育包含分离自对象之T细胞的样品:⑴上述肽；(ii)上述编码肽的核酸；以及(iii)上述包含编码肽的核酸的细胞或上述呈递肽或加工产物的细胞；以及(b)检测所述T细胞的特异性活化，由此确定所述对象中免疫应答的存在或不存在。用于确定对象中免疫应答的方法的本发明上述方面可以涉及用于在对象中诊断hCMV感染或恶性疾病的方法。在一个实施方案中，相关抗原是hCMV_pp65并且诊断是对hCMV感染的诊断。在一个实施方案中，相关抗原是NY-ES0-1、TPTE或PLACl并且诊断是对恶性疾病的诊断。在所述诊断方法的一个实施方案中，所述生物样品来自这样的组织或器官，其中的细胞在组织或器官没有疾病时基本上不表达所述相关抗原。通常，将生物样品中的T细胞水平与参照水平进行比较，其中与所述参照水平的偏离指示对象中疾病的存在和/或阶段。所述参照水平可以是在对照样品(例如，来自正常的组织或对象)中确定的水平或者可以是来自正常对象的中值水平。与所述参照水平的“偏离”表示任何显著的变化，例如增加至少10 %，20 %或30 %，优选至少40 %或50 %，或者甚至更高。优选地，所述生物样品中T细胞的存在或与参照水平相比所述生物样品中T细胞的量升高指示疾病的存在。T细胞可以从患者的外周血，淋巴结，组织样品(如来自活检和切除)或其他来源中分离。反应性测定可在原代T细胞或其他适当的衍生物上进行。例如，可以融合T细胞以产生杂交瘤。用于测量T细胞应答性的测定在本领域中是已知的，并且包括增殖测定和细胞因子释放测定。用于检测反应性T细胞的测定和指标包括但不限于使用IFN Y ELISP0T和IFNy细胞内细胞因子染色。用于确定T细胞克隆是否应答于特定肽的多种其他方法在本领域中是已知的。通常，将肽添加到T细胞悬液中一到三天的时间。可以通过增殖(例如经标记胸苷的摄取)来衡量T细胞的应答，或通过细胞因子的释放，例如IL-2。可获得检测所释放细胞因子的存在的多种测定。T细胞 细胞毒性测定可用于检测具有抗原特异性的细胞毒性T细胞。在一个实施方案中，测试细胞毒性T细胞杀伤用MHC I类分子呈递抗原之靶细胞的能力。可以标记呈递抗原的靶细胞，并将其加入到来自患者样品的T细胞悬液中。可以通过对从裂解细胞释放的标记物进行定量来测量细胞毒性。在该测定中可包括对自发释放和总释放的对照。另一方面，本发明提供了非放射性测定以监测和量化杀伤靶细胞的活性(例如通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导)。该测定可以提供对细胞毒性效应细胞活性的测量，并可以可靠地检测靶细胞的抗原特异性CTL杀伤。该测定为最常用于量化CTL应答的标准51Cr-释放测定提供了更安全的替代方式。该测定可用于研究不同细胞品系的原代宿主靶细胞的CTL介导杀伤，并为新疫苗和免疫疗法的开发提供有价值的工具。本发明涉及用于测定细胞毒活性的方法，其包括如下步骤:(i)提供包含产生报告酶之靶细胞的样品；(ii)使所述靶细胞经受待测定其细胞毒活性的物质；以及(iii)对所述样品进行检测测定以建立所述样品的有活力细胞中包含的报告酶水平。 优选地，所述细胞毒活性是细胞介导的细胞毒活性，并且待测定其细胞毒活性的物质是细胞毒性效应细胞，例如选自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞的细胞，优选细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一个实施方案中，所述报告酶是ATP依赖的。在一个实施方案中，所述报告酶是发光酶，如产生光的酶。优选地，所述报告酶是萤光素酶。在一个实施方案中，编码所述报告酶的RNA被引入所述靶细胞。所述方法还可以包括这样的步骤:向样品中添加ATP降解酶(如ATP酶)以基本上降解样品中的任何细胞外ATP。该方法还可以包括添加至少可部分渗透有活力细胞的底物的步骤。所述底物可以是发光分子并且可以是萤光素衍生物。在这个实施方案中，该方法可以包括检测样品的发光，由此检测样品中有活力细胞的数目或存在。本发明的另一些特征和优点通过下面的详细描述和权利要求将显而易见。发明详述虽然在下面详细描述本发明，但是应当理解的是，本发明并不限于本文所描述的特定方法，方案和物质，因为它们可会有所变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅以描述特定实施方案为目的，并不是为了限制本发明的范围，其仅由所附权利要求限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。在下文中，将描述本发明的要素。这些要素是通过特定的实施方案列出的，然而应当理解的是它们可以以任何方式和任何数目组合以创建另外的实施方案。不同描述的实施例和优选的实施方案不应该被解释为仅将本发明限制到明确描述的实施方案。此描述应被理解为支持和包括结合了具有任何数量公开和/或优选元素的明确描述的实施方式的实施方案。此外，除非文中另有说明，否则应当认为任何在本申请中所有描述的元素的排列和组合是本申请说明书所披露的。优选地，本文使用的术语如A multilingual glossary of biotechnologicalterms: (IUPAC Recommendations) ,H.G.ff.Leuenberger,B.Nagel,
权利要求
1.用于提供抗原特异性淋巴样细胞的方法，其包括以下步骤: (a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得； (b)提供编码T细胞受体的核酸,所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；以及 (c)将所述核酸引入淋巴样细胞中以提供所述抗原特异性淋巴样细胞。
2.用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体的方法，其包括以下步骤: (a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得； (b)提供编码T细胞受体的核酸,所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性； (C)将所述核酸引入淋巴样细胞中以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及 (d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性。
3.用于鉴定抗原中的T细胞表位的方法，其包括以下步骤: (a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得； (b)提供编码T细胞受体的核酸,所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性； (C)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及 (d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述提供编码具有所述单一抗原反应性T细胞之T细胞受体的特异性的T细胞受体的核酸的步骤包括提供编码这样的T细胞受体的核酸，其包含所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的至少CDR序列，优选至少可变区。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述对象对所述抗原或包含所述抗原的物质为血清阳性。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述单一抗原反应性T细胞使用流式细胞术从包含T细胞的样品中分离。
8.肽，其包含选自SEQID NO:108至139、172、173、175、178至187和196的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
9.编码权利要求8所述肽的核酸或者包含所述核酸的细胞。
10.呈递权利要求8所述肽或其加工产物的细胞。
11.对权利要求8所述肽有反应性的免疫反应性细胞或T细胞受体,或者所述T细胞受体的多肽链。
12.T细胞受体α -链或包含所述T细胞受体α -链的T细胞受体,其中所述T细胞受体α-链选自:(i)包含选自 SE Q ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、.40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、.90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、.162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其变体的T细胞受体α -链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体α -链，和(ii)包含选自 SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、.40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、.90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、.162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其变体的T细胞受体α-链序列的T细胞受体α -链。
13.T细胞受体β -链或包含所述T细胞受体β -链的T细胞受体,其中所述T细胞受体β-链选自:(i)包含选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、.41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、.91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、1455、147、149、151、153、155、157、159、161、.163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体β -链，和(ii)包含选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、.41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、.91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、.163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其变体的T细胞受体β -链序列的T细胞受体链。
14.T细胞受体，其选自: (I)包含以下的T细胞受体: (i)包含SEQID NO:x或其变体的T细胞受体α -链的至少一个、优选两个、更优选全部三个⑶R序列的T细胞受体α-链，和 (ii)包含SEQID NO:X+1或其变体的T细胞受体β -链的至少一个、优选两个、更优选全部三个⑶R序列的T细胞受体β-链；其中 X 选自 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、.48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、.98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、.168、170、176、188、190、192 和 194， 以及 (II)包含以下的T细胞 受体: (i)包含SEQID NO:x或其变体的T细胞受体α -链序列的T细胞受体α -链，和 (ii)包含SEQID NO:X+1或其变体的T细胞受体β -链序列的T细胞受体β -链； 其中 X 选自 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、.48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、.98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、.168、170、176、188、190、192 和 194。
15.编码权利要求11至14中任一项所述T细胞受体链或T细胞受体的核酸,或者包含权利要求11至14中任一项所述T细胞受体链或T细胞受体或所述核酸的细胞。
16.药物组合物，其包含以下的一种或更多种: (i)权利要求8所述的肽； (ii)权利要求9或15所述的核酸； (iii)权利要求9、10和15中任一项所述的细胞； (iv)权利要求11所述的免疫反应性细胞；以及 (V)权利要求11至14中任一项所述的T细胞受体。
17.在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象施用权利要求16的药物组合物。
18.刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，其包括将T细胞与以下的一种或更多种接触: (i)权利要求8所述的肽； (ii)权利要求9所述的核酸；和 (iii)权利要求9或10所述的细胞。
19.测定对象中的免疫应答的方法，其包括测定从所述对象分离的生物样品中与权利要求8所述肽或权利要求10所述细胞有反应性的T细胞。
20.测定细胞毒活性的方法，其包括以下步骤: (i)提供包含产生报告酶之靶细胞的样品； (ii)使所述靶细胞接触待测定 其细胞毒活性的物质；以及 ii)对所述样品进行检测测定以建立所述样品的有活力细胞中包含的报告酶水平。
全文摘要
本发明涉及用于提供抗原特异性淋巴样细胞的有效方法。这些淋巴样细胞可以用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体和用于鉴定免疫相关T细胞表位。此外，本发明涉及抗原特异性T细胞受体和T细胞表位以及它们在免疫治疗中的用途。
文档编号C07K14/045GK103249430SQ201180045314
公开日2013年8月14日 申请日期2011年9月19日 优先权日2010年9月20日
发明者乌尔·沙欣, 厄兹莱姆·图雷奇, 彼得拉·西蒙, 塔纳·欧莫科科 申请人:生物技术公司, 约翰·古腾堡大学美因兹医学大学, 约翰·古腾堡大学美因兹医学大学转化肿瘤学公司