专利名称：重组乙肝病毒免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程药物领域，具体的方法是利用人基因工程抗体库技术，制备一种乙型肝炎病毒的特异性免疫球蛋白，涉及28kDa人源单链抗体FV，52kDa抗体片段Fab和150kDa全分子抗体，以及它们在制备治疗、预防、乙肝病毒药，和诊断试剂盒中的应用。
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界性疾病，据统计全球携带乙肝表面抗原(HBsAg)的人数超过2.8亿。我国是乙肝高流行地区，有40-60％的人群受过HBV感染，约有1.2亿人携带乙肝病毒表面抗原。携带乙肝病毒的孕产妇可将病毒传给新生儿。而且生命越早期感染乙肝病毒越容易形成持续携带者，不仅可导致慢性肝病，其中一部分还可以发展成肝硬化和肝癌。
预防乙型肝炎有两种生物制品一种是乙肝疫苗，可提供主动免疫，用于接触前后的预防。另一种是乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)，提供暂时的被动保护作用，用于某些接触后人群的预防。单用乙肝疫苗对母婴传播的阻断率为50-75％，而用HBIG和乙肝疫苗联合免疫，可使母婴传播阻断率达到97％以上。另外，HBIG还可以用于输血后乙肝的预防和意外事故的紧急预防，临床上用HBIG治疗乙肝也取得较好的效果。总之，HBIG是一种预防乙肝的重要制品。它在乙肝预防和被动免疫治疗方面的作用是肯定的。
长期以来国内外所用的HBIG绝大多数是来自于经乙肝疫苗免疫健康人后采集高价血浆或血清分离提取免疫球蛋白制成的，属于血液制品。近年来由于血传疾病不断发现，大面积使用HBIG存在着一定的潜在危险。自从1996年中国卫生部门禁止使用HBIG的血液制品后，目前对于输血后乙肝的预防以及意外事故的紧急预防缺少有效的预防措施。
本发明正是在这种市场急需的情况下，研制出高效重组免疫球蛋白。这种全分子人源乙肝抗体与血液制品相比，其特点表现在以下几个方面(1)不需要免疫血清，解决了由于免疫血清来源短缺而受到限制的问题；(2)避免了血液制品HBIG经血液传播疾病的危险；(3)本发明的化学本质属人源蛋白质，可以直接应用于人体而不引起机体的免疫排斥反应；适应于大规模工业化生产，能够提高产量，降低成本；(4)本发明及其衍生物能够制备检测乙肝表面抗原的试剂合，用于乙肝的诊断。
本发明是利用抗体基因文库和基因工程抗体技术，研制出的不同形式的抗乙肝病毒表面抗原高效免疫球蛋白，即人源基因工程单链抗体，抗体Fab和全分子抗体。这些抗体在分子结构、分子量和功能方面均有不同。单链抗体是由抗体的重链可变区和轻链可变区组成，分子量为28kDa，具有一个结合抗原的功能区。由于它分子量小，便于与其它功能分子连接形成双功能分子，用于乙肝的诊断和治疗。抗体Fab是由抗体的重链可变区和第一恒定区以及轻链组成，分子量为52kDa，具有单链抗体的所有特征。但是，与单链抗体相比，抗体Fab具有较高的亲和力和稳定性。全分子免疫球蛋白是由两条重链和两条轻链组成的完整抗体，分子量为150kDa，含有两个抗原结合功能区和一个效应功能区。该抗体与上述两种相比，其特征表现为(1)亲和力和稳定性最好；(2)不仅能够特异识别抗原，而且能够诱发补体依赖性细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)；(3)分子稳定性好，体内半衰期长。然而，这些抗体所共有的特征是(1)抗体的生化性质属于人源蛋白质。当它们应用于临床时，不应对人体产生不良反应；(2)都具有特异识别并高效结合乙肝病毒表面抗原，而不与人体重要器官发生任何交叉反应；(3)都属于基因工程产品，具有稳定性好、易于保存、适应于大规模工业化生产的优点。另外，还避免了经血液传播疾病的潜在危险性；(4)抗体及其衍生物和偶联物都能够制备乙肝表面抗原检测试剂合，用于乙肝的诊断。
本发明的具体技术方案是首先构建乙肝病毒特异人抗体库。从接受乙肝疫苗免疫的人外周血淋巴细胞中提取mRNA。反转录成cDNA第一链。设计一套核甘酸引物(Antibody Engineering，edited by Carl A.K.Borrebaeck，1995 New York Oxford)用PCR方法扩增人抗体轻、重链可变区基因片段。通过一段编码(Gly4Ser)3的DNA序列把VH和VL连接起来，构成VH-Linker-VL融合基因，将这一融合基因插入到噬粒表达载体中，与噬菌体外壳蛋白基因融合，感染大肠杆菌并使抗体片段表达展示于噬菌体的表面，形成噬菌体人抗体文库。以乙肝病毒表面抗原(HbsAg)为靶抗原，采用免疫亲和筛选对抗体库进行多轮筛选，从中获得特异结合HBsAg的高亲和力单链抗体。
在单链抗体的基础上，将轻、重链可变区基因片段分别克隆到一个含有人抗体恒定区基因的表达载体中，转染哺乳细胞(CHO)，在选择性培养基中筛选表达抗体的工程细胞，并用稀释法对工程细胞进一步克隆，筛选高表达的单克隆工程细胞株。表达抗体量约为10μg/ml。用ProteinA-Sepharose亲和层析从培养上清中纯化抗体，纯化率达98％以上。
抗体Fab的制备是直接利用一套引物(Antibody Engineering，edited byCarl A.K.Borrebaeck，1995 New York Oxford)，以免疫淋巴细胞cDNA为模板，分别用PCR扩增抗体轻链基因和重链Fd(抗体重链可变区和恒定区CH1)基因，并把两个基因克隆到pComb3H表达载体上，形成Fab-pCom3H重组质粒。后者转入大肠杆菌，用含氨苄青霉素选择性培养基筛选重组菌。用IPTG诱导重组菌表达可溶性抗体Fab。从胞周质中分离纯化抗体Fab。
用ELISA和免疫印记法鉴定各种抗体的免疫活性和生物活性。实验结果显示各种抗体均特异结合乙肝病毒表面抗原，而不与人体正常组织(如心、肝、脾、肺、肾)发生任何交叉反应。
动物毒性实验结果表明，无论是单链抗体、抗体Fab、还是全分子抗体腹腔注射BALB/c小鼠，每只小鼠注射1个人用剂量(200个国际单位)，连续观察7天，小鼠没有发生任何异常反应。这一实验结果提示本产品安全实验合格。
实施例一乙型肝炎病毒单链抗体的研制
1.采集乙肝疫苗免疫者外周血淋巴细胞，在加强免疫注射2次HbsAg疫苗(北京生物制品研究所生产)后取血120ml，抗体的滴度达1∶900。用淋巴细胞分层液(医科院天津血研所生产)分离淋巴细胞。用快速制备、纯化mRNA试剂盒(Promega)从细胞中分离与纯化mRNA。以纯化的mRNA为模板，反转录合成第一链cDNA。
2.用PCR方法以cDNA为模板，扩增抗体可变区基因。在PCR反应体系中分别加入一套轻链或重链可变区引物，10×PCR缓冲液5μl，dNTP终浓度为2.5mM，混匀后经100℃变性5min，加入2单位Taq DNA聚合酶。总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环的条件是94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃中保温10min。反应结束后，分别从重、轻链可变区PCR反应体系中取出3μl走1.5％琼脂糖凝胶电泳，其余部分用SephaglesTMBandprep Kit回收。
3.单链抗体基因的组装及扩增回收的VH和VL基因片段与连接引物在等摩尔或接近等摩尔浓度条件下，加入2.5mM dNTP和5单位TaqDNA聚合酶，10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgCl22.5μl，反应体积为25μl，用液体石蜡油封闭后进行7个退火循环，每个循环的反应条件为94℃变性30秒，64℃退火4分钟。组装成VH-linker-VL单链抗体(scFv)基因，并以此为模板，在上述反应体积中，加入一对5’端含Sfi I，3’端含Not I酶切位点的引物，进行30个PCR循环，每个循环的条件是94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟，最后一次循环后在72℃保温10分钟。从scFv基因PCR扩增反应体系中取出3μl走1.2％琼脂糖凝胶电泳，其余部分用上述回收试剂盒回收。
4.单链抗体基因库的建立回收后的scFv基因分别经过双酶切的质粒pCAMTNB5E连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞。在培养液2×YT-G(1.7％Bacto-trypone，1％Bacto-yeast extract，0.5％NaCl，2％葡萄糖)中培养转化菌。小部分(约1/10体积)转化菌以13％甘油保存于-70℃。
5.重组噬菌体抗体的表达及免疫亲和筛选剩余的转化菌用10ml2×YT-G稀释，并在37℃培养至OD600值为0.5。然后加氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml，M13KO7至终浓度为2×109pfu/ml，37℃培养1小时，离心。菌体沉淀重悬于10ml 2×YT-AK(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×YT)培养液中，于37℃培养过夜，离心收集含有重组噬菌体的上清。
将含有重组噬菌体的上清与包被在培养皿上的HBsAg抗原一起于37℃孵育1小时。用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗平皿20次，PBS洗平皿20次。加100mM三乙胺1ml洗脱结合在平皿上的重组噬菌体抗体，立即用1M Tris-HCl，pH9中和并收集洗脱下来的重组噬菌体。重复上述感染-扩增-筛选过程3轮。
5.重组噬菌体抗体的制备与鉴定取第三轮洗脱下来的重组噬菌体抗体100μl和对数生长期的TG1细胞200μl，混匀后于37℃摇床培养30分钟，将感染细胞用2×YT做倍比稀释(1∶10，1∶100，1∶1000)后，涂布在SOBAG(2％Bacto-trypone，0.5％Bacto-yeast extract，0.05％NaCl，10mMMgCl2，2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素，1.5％Bacto-Agar)固体培养基上于30℃培养过夜。从平板上随机挑72个单菌落，分别接种到100μl2×YT-AG(含100μg/ml氨苄青霉素，2％葡萄糖的2×YT)培养液中，30℃培养过夜。次日分别取20μl过夜菌转接到新的1.5ml离心管中，含200μl2×YT-AG和5×108pfu/ml M13KO7。37℃培养2小时，离心，用200μl2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养液分别悬浮每个离心管中的沉淀细胞，于37℃培养过夜。离心并收集上清。
用抗原HBsAg包被96孔酶联板，包被液为0.05M Na2CO3(pH9.6)，抗原浓度为10μg/ml，每孔加包被液100μl，4℃过夜。加封闭液(1.5％BSA溶于PBS中)，于室温封闭1小时。把100μl重组噬菌体抗体上清与封闭液等体积混合，室温放置10分钟后加入到包被的酶联板上，37℃温育1小时。以M13噬菌体为阴性对照，用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。加100μl抗M13噬菌体并用辣根过氧化物酶标记的IgG-HRP(1∶5000)，阳性对照孔加100μl羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应1小时，用PBST洗板3次，PBS洗板3次。加底物OPD-H2O2100μl，室温作用20分钟，加50μl 2M H2SO4终止反应，在490nm处检测每孔的光吸收值。从中选择几株活性较高的克隆，设平行孔重复上述结果，最后确定一株活性最强的阳性克隆。
6.阳性克隆重组质粒的鉴定及其DNA序列分析提取重组质粒，分别用Sfi I和NotI限制性内切酶消化。酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析。用T7 DNA SequenceTMKit测定该重组质粒上scFv基因的DNA序列。结果表明scFv基因是由807个核甘酸组成，根据DNA序列推导出的乙肝免疫球蛋白氨基酸序列如下所示。
1 Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg1617 Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala3233 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Ser4849 Ala Ser Ala Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly6465 Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp8081 Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gly Ser Tyr Pro Leu Thr Phe9697 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly112113 Ser Arg Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu128129 Asp Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Gly Ser Leu Thr Leu144145 Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Glu Tyr Ala Val Ser Trp160161 Gly Arg His Ala Leu Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ile176177 Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Leu192193 Ile Ile Ser Arg Asp Thr Ser Arg Lys Met Leu Phe Leu Gln Met Asn208209 Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Lys224225 Met Val Arg Gly Gly Tyr Trp Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln240241 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser256257 Glu Glu Asp Leu Gly Ser His His His His His His2767.将单链抗体基因亚克隆到pComB载体上，转化大肠杆菌进行可溶性单链抗体的表达。用含1mM IPTG的培养液诱导3小时，离心收集上清。裂解胞周质。用抗His-Tag抗体(Phamacia)检测可溶性单链抗体。ELISA和Western Blot实验均证明可溶性scFv抗体能够与HbsAg结合，而不与其它蛋白质结合。
本发明可以在制备治疗和预防乙肝病毒药和诊断试剂盒中的应用。
实施例二乙肝抗体Fab的制备制备乙肝抗体Fab的基本方法如同上述的单链抗体。也是以免疫外周血淋巴细胞的cDNA为模板，用PCR扩增抗体轻链(κ)和重链可变区及第一恒定区(Fd)。所不同的是在PCR反应体系中加入一套不同的引物，PCR扩增获得κ和Fd基因，并把这些基因克隆到噬菌体表达载体上，通过免疫-筛选-扩增的方法，获得高亲和力抗体Fab。核苷酸序列分析获得抗体轻链κ和重链Fd的基因序列，根据该基因推导出的氨基酸序列如下乙肝病毒抗体κ链氨基酸序列1 Asp Ile Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg1617 Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala3233 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Ser4849 Ala Ser Ala Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly6465 Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp8081 Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gly Ser Tyr Pro Leu Thr Phe9697 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ala Ser Val Phe Ile 112113 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 128129 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 144145 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 160161 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 176177 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 192193 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 208209 Cys 227乙肝病毒抗体重链Fd氨基酸序列
Glu Phe Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro GlyGly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr AlaVal Ser Trp Gly Arg His Ala Leu Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr IleIle Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Leu IleIle Ser Arg Asp Thr Ser Arg Lys Met Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu ArgAla Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Lys Met Val Arg Gly GlyTyr Trp Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val SerSer Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PhePro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly CysLeu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Ser AlaLeu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu TyrSer Leu Thr Ala Trp Tyr Pro Cys Pro Pro Thr Ala Trp Ala Arg Arg Pro Thr从胞周质中分离纯化抗体Fab。通过ELISA和免疫印记检测全分子抗体的免疫活性和交叉反应。结果显示该抗体特异结合乙肝病毒表面抗原，不与人体正常组织发生交叉反应。
实施例三乙型肝炎病毒全分子人抗体在单链抗体的基础上，将抗体轻、重链可变区基因分别克隆到一个含有人抗体恒定区基因的表达载体中，转染哺乳细胞(CHO)，在选择性培养基中筛选表达抗体的工程细胞，并用稀释法对工程细胞进一步克隆，筛选高表达的单克隆工程细胞株。具体实施过程如下用含有XbaI和BamHI酶切位点的引物扩增VL基因，同样用含有XhoI和HindIII酶切位点的引物扩增VH基因。分别把VL和VH基因与表达载体pdHL2.4连接，首先构建pdHl2.4-VL重组质粒，再装入VH基因，建成pdHL-IgG重组质粒。经双酶切和PCR鉴定，证明VL和VH基因全部克隆到了完整抗体真核表达载体上。表达载体pdHl2.4带有来自pBR322的部分序列，以方便在大肠杆菌中进行基因操作，插入抗体基因。另外，pdhl2.4有两个真核转录单位，分别负责抗体重链和轻链基因的转录，包括鼠金属硫蛋白-1(MT-1)启动子、鼠IgG重链增强子、MT-1的5’非翻译序列、抗体基因的转录终止信号和polyA加尾信号，以及二氢叶酸还原酶(dhfr)选择标记基因。除具备以上一般真核细胞表达载体的功能元件外，pdHl2.4中还包括抗体重链IgG1和轻链κ的恒定区基因，基因之间有内含子。
将重组质粒转化到大肠杆菌中扩增，并分离纯化重组质粒。用lipofectin将含有抗体基因的重组质粒导入哺乳动物细胞CHO中，用MTX选择性培养基筛选转化细胞，获得转乙肝抗体全分子基因细胞株。用ELISA鉴定工程细胞分泌抗体的情况，筛选表达活性高并且表达稳定性的细胞株。将这些细胞株进一步克隆化筛选，获得高表达株，表达抗体量约为10μg/ml。用Protein A-Sepharose亲和层析从培养上清中纯化抗体，纯化率达98％以上。
建立种子细胞库，工程细胞稳定表达全分子基因工程抗体，按《生物制品无菌实验规程》进行无菌实验。结果表明工程细胞无细菌和支原体污染。
通过ELISA和免疫印记检测全分子抗体的免疫活性和交叉反应。结果显示该抗体特异结合乙肝病毒表面抗原，亲和力Ka≌9.1×108M-1。不与人体正常组织(如心、肝、脾、肺、肾)发生任何交叉反应。
动物毒性实验结果表明，无论是单链抗体还是全分子抗体腹腔注射BALB/c小鼠，每只小鼠注射1个人用剂量(200个国际单位)，连续观察7天，小鼠没有发生任何异常反应。这一实验结果提示本产品安全实验合格。
权利要求
1.一种乙肝病毒免疫球蛋白，其特征在于可变区Fv是具有28kDa的免疫球蛋白。
2.一种乙肝病毒免疫球蛋白，其特征在于Fab是具有52kDa的免疫球蛋白。
3.一种乙肝病毒免疫球蛋白，其特征在于全分子抗体具有150kDa的免疫球蛋白。
4.根据权利要求1所述的可变区Fv，具有如下所示的28kDa的免疫球蛋白的氨基酸序列，乙肝病毒单链抗体Fv，由抗体的重链可变区和轻链可变区组成，该抗体基因推导出的氨基酸序列如下1 Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg1617 Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala3233 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Ser4849 Ala Ser Ala Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly6465 Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp8081 Ser Ala Thr Thr Thr Cys Gln Gln Leu Gly Ser Tyr Pro Leu Thr Phe9697 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly112113 Ser Arg Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu128129 Asp Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ala Gly Ser Leu Thr Leu144145 Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Glu Tyr Ala Val Ser Trp160161 Gly Arg His Ala Leu Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ile176177 Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Leu192193 Ile Ile Ser Arg Asp Thr Ser Arg Lys Met Leu Phe Leu Gln Met Asn208209 Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Lys224225 Met Val Arg Gly Gly Tyr Trp Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln240241 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser256257 Glu Glu Asp Leu Gly Ser His His His His His His276
5.根据权利要求2所述的Fab，具有如下所示的52kDa的免疫球蛋白的氨基酸序列，乙肝病毒抗体κ链氨基酸序列1 Asp Ile Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg1617 Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala3233 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Ser4849 Ala Ser Ala Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly6465 Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp8081 Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gly Ser Tyr Pro Leu Thr Phe9697 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ala Ser Val Phe Ile112113 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val128129 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys144145 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu160161 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu176177 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr192193 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu208209 Cys227乙肝病毒抗体重链Fd氨基酸序列Glu Phe Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro GlyGly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr AlaVal Ser Trp Gly Arg His Ala Leu Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr IleIle Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Leu IleIle Ser Arg Asp Thr Ser Arg Lys Met Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu ArgAla Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Lys Met Val Arg Gly GlyTyr Trp Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val SerSer Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PhePro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly CysLeu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Ser AlaLeu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu TyrSer Leu Thr Ala Trp Tyr Pro Cys Pro Pro Thr Ala Trp Ala Arg Arg Pro Thr
6.一种根据权利要求3所述的150kDa的全分子抗体免疫球蛋白，含有权利要求4和5所述的氨基酸序列。
7.一种根据权利要求4、5、6所述的免疫球蛋白衍生物或偶联物。
8.根据权利要求4、5、6、7所述的免疫球蛋白及其衍生物和偶联物在制备治疗、预防乙肝病毒药和制备乙肝病毒表面抗原诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明是一种高技术生物工程产品,包括三种不同结构的乙肝高效免疫球蛋白(乙肝抗体),既抗乙肝病毒单链抗体、抗体Fab和全分子抗体。其主要特征在于:(1)这些抗体能够特异结合乙肝表面抗原,可通过中和乙肝病毒而起到预防和辅助治疗乙型肝炎的作用;(2)抗体属人源蛋白质,可以直接应用于人体而不引起机体的免疫排斥反应;(3)属基因工程产品,不仅避免了血源制品易传播病原的危险,而且具有基因稳定和易于大规模生产的优点;(4)本发明的抗体及其衍生物可制备检测乙肝表面抗原的试剂合,用于乙肝的诊断。
文档编号G01N33/68GK1380340SQ0111052
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月9日 优先权日2001年4月9日
发明者阎锡蕴, 杨东玲, 吴小平 申请人:中国科学院微生物研究所