专利名称：抗禽流感病毒免疫球蛋白、制备方法和其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫球蛋白、及其制备方法和制剂形式，更具体地说，涉及一种抗禽流感病毒免疫球蛋白、其制备方法及其制剂形式。
背景技术：
从1997年至今，亚洲多个国家和地区暴发了高致病性禽流感，而且这场疫情至今还没有得到控制。禽流感在亚洲国家和地区的扩散、蔓延给人类生命带来威胁，造成严重的经济损失。与SARS相比，禽流感所带来的潜在危害更令人担忧。如果不采取有效措施，禽流感很有可能出现全球性大流行。2003年底以来，泰国、越南、中国等国家均报告发生禽流感疫情。截至目前，全球共报告43例人感染禽流感病例，其中33人死亡，死亡率极高。
禽流感的病原体是甲型流感病毒的H5N1、H7N7、H9N2亚型病毒。1997年香港的禽流感与目前亚洲10个国家和地区发生的禽流感，病原体都相同。H5N1型禽流感病毒是人与动物共患的流感病毒，容易引起世界性大流行。由于流感病毒多变异，因而导致甲型流感反复发生，难以彻底根除。禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成。这8个片段编码10个病毒蛋白，其中，8个是病毒粒子的组成成分--HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA，另两个是分子质量最小的RNA片段，编码两个非结构蛋白--NS1和NS2。NS1与胞浆包含体有关，但对NS1和NS2的功能目前尚不清楚。禽流感病毒一般为球形，直径为80～120纳米，但也常有同样直径的丝状形态，长短不一。病毒表面有10～12纳米的密集钉状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。两种不同形状的表面钉状物是HA(棒状三聚体)和NA(蘑菇形四聚体)。
免疫球蛋白制剂是最常见的免疫血清，免疫球蛋白制剂有破伤风抗毒素、白喉抗毒素、气性坏疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗炭疽血清、抗爱博拉病毒血清等。目前，市场上常见的球蛋白制剂有抗狂犬病血清、抗蛇血清等。抗狂犬病血清由狂犬病病毒免疫马，经胃蛋白酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。用于配合抗狂犬病疫苗对被疯动物严重咬伤如头、脸、颈部或多部位咬伤者进行预防注射，被疯动物咬伤后注射越早越好，咬后48小时之内注射，可减少发病率。抗蛇毒血清用蛇毒免疫马后的马血浆精制而成，供治疗毒蛇咬伤者之用。
目前，人们主要用禽流感疫苗来预防动物的禽流感，但疫苗的效果并不理想，至今仍未有用于禽流感治疗的特效药物。也有研究者制得抗禽流感病毒的卵黄抗体用于禽类的禽流感病毒感染治疗和预防，例如，专利申请号为CN02113744.7的专利申请，公开了一种抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体及其制备方法。但未有能够用于人类的治疗和预防的禽流感药物。
为了更快、更有效地控制禽流感疫情的发生，有必要对能够对禽流感起到有效地预防和治疗作用的药物进行更深入地研究。
发明内容
本发明提供了一种抗禽流感病毒的免疫球蛋白，可以用于人或动物的禽流感预防、诊断和治疗，填补了目前未有防治人类禽流感的有效药物的空白。
本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白，是抗禽流感病毒免疫球蛋白G(IgG)和/或抗禽流感病毒免疫球蛋白G的有效片段[(Fab)2片段]；这种抗禽流感病毒免疫球蛋白是从动物的血清和/或血浆中提取出来的，上述的动物是经灭活的禽流感病毒与免疫佐剂的混合物和/或禽流感疫苗免疫接种的动物。
从动物的血清和/或血浆中分离抗禽流感病毒免疫球蛋白可采用现有的免疫球蛋白分离方法。本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白G可以采用以下方法来制备(1)用灭活的禽流感病毒与免疫佐剂的混合物和/或禽流感疫苗对动物进行免疫接种；(2)采集经步骤(1)免疫接种的动物的血液；(3)从步骤(2)得到的动物血液中分离出血清和/或血浆；(4)采用硫酸铵沉淀或辛酸沉淀法沉淀步骤(3)得到的血清和/或血浆中的抗禽流感病毒免疫球蛋白G；(5)通过柱层析法，对步骤(4)得到的抗禽流感病毒免疫球蛋白G进行提纯。
而本发明抗禽流感病毒免疫球蛋白G的(Fab)2片段既可以采用现有免疫球蛋白制备方法制备，也可以采用本发明的第二个发明目的中提供的制备方法来制备。采用现有方法可以按以下步骤操作(1)灭活的禽流感病毒与免疫佐剂的混合物和/或禽流感疫苗对动物进行免疫接种；(2)采集经步骤(1)免疫接种的动物的血液；(3)从步骤(2)得到的动物血液中分离出血清和/或血浆；(4)采用硫酸铵沉淀或辛酸沉淀法沉淀步骤(3)得到的血清和/或血浆中的抗禽流感病毒免疫球蛋白G；(5)用胃蛋白酶直接对步骤(3)得到的血清和/或血浆中的免疫球蛋白G进行消化；(6)采用柱层析，对步骤(5)得到的物质进行提纯，得到抗禽流感病毒免疫球蛋白G的(Fab)2片段。
本发明采用的免疫动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴、马等，优选为马、羊、牛或猪，更优选为马。
本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白的中和抗体效价一般在1∶1024-1∶10240的范围，可以达到1∶2048-1∶10240。这里所说的中和抗体效价，是对免疫球蛋白进行浓缩前测得的，浓缩后效价还可以进一步提高。此外，所采用的免疫佐剂的种类和使用次数都会对效价产生影响，免疫佐剂使用次数越多，效价一般会越高。本发明采用的免疫佐剂可以是氟氏佐剂(Freund’s adjuvant)、氢氧化铝、CpG等，其中，氟氏佐剂包括氟氏完全佐剂(FCA)和氟氏不完全佐剂(FIA)。优选地，采用氟氏佐剂。更优选地，对动物的第一次免疫采用FCA+灭活禽流感疫苗，第二次以上免疫采用FIA+灭活禽流感疫苗。
现有禽流感病毒主要是H5型、H7型、H9型的，更具体地说，是H5N1、H7N7和H9N2型禽流感病毒。本发明既可以采用H5型、H7型、H9型禽流感病毒或其组合与免疫佐剂的混合物来免疫动物，以获得高免血清；也可以直接采用含有上述病毒或其组合的疫苗来免疫动物。因此，本发明抗禽流感病毒免疫球蛋白能抗H5型、H7型、H9型一种禽流感病毒或一种以上型号的禽流感病毒的组合。当然，也可以是其他病毒型的禽流感病毒或其组合。
本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白可用于人或动物的禽流感预防和治疗以及诊断，其中，免疫球蛋白G可同时用于禽流感的诊断和防治，免疫球蛋白G的(Fab)2片段主要用于禽流感病毒的防治。虽然本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白源自于动物的血清或血浆，没有经过人源化，存在着可能使人体产生致敏反应的不足，但它与直接使用高免血清相比，已大大地降低了致敏反应的发生率。本发明的免疫球蛋白G(Fab)2片段比本发明的免疫球蛋白G更不易引起致敏反应。本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白特异性强，对提高人体抗禽流感病毒感染能力的效果明显，与其他病毒或微生物无交叉反应，从而填补了人类禽流感治疗无有效和特效药物的空白。
本发明的第二个目的是提供一种制备抗禽流感免疫球蛋白方法。该方法所制得的抗禽流感免疫球蛋白是抗禽流感病毒免疫球蛋白G的(Fab)2片段，所制得的(Fab)2片段在产率和纯度方面都要高于采用常规的方法，如硫酸铵盐析和柱层析法制得的(Fab)2片段。
本发明的制备方法包括以下步骤(1)用灭活的禽流感病毒与免疫佐剂的混合物和/或禽流感疫苗对动物体进行免疫接种；(2)采集经步骤(1)免疫接种的动物的血液；(3)从步骤(2)得到的动物血液中分离出血清和/或血浆；(4)用胃蛋白酶直接对步骤(3)得到的血清和/或血浆中的免疫球蛋白G进行消化；(5)采用切向流超滤系统，除去步骤(4)得到的混合物中的低分子量的消化产物；(6)采用柱层析，对步骤(5)得到的物质进行提纯；(7)采用切向流超滤系统，对步骤(6)得到的物质进行浓缩，制得免疫球蛋白G的有效片段。
在进行上述步骤(1)操作以前，还可以包括对禽流感病毒进行扩增的步骤。
步骤(1)既可以采用未灭活的禽流感病毒，先将其灭活，然后将灭活的病毒与免疫佐剂混合，用该混合物来作免疫抗原，也可以直接使用禽流感疫苗作为抗原，给动物进行注射。将灭活后的禽流感病毒与免疫佐剂混合的目的是加强免疫效果以及获得高含量的抗体。
禽流感病毒的灭活方法主要有甲醛灭活法、β-丙内脂灭活法和温度灭活法。本发明的禽流感病毒可以采用上述这些方法灭活。甲醛灭活法的优点是它能更有效地灭活病毒，且在灭活前后，病毒的抗原性不受影响。甲醛灭活法的关键是控制甲醛的浓度和灭活时间，温度灭活法的关键是控制灭活温度。如果选用甲醛灭活法，则甲醛的浓度可以控制在0.1％-1.00％的范围内，优选为0.15％-0.60％，灭活的时间为几小时至几十小时。优选地，采用0.25％的甲醛灭活24小时以上，或者0.4％的甲醛灭活2小时以上。虽然这两种灭活条件都可以使禽流感病毒丧失感染性，灭活率为100％，且病毒的灭活前后抗原性不受影响，但是，由于采用0.2％的甲醛作用24小时后，还能检测出高拷贝的核酸，因此更优选地，采用0.4％的甲醛灭活2小时以上。如果选用温度灭活，则灭活温度优选在46℃-66℃范围内，灭活时间一般控制在10-180分钟范围内，可选择在水浴中进行灭活。此外，病毒在灭活后，有必要对禽流感病毒进行检测，在确保病毒已丧失致病能力后，才能用于免疫动物。
在步骤(1)中所采用的免疫佐剂可以是氟氏佐剂(Freund’sadjuvant)、氢氧化铝、CpG等，其中，氟氏佐剂包括氟氏完全佐剂(FCA)和氟氏不完全佐剂(FIA)。优选地，采用氟氏佐剂。更优选地，对动物的第一次免疫采用FCA+灭活禽流感疫苗，第二次或以后几次的免疫采用FIA+灭活禽流感疫苗。所采用的免疫动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴、马等，优选为马、羊、牛或猪，更优选为马。
在步骤(3)中，从血液中分离血清和/或血浆的方法可以是自然分层法、离心法等。
步骤(4)采用了酶消化法直接对免疫血清和/或血浆中IgG进行消化，没有采用像提取(Fab)2片段的常规方法那样，先用硫酸铵盐析法或辛酸沉淀法从血清中提取IgG，再用酶对IgG进行消化。所用的酶通常是胃蛋白酶。
步骤(5)和(6)操作的目的是对消化产物——(Fab)2片段进行提纯。在步骤(6)中所采用的柱层析法既可以是离子交换法，也可以是分子筛层析法，更具体来说，所采用的离子交换法可以是阴离子或阳离子交换法；所采用的分子筛层析法可以是DEAE柱层析、凝胶滤过层析或蛋白A柱层析。
在步骤(7)中所采用的浓缩方法还可以是PEG浓缩法。但本发明优选采用切向流超滤浓缩法。
本发明所采用的球蛋白G有效片段既可以是含有球蛋白G有效片段的溶液，也可以是通过步骤(8)的操作——对步骤(7)得到的免疫球蛋白G有效片段进行冷冻干燥，得到干燥的球蛋白G有效片段。
此外，本发明的制备方法还可以包括对进行血清、IgG以及(Fab)2片段的鉴定和活性检测，例如，蛋白测定法检测其浓度；用血凝抑制试验(HI)检测血凝抑制效价；用中和抗体法检测血清、IgG以及(Fab)2片段，得到禽流感病毒的效价。本发明所采用的检测方法优选为禽流感病毒检测的国家标准中记载的方法。
本发明的制备方法基于以下原理灭活的禽流感病毒中的抗原成分可以诱导和刺激动物产生高滴度的中和抗体，而这种中和抗体又可以在体内与禽流感病毒特异结合，中和进入体内禽流感病毒而达到治疗的目的。根据这一原理，本发明的发明人利用临床分离获得的禽流感病毒或从受禽流感病毒感染的禽类体内分离的禽流感病毒，灭活后制得灭活疫苗，然后与具有加强免疫刺激效果的免疫佐剂一起注射到马、羊、猪等动物体内，在证实免疫动物体内已产生抗体后，从免疫动物血液中提取血清或血浆成份，再从血清和/或血浆中提取特异的免疫球蛋白。
本发明的制备方法的特点是采用了直接对血浆和/或血清中的免疫球蛋白G进行酶消化，从而将IgG消化为(Fab)2片段和Fc片段；还采用了切向流超滤系统(Tangential-flowultrafiltration)，先采用该系统除去低分子量的消化产物，然后将去除了小分子并富含(Fab)2的产物经过阴离子柱层析，去除胃蛋白酶和其它的无效成份，再经过切向流超滤系统对产物进行浓缩，得到浓缩后(Fab)2片段。该方法得到的(Fab)2产率较高，1L血清中可以获得约19-21g的(Fab)2。然而如果采用常规的硫酸铵沉淀，然后对IgG进行酶消化得到(Fab)2的方法，则1L血清中仅能提取出约13-15g的(Fab)2。而且，硫酸铵盐析法沉淀IgG后，IgG中的铵离子无法除去，存在用药安全性隐患。
本发明的制备方法采用了酶消化法和切向流超滤系统，可从1L血清中提取出约19-21g的(Fab)2，比提取免疫球蛋白常采用的硫酸铵盐析法得到的(Fab)2的产率要高。
本发明的第三个目的是提供一种抗禽流感病毒免疫球蛋白制剂。
本发明的抗禽流感病毒疫球蛋白制剂中含有本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白G有效片段，以及药学上可以接受的辅料。
本发明的制剂包括冻干粉针、液体注射制剂、喷雾制剂。其中，本发明的液体注射制剂可以用于静脉注射、肌肉注射、皮下注射。本发明的抗禽流感病毒免疫球蛋白喷雾剂可以作用于粘膜组织，尤其适合作用于鼻腔粘膜组织，是一种携带、使用方便的剂型。
本发明的抗禽流感病毒疫球蛋白制剂可用于被禽流感病毒感染的病人的治疗、以及疑似病人、禽流感病毒感染的接触者等高危人群的预防，同时还可以用于动物禽流感的紧急预防接种和治疗。
以下结合实施例，来进一步说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例，任何依照本发明的基本精神的改造或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
具体实施例方式
实施例中使用的动物选择3-5岁膘情好、未经免疫的深色马(用红棕色或黑色，而白色、青色马不用)，免疫前饲养90天以上，进行马传贫、鼻疽、布病检查，选出健康的马用与动物免疫。
动物的饲养场所选择与管理选择远离其它动物饲养场所的圈舍作为饲养场所，动物进入一周前进行消毒。动物专人饲养，器械及用具专用。动物排泄物进行无害化处理。
实施例中所采用的部分材料氟氏完全佐剂(FCA)与不完全佐剂(FIA)均为Sigma公司的产品。
低盐哌嗪缓冲液(20mM哌嗪，30mM NaCl 用HCl调pH至6.0)渗滤缓冲液A(Buffer A)(20mM哌嗪，150mM NaCl，pH 6.0)渗滤缓冲液B(Buffer B)(20mM哌嗪，1或2M NaCl用HCl调pH至6.0)实施例1 抗原制备以250ml log 10-60TCID50/ml的禽流感病毒细胞培养物为抗原，0.2％甲醛进行灭活，5000gx 30分钟离心取上清，20000-25000g超速离心1.5小时取沉淀，灭菌蒸馏水16x稀释。制备氟氏完全佐剂(FCA)与不完全佐剂(FIA)用于免疫。
实施例2 免疫程序用实施1制备的抗原免疫3匹云南某军马场的健康马。免疫可分为基础免疫和加强免疫。基础免疫一般注射两次抗原，第一次用FCA+灭活禽流感疫苗，第二次及以后用FIA+灭活禽流感疫苗。然后用灭活病毒或灭活疫苗直接免疫，根据免疫马产生抗体的滴度或效价，决定加强免疫的数量。一般加强免疫次数为3-5次。
实施例3 血清/血浆的分离与保存按实例2免疫的步骤免疫健康马，于免疫后7天采血，每隔一个星期或10天采一次血，分离血清，用血凝抑制试验(HI)或ELISA/微量细胞中和试验测定抗体效价。根据抗体效价，在最后一次采血，分离血清或血浆，-20℃保存。
实施例4 本发明免疫球蛋白(Fab)2片段的分离和纯化及产品鉴定方法1肌肉注射用马抗禽流感病毒免疫球蛋白(Fab)2片段的制造及检定1)制备工艺a.将实施例3得到的原料马血浆或、血清置于37℃水浴融解后，按45％加入饱和硫酸铵溶液，温和搅拌30分钟，于4℃离心取沉淀。
b.往步骤a得到的沉淀加入与血浆等体积的注射用水溶解，经透析除盐后，按2％加入胃酶于37℃消化8小时。
c.调节将步骤b得到的胃酶消化液最终pH至8.0±0.1，通过DEAESepharose Fast Flow离子交换层析柱。
d.将步骤c得到的层析液超滤浓缩，加入最终浓度为0.3M的甘氨酸成为产品原液。
e.检定步骤d得到的产品原液，检定合格后按规格除菌分装。
2)检测外观无色或浅黄色澄清液体，可带轻微乳光，不应有异物、絮状物及摇不散的沉淀。
蛋白质含量用双缩脲法测定，应不高于150g/L。
pH值加生理氯化钠溶液稀释成10g/L蛋白质浓度。在20±2℃测定，pH值为6.6至7.4。
纯度用SDS-PAGE法测定，(Fab)2含量不低于70％。
细菌内毒素含量用鲎试剂凝胶法测定，细菌内毒素含量不高于200EU/ml。
3)剂型与规格液体剂型，每瓶装量为1ml。
保存，运输2～8℃避光保存和运输。有效期自效价检定合格之日起暂定为3年。
该液体制剂可用于制备喷雾剂或注射剂，冷冻干燥后可以制成冻干粉针。
方法2 逐步法从血清中大量获得高纯度抗体片段(Fab)21)溶液和缓冲液的配制胃蛋白酶溶液(用蒸馏水或去离子水配制50mg/ml，等分成两份，-20℃贮存备用)、盐酸(0.36M)、哌嗪基质液(50mM)、低盐哌嗪缓冲液、Buffer A、BufferB。
2)抗血清的处理量取40ml血清(或所需剂量)用约11ml的0.36M HCl调pH至3.5，同时用磁性搅拌器混合。
3)胃蛋白酶消化酸化后的抗血清在37℃水浴预热30min，加足量的胃蛋白酶溶液，使酶与原抗血清之比为4294U/ml或171，760U/40ml，同时磁性搅拌器搅拌。加过后继续搅拌5分钟，继续37℃消化18-24h。用哌嗪基质液滴定至pH 6.0停止消化，同时搅拌。停止消化后贮存过夜，如果一周后用则4℃保存。2750g，4-12℃离心，弃沉渣。除了可以采用离心以外，还可以采用大型玻璃毛纤维预过滤器过滤。大型玻璃毛纤维预过滤器过滤能够在无菌条件下大剂量过滤。沉淀(粒状沉淀)可用低盐哌嗪缓冲液重悬，再次离心，收集上清。同样，若过滤，过滤器可用少量低盐哌嗪缓冲液冲洗，增加产物量。
4)去除低分子量的消化产物可通过切向流渗滤除去低分子量的消化产物。无任何沉淀的消化液在装有50cm3截留分子量为30kDa滤膜的切向流渗滤器上首先浓缩至约100ml总体积(如关闭样品容器盖之前，约30ml在管中和膜上，样品容器中约70ml)。同时用至少10(≥11)倍总体积的渗滤缓冲液A冲洗。继续浓缩，用少量的渗滤缓冲液A使终体积保持在100ml，冲洗掉切向流渗滤器上的任何残余物，达到最佳回收。此过程中可能形成少量沉淀，可以通过离心或预过滤器过滤。若进行小剂量浓缩处理，也可以采用离心机、正压浓缩器或者尺寸排阻层析。
5)阴离子交换层析用50ml的Q-SepHarose Fast Flow装柱(柱床10cm高)，用200ml的渗滤缓冲液A预平衡，进行阴离子交换分离。消化过的抗血清通过柱，同时监测被洗脱物的A280nm值，然后用新鲜的渗滤缓冲液A使A280nm回至基线。收集所有未吸附物，相当于纯化的(Fab)2，2-8℃贮存。然后用梯度渗滤缓冲液B洗脱被吸附的污染物(酸性凝集物和胃蛋白酶)，使柱再生。层析流速始终保持在5ml/min。
6)浓缩切向流超滤装置用于浓缩和/或制备终产物(未吸附的阴离子交换物)，达到所需浓缩量。产物浓缩后，VivaFlow50系统用去离子水彻底清洗，然后用1M NaOH清洗2h，使系统再生。加低盐缓冲液，再用去离子水洗去清洗液NaOH。
7)分析方法a.SDS-PAGE用Laemmli(1970)描述的缓冲系统，非还原SDS-PAGE，监测消化过程中未消化的IgG或未完全消化的清蛋白片段。
b.尺寸排阻层析尺寸排阻层析可用于检测大分子量凝集物。使用FPLC系统，柱Superose 12Hr 10/30，加样前样品用50nM(纳摩尔)Tris/200nMNaCl，pH 8.0的缓冲液稀释，离心、过滤，上样，0.5ml/min的流速1h以上，洗脱的蛋白A280nm监测。
c.分析型离子交换层析用层析系统和柱Mono QHR 10/10来检测需除去的酸性杂质和大分子凝集物和胃蛋白酶，柱用渗滤缓冲液A平衡，上样，最后用梯度渗滤缓冲液B再生柱，层析流速为5ml/min，A280nm监测。
8)结果以牛血清清蛋白为标准，BCA蛋白分析，马抗血清浓度为95g/L左右。
产品鉴定方法以及产品的剂型与规格与方法1的相同。
实施例5 本发明IgG的分离、纯化及产品鉴定
1)制备工艺a.将实施例3得到的原料马血浆置于37℃水浴融解后，按45％加入饱和硫酸铵溶液，温和搅拌30分钟，于4℃离心取沉淀。
b.往步骤a得到的沉淀中加入与血浆等体积的注射用水溶解，经透析除盐；c.将步骤b得到的沉淀通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱。
d.将步骤c得到的层析液超滤浓缩，制得抗禽流感病毒IgG。
2)检测外观无色或浅黄色澄清液体，不应有异物、絮状物及摇不散的沉淀。
蛋白质含量用双缩脲法测定，应不高于150g/L。
pH值加生理氯化钠溶液稀释成10g/L蛋白质浓度。在20±2℃测定，pH值为6.6至7.4。
纯度用SDS-PAGE法测定，IgG的含量不低于70％。
细菌内毒素含量用鲎试剂凝胶法测定，细菌内毒素含量不高于200EU/ml。
3)剂型与规格液体剂型，每瓶装量为1ml。
保存，运输2～8℃避光保存和运输。有效期自效价检定合格之日起暂定为3年。
该液体制剂可用于制备喷雾剂或注射剂，冷冻干燥后可以制成冻干粉针。
实施例6 马血清的效价检测一、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验(一)材料准备1.96孔V型微量反应板，微量移液器(配有滴头)。
2.阿氏(Alsevers)液、鸡红细胞悬液，配制方法见(表-2HA和HI试验用溶液的配制)。
(1)阿氏(Alsevers)液配制。阿氏(Alsevers)液的配方如下表所示。
加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。
(2)1％鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH 7.2的0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1％(V/V)红细胞悬液，4℃保存备用。
3.pH 7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。
4.高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。
(二)操作方法1.血凝(HA)试验(微量法)(1)在微量反应板的1-12孔均加入0.025mL PBS，换滴头；(2)吸取0.025mL抗原加入第1孔，混匀；(3)从第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头；(4)每孔再加入0.025mL PBS；(5)每孔均加入0.025mL 1％(V/V)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)；(6)振荡混匀，在室温(20℃-25℃)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4℃环境下1hr)。对照孔红细将成明显的钮扣状沉到孔底；(7)结果判定。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。
2.血凝抑制(HI)试验(微量法)(1)根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64(256除以4)。
(2)在微量反应板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mLPBS。
(3)吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。
(4)1-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温(约20℃)静置至少30min。
(5)每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40min(室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下1hr)，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。
(三)结果判定标准以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。
只有阴性对照孔血清滴度不大于2log 2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。
HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2为阳性。
(四)结果血清的HI价为1∶10240。
二、ELISA法检测采用间接ELISA法，操作步骤按禽流感检测国家标准进行，测得实施例3获得的马血清的抗体滴度为1∶10240。
实施例7 (Fab)2片段的效价检测采用间接ELISA法与中和抗体试验测得实施例4方法1获得的(Fab)2片段进行浓缩之前的效价为1∶4096，检测步骤按禽流感检测国家标准。
采用间接ELISA法与中和抗体试验测得实施例4方法2获得的(Fab)2片段进行浓缩之前的效价为1∶5120，检测步骤按禽流感检测国家标准。
权利要求
1.一种抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白是指抗禽流感病毒免疫球蛋白G和/或抗禽流感病毒免疫球蛋白G的有效片段；所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白是从免疫接种的动物的血清和/或血浆中提取出来的，所述的免疫接种的动物是采用灭活的禽流感病毒与免疫佐剂的混合物和/或禽流感疫苗进行免疫接种；所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白的中和抗体效价为1∶1024-1∶10240。
2.如权利要求1所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫接种的动物为马、羊、牛或猪。
3.如权利要求1所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白的中和抗体效价为1∶2048-1∶10240。
4.如权利要求1所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白是抗H5型、H7型、H9型中一种或一种以上禽流感病毒型的免疫球蛋白。
5.一种制备抗禽流感病毒免疫球蛋白G有效片段的方法，该方法包括以下步骤(1)用灭活的禽流感病毒与免疫佐剂的混合物和/或禽流感疫苗对动物体进行免疫接种；(2)采集经步骤(1)免疫接种的动物的血液；(3)从步骤(2)得到的动物血液中分离出血清和/或血浆；(4)用胃蛋白酶直接对步骤(3)得到的血清和/或血浆中的免疫球蛋白G进行消化；(5)采用切向流超滤系统，除去步骤(4)得到的混合物中的低分子量的消化产物；(6)采用柱层析，对步骤(5)得到的物质进行提纯；(7)采用切向流超滤系统，对步骤(6)得到的物质进行浓缩，制得免疫球蛋白G的有效片段。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的灭活的禽流感病毒所采用的灭活方法是甲醛灭活法、β-丙内脂灭活法或温度灭活法，其中，甲醛灭活法所采用的甲醛浓度为0.10％-1.00％，温度灭活法所采用的灭活温度为46-66℃。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的免疫佐剂是氟氏佐剂、氢氧化铝佐剂或CpG。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(8)对步骤(7)得到的免疫球蛋白G有效片段进行冷冻干燥，得到干燥的球蛋白G有效片段。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的柱层析法是离子交换法或分子筛层析法。
10.一种抗禽流感病毒免疫球蛋白制剂，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白制剂含有如权利要求1-4之一所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白G有效片段以及药学上可以接受的辅料，所述的制剂是液体注射制剂、冻干粉针或喷雾制剂。
全文摘要
本发明公开了一种抗禽流感病毒免疫球蛋白及其制备方法，该免疫球蛋白是指抗禽流感病毒免疫球蛋白G和/或其有效片段([Fab]
文档编号A61P31/00GK1796416SQ20041007766
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者陆家海, 郭中敏, 潘兴华 申请人:中山大学, 陆家海