高效低毒免疫毒素及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：高效低毒免疫毒素及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和免疫学领域，更具体地说，本发明涉及一种高效、低毒的免疫毒素及其制备方法和应用。
背景技术：
自从1975年Kohlor和Milstem应用杂交瘤技术首次制备出单克隆抗体，单克隆抗体在医学基础研究及疾病的临床诊断和治疗中发挥了重要的作用，显示了广阔的应用前景。在过去的十年中，单克隆抗体在肿瘤的靶向治疗研究领域已成为热点，并且已经有一系列单克隆抗体在肿瘤临床治疗中得到了应用，例如1997年美国批准重组嵌合抗体CD20单抗(Rituxan)用于难治性、低分化非何杰金氏B细胞淋巴瘤的治疗，之后陆续批准抗HER2/neu(Herceptin)、抗CD52人源化单抗(alemtuzumab)、calicheamicin偶连的抗CD33人源化单抗等。然而，单独使用单抗的治疗结果并不理想。人们很快就将一些对肿瘤细胞有杀伤作用的药物与单抗结合，以单抗作为弹头，与抗癌药物、毒素、放射性核素等分子组成的“魔弹”都被相继制造出来，这些“魔弹”可以选择性地杀伤与之结合的肿瘤细胞，而对其它细胞则无杀伤作用。人们把这种抗肿瘤新式武器称之为免疫毒素或免疫偶联物，统称为导向药物，俗称“生物导弹”，为肿瘤的靶向治疗开辟了一个新的领域。
目前免疫毒素仍然存在某些缺陷，例如，渗漏综合征限制了其杀伤肿瘤的效果。更为重要的是这些免疫毒素由于无肿瘤细胞特异性靶向作用，对机体的正常组织亦有杀伤作用。针对目前免疫毒素存在的缺陷，近20年来免疫毒素分子在不断的完善，其改进主要在两方面一是改变抗体结构；二是改变毒素结构。
小鼠抗人单克隆抗体SM5-1所针对的抗原p230特异地表达于人肝癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞表面。利用单克隆抗体SM5-1对401例临床黑色素瘤标本(250例原发，151例转移)的筛查中，p230在98％的标本中表达，而在正常组织中，除在汗腺和浆细胞表面有少量表达外，在其它正常组织中均不表达。但是目前报道的其它靶基因，不仅表达于肿瘤组织，而且表达于一些重要的正常组织器官，如肝、肾、心和胸腺等。用流式细胞仪对十余株肝癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞株筛查结果中发现，p230不仅表达于黑色素瘤细胞，还表达于肝癌和乳腺癌细胞，而且在肝癌细胞株的表达水平更高。体外培养中，SM5-1可在无补体作用条件下，通过p230诱导肝癌细胞株(CH-Hep-3)和黑色素瘤细胞株(U10)发生凋亡。进一步的实验证实p230是通过激活Caspase途径，尤其是Caspase-10的激活启动细胞凋亡进程的。p230在肿瘤中的表达谱虽不如HER2、FAS或TRAIL受体等广泛，但是因其特异地表达于肿瘤细胞，是目前最理想的单抗药物靶点之一，其抗体SM5-1是制备免疫毒素的最理想的抗体。
免疫毒素一般以单抗或细胞因子为导向部分，与经修饰的毒蛋白相连，对靶细胞进行杀伤作用。第一代免疫毒素是通过化学偶联，以二硫键将完整的单抗与经过修饰的毒蛋白相连而合成。经化学偶联的免疫毒素需要单独制备抗体和毒素，异源性高，毒性强，并且分子量很大(～200kDa)，导致其穿透实体肿瘤的能力很差，从而大大影响了其在肿瘤治疗中的应用。第二代的免疫毒素是由完整的单抗与经修饰的或不完整的毒素组成。由于毒素蛋白经修饰毒性降低，动物较容易耐受，但缺陷依然存在。随着分子生物学技术的发展，重组免疫毒素应用而生，利用DNA重组技术，将异源的scFv基因与经削减的毒素基因融合并克隆到合适的载体上，在大肠杆菌中翻译出单链嵌合蛋白，因此第三代免疫毒素又称为基因工程免疫毒素[Roselli.M.等，Clinical value of radiolabeled monoclonal antibodies in themanagement of carcinoma patients.In Vivo.1993，7615-621；Berkower.I.Curr.Opin.Biotechnol.1996，7622-628；Pullyblank.A.M等.Br.J.Surg.1997，841511-1517；Panchagnula.R等.J.ClinPharm.Ther.1997，227-19；Pancha.R.G.Biochem.Pharmacol.1998，55247-252]。这种免疫毒素的产物大多以包涵体的形式聚积在细菌宿主的细胞质中。Brinkmann等人通过改造连接肽及scFv与PE融合段的氨基酸序列，适当增加它们的长度和柔韧性，有效的减少了聚积，使具有正确空间构象及杀伤活性的免疫毒素分子得率明显提高。目前免疫毒素仍然存在一些缺陷，例如非特异性毒性渗漏综合征。针对免疫毒素存在的问题，近20年来免疫毒素分子在不断的完善，其改进主要在两方面一是抗体结构的改变[Cater P等.PNAS.992，894285-9；Kipriyanov.S.M等.Mol.Immunol.1994，311047-1058；Owens.R.J.等J.Immunol.Methods.1994，168149-165；Wom.A.等.Biochemistry.1998，2213120-13127；Krebs B等.JImmunol Methods.2001，25467-84；Kurucz.I.等.Proc.Natl.Acad.Sci.1993，903830-3834]；二是毒素结构的改变。
目前用于构建免疫毒素的毒素主要有1、超抗原是直接与MHC-II类分子结合形成配体，通过该配体与T细胞受体结合来激活的抗原分子，具有极高的T细胞激活频率，超抗原的研究对象目前主要是肠毒素(SEA)，在鼠体内已经取得了疗效。2、核糖体延伸因子-2抑制剂①植物类核糖体失活蛋白(RIPs)，阻断28srRNA的4324位腺嘌呤的N糖苷键。又分为两型，I型RIPs如BD1只有酶活性结构，没有结合区，从葫芦科植物Bryonia泻根提取的BD1，其重组合成肽为267个氨基酸。Francisco JA用烟草细胞表达系统不仅成功表达有活性的BD1，而且成功表达有特异结合活性和杀伤活性的融合蛋白抗体。II型RIPc包括蓖麻毒素(Rcsin)，即有酶活性区，又有结合区，Ricin的A链结合的anti-CD7-dgA治疗T细胞淋巴瘤和白血病患者，最大的耐受量MTD每天为0.2mg/kg；②细菌毒素类包括白喉毒素及衍生物(Diphtheria toxin，DT)分子量为60KD，A链发挥酶活性，B链具有结合细胞活性，结合活性主要在羧基末端，同时有介导A链内吞转移的作用。将B区去除或点突变，可以制备一系列衍生物，去除了与正常细胞结合的活性，保留了转位和ADP核糖基化活性。这类DT非常特异，对正常细胞低毒。绿脓杆菌外毒素(PE)，是66KD的单链蛋白，氨基末端构成Ia区，为细胞结合结构区域，Ib(365-404)，是介于II与III区之间的小分子，功能不清楚，但去除后不影响毒素的活性。第253-364氨基酸组成II区，负责毒素的转位。III区，405-613，具有ADP核糖基化活性。PE及衍生物到达细胞，在受体或抗体受体介导下内吞，在胞内蛋白水解酶的作用下I、II区被去除，III区转移入内质网，在转移至胞质。将PE的Ia区去除，则产生PE40，用PE40和其它一些配体，如生长因子或抗体相连构成免疫毒素，能够强烈杀伤受体细胞[Allureed，VS.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1986，831320-1324；Hwang，J，P等.Cell.1987，48129-136；V.K.Chaudhary等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，852939-2943；G.L.Gray等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1984，812645-2649；Ira Pastan.Cancer Immunol Immunother.2003，52338-341]。然而此类免疫毒素在使用过程中，体内半衰期短，实体瘤穿透率低和免疫毒素本身的毒副作用，于是试图通过突变PE分子得到改善。
目前PE主要有以下几种突变体①PE38，是在PE40基础上进一步除去非特异性结构区(第365-380氨基酸)，减少了PE分子上的一个二硫键，并将PE分子的羧基REDLK突变为KDEL，其活性可提高6-10倍。②PE35，其II区的部分氨基酸进一步被去除，使得分子中的二硫键均被切除，而活性不受影响。文献报道，应用PE38的免疫毒素临床观察，所产生的主要抗原表位位于PE分子中的274-283、470-492、531-540、555-564和596-609，这将有利于对PE38的基因改造，降低免疫原性[Siegall.C.B等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，919514-9518；Alan L.L.等，Blood.1997，62323-2334；BalunaR等.JImmunother.1999，2241-47；Siegall CB等.Clin.Cancer Res.19973339-345；Baluna，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1999，963957-3962；Amlot，P.L等，Blood.81993，22624-2633]。但是，利用PE构建的免疫毒素普遍存在渗漏综合征(VLS)，其活性位点主要位于第323-325、405-408、580-582氨基酸[Siegall CB等Clin.Cancer Res，1997，3339-345；Arthur E等Clin.Cancer Res，2000，6326-334]。
随着分子生物学技术的发展，重组免疫毒素应用而生，利用DNA重组技术，将异源的scFv基因与经削减的毒素基因融合并克隆到合适的载体上，在大肠杆菌中翻译出单链嵌合蛋白，因此又称为基因工程免疫毒素。将免疫毒素克隆到适当的表达载体中，在大肠杆菌中得到高效转录和翻译，而且表达周期短，具有操作简便、成本低廉、易于控制和大规模生产的特点。抗体携带毒素导向具有特异抗原的肿瘤组织，与靶细胞上的抗原结合，毒素内化，催化性地使核糖体失活，抑制蛋白合成，杀死细胞。因此，本领域仍需要提供一种高效低毒的免疫毒素。

发明内容
针对免疫毒素存在的非特异性杀伤肿瘤和渗漏综合征的毒性作用，发明人用单克隆抗体SM5-1的嵌合抗体构建其单链抗体，并用生物软件设计，对毒素部分进行基因改造，从而获得了高效、低毒的免疫毒素。
本发明第一方面提供了一种分离的多肽，该多肽包含小鼠抗人单克隆抗体SM5-1的单链抗体ScFv，以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL或其293、297、328、416、417、421、576、578、579位氨基酸有突变的突变体，所述单链抗体ScFv具有重链可变区-接头-轻链可变区的结构，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；所述免疫毒素PE38KDEL具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本文所用的术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
本文所用的术语“单克隆抗体(单克隆抗体)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本发明所用的术语“单链Fv”或″ScFv″或“sFv”抗体包括抗体的VH和VL区，其中这些区在一条多肽链中。通常，Fv多肽还包括VH和VL区间的多肽接头，该接头可使ScFv形成结合抗原所需的结构。关于ScFv综述可见Pluckthun在《单克隆抗体药理学》(The Pharmacology of Monoclonal antibodies)，113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)。在较佳的实施方案中，所述接头可以是屈曲的、灵活的间隔臂或肽序列，例如例如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)n的重复序列，其中n为1-5，较佳的为3-5，更佳的为3。
本文所用的术语“包含”是指，所述多肽除了含有小鼠抗人单克隆抗体SM5-1的单链抗体ScFv以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL外，还可含有其它的氨基酸，只要这些氨基酸的存在对于本发明的多肽的生物活性(如抗肿瘤活性以及减少渗漏综合征的发生等)没有不利影响。在较佳的方案中，本发明的分离的多肽基本上由(1)小鼠抗人单克隆抗体SM5-1的单链抗体ScFv，以及(2)与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL或其293、297、328、416、417、421、576、578、579位氨基酸有突变的突变体组成。上述突变位点是针对天然PE66位的序号来确定的。与PE66的氨基酸序列相比，本发明的PE38是在PE66的基础上去除了第1-252以及第365-380的氨基酸。因此，上述位点在SEQ ID NO3中的第41、45、76、148、149、153、308、310和311位。
本文所用的术语“突变”是主要是指氨基酸发生置换，如保守性置换。通过选择在下列方面效应明显不同的替代来实现修饰(a)维持替代区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构型；(b)维持靶位置处分子的电荷或疏水性；或(c)维持侧链体积。根据共同的侧链性质，天然存在的残基被分成下列几类(1)疏水的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水的cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性的asp，glu；(4)碱性的his，lys，arg；(5)影响链取向的残基gly，pro；和(6)芳香类的trp，tyr，phe。在上述同类氨基酸组中的置换通常被认为是保守的。
在较佳的实施方案中，所述突变选自以下各组(1)A293(Arg)-Lys，A416(Asn)-Gln，A576(Arg)-Lys；(2)A293(Arg)-Trp，A416(Asn)-Ala，A576(Arg)-Trp；(3)A297(Leu)-Ala，A416(Asn)-Gln，A576(Arg)-lys；(4)A297(Leu)-Gln，A416(Asn)-Ala，A576(Arg)-lys；(5)A297(Leu)-Ala，A417(Trp)-Tyr，A579(Gly)-Ala；(6)A297(Leu)-Gln，A416(Asn)-Ala，A576(Arg)-lys；(7)A328(Ala)-Val，A421(Arg)-Lys，A578(Val)-Ala；(8)A328(Ala)-Tyr，A421(Arg)-Tyr，A578(Val)-Ser(A293、A416等的序号表示方法为按照天然PE的氨基酸序列号表示的)。然而，本领域技术人员能够理解，本发明列举的突变组合仅仅是示意性的，而非限制性的。
在本发明的多肽中，单链抗体ScFv和免疫毒素PE38KDEL可以通过共价键或接头来连接。它们的前后次序或位置可以互换。
本发明还提供了编码上述多肽的DNA分子，含有该DNA分子以及与所述序列操作性相连的表达调控序列的表达载体，以及被所述表达载体转化的宿主细胞。本发明另一方面还提供了制备上述多肽的方法，该方法包括a)提供表达载体，该表达载体含有上述DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述多肽表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述多肽。
本发明的多肽可由本领域技术人员根据常规手段来获得。首先，可根据本发明提供的序列信息用化学合成或PCR等常规获得上述DNA分子。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将该DNA分子插入表达载体中使其与表达调控序列操作性相连。“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列，其包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号，通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体。随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。
然后，在适合多肽表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的多肽。
本发明另一方面还提供了一种抗肿瘤药物组合物，该组合物药学上有效量的上述多肽以及药学上可接受的载体。在较佳的实施方案中，该药物组合物中还可含有与本发明的多肽联用的其它化疗药物和放疗药物。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的单克隆抗体相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低单克隆抗体或药物组合物的药效。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的药物组合物可用于治疗特异表达抗原p230的肿瘤或癌，例如肝癌、乳腺癌和黑色素瘤。
本发明旨在构建高效、低毒的新的免疫毒素SM5-1-PE38KDEL。首先，本发明人选用靶向性很强的新抗体SM5-1，满足免疫毒素的特异性杀伤肿瘤的特性；其次，解决渗漏综合征的问题，利用生物软件INSIGHTII模拟PE38KDEL三维结构，选择与VLS相关的氨基酸突变，从而减轻或消除了渗漏综合征。发明人成功构建了免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其8个突变体，并且通过体外和体内实验，筛选出一个高效、低毒的新的免疫毒素SM5-1-PE38KDEL，能够明显地预防肿瘤的发生和抑制肿瘤的生长，为进一步的研究提供了方法和理论基础。


图1显示了克隆SM5-1(ScFv)、PE38KDEL和SM5-1-PE38KDEL的引物位置，其中图1a显示了SM5-1-1、-2、-3、-4引物用于扩增ScFv，SM-1-1、-2、-3、-5引物用于扩增SM5-1-PE38KDEL的单链抗体部分；图1b显示了引物PE38-1、-2、-3、-4用于扩增PE38KDEL，引物PE38-5、-2、-3、-4用于扩增SM5-1-PE38KDEL的毒素部分；图1c显示了在前述PCR基础上，用引物SM5-1-1、PE38-4重叠PCR扩增SM5-1-PE38KDEL。
图2显示了1％琼脂糖凝胶电泳下的SM5-1-PE38KDEL扩增序列。
图3显示了中间载体示意图，其中a为SM5-1(scFv)；b为PE38KDEL；c为SM5-1-PE38KDEL；d为pET32a(+)(5900bp)；e为SM 5-1-PE38KDEL突变体。
图4显示了SM5-1可变区序列，其中a是SM5-1重链可变区区域，b是SM5-1轻链可变区区域。
图5显示了PE38KDEL毒素的序列。
图6a显示了PE66三维结构示意图(PDB accession no.1IKP)。图6b显示了PE38KDEL同源模建后三维结构示意图，其结构松散，需要优化。图6c显示了PE38KDEL动力学和能量优化后的三维结构示意图，其中黄色(浅色)为VLS活性位点，蓝色(深色)为选择的突变位点。
图7显示了SM5-1-PE38及其3个突变体诱导前后的15％SDS-PAGE电泳结果，其中1、2、5、7分别是四个蛋白诱导后的蛋白条带，可见诱导后有明显的蛋白条带，分子量大小与预期吻合。
图8显示了免疫毒素蛋白(还原胶)的15％SDS-PAGE电泳结果，泳道2-9分别为8个纯化后的免疫毒素蛋白。
图9显示了免疫毒素蛋白(非还原胶)的15％SDS-PAGE电泳结果，泳道1-8分别为8个纯化后的免疫毒素蛋白。
图10显示了荧光素酶体外合成曲线，其中横坐标是萤光素酶mRNA(单位为mg)，纵坐标为光强度(单位为107)。
图11显示了PE38KDEL抑制蛋白合成曲线，其中横坐标为PE38KDEL(单位为μg)，纵坐标为光强度(单位为107)，黑色正方形表示可溶的PE38KDEL，黑色三角形表示包涵体形式的PE38KDEL。
图12显示了FITC-SM5-1-PE38KDEL、mut1与ch-hep-3结合的流式结果，其中a是天然型免疫毒素SM5-1-PE38，b是突变体1。
图13显示了Western印迹结果，其中1为天然型免疫毒素SM5-1-PE38KDEL、2为突变体1。
图14显示了共聚焦显微镜下的蛋白内吞过程，aFITC-SM5-1作用10分钟的蛋白质内吞图，其中抗体集中在细胞膜表面；bFITC-SM5-1作用2小时，抗体弥散地分布在细胞膜内；cFITC-CD25-PE38作用2小时，融合蛋白没有被内吞；dFITC-PE38KDEL作用2小时，蛋白没有被内吞；eFITC-SM5-1-PE38作用10分钟，抗体集中在细胞膜表面；fFITC-SM5-1-PE38作用2小时，融合毒素集中在细胞膜内。
图15显示了用细胞记数法检测免疫毒素细胞毒作用。
图16显示了4个突变体与天然免疫毒素对小鼠PVL的比较。
图17显示了小鼠渗漏综合征(PVL)大体，其中a尾静脉注射生理盐水24h后的小鼠胸腔；b尾静脉注射SM5-1-PE38KDEL(1mg/kg)24h后的小鼠胸腔；c尾静脉注射SM5-1-PE38KDEL.mut1(3mg/kg)24h后的小鼠胸腔。
图18显示了SM5-1-PE38及突变体对小鼠肺的影响(肺组织病理切片HE染色×200)，其中a正常肺组织；bSM5-1-PE38KDEL(1mg/kg)；cSM5-1-PE38KDEL.mut1(1mg/kg)；dSM5-1-PE38KDEL.mut1(4mg/kg)；eSM5-1-PE38KDEL.mut1(8mg/kg)；fSM5-1-PE38KDEL.mut1(10mg/kg)。
图19显示了裸鼠肝癌模型。
图20显示了尾静脉注射突变前后的免疫毒素SM5-1-PE38的小鼠(5周)，其中a尾静脉注射未突变的SM5-1-PE38的裸鼠，b尾静脉注射突变的SM5-1-PE38的裸鼠。
图21显示了免疫毒素尾静脉注射后的肿瘤生长曲线。
图22显示了PI染色，流式细胞术检测免疫毒素诱导凋亡。
具体实施例方式
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例1 SM5-1单链抗体及其免疫毒素基因的克隆实验材料1.1菌株大肠杆菌TG1和BL21(DE3)由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供。
1.2质粒SM5-1重链和轻链的质粒由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供，PE40毒素质粒由德国Winfried Wels教授赠送。
1.3工具酶及试剂盒限制性内切酶购自Promega公司。Taq DNA polymerase购自上海皓嘉科技发展有限公司。质粒提取试剂盒购自Qiagen公司和华舜公司，DNA回收试剂盒购自华舜公司，PCR扩增试剂盒购自生工公司。pGEM-T vector购自美国Promega公司。
1.4DNA分子量标准2000bpMarker为华美公司产品。
1.5PCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。
1.6细菌培养试剂胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉为英国OXOID公司产品。
1.7主要实验仪器PCR仪 德国Mastercycler gradient，Nethller-HinZ GmbH产品；复日FR-980生物电泳图像分析系统上海复日生物实验技术研制所产品；UV-2401PC紫外分光光度计(上海分析仪器总厂，UV755B型)；-80℃低温冰箱美国REVCO，Asheville，N，C产品；细菌培养摇床上海离心机械研究所产品实验方法2.1引物设计选择抗体重链和轻链可变区的适当位置，分别设计5条特异性引物，用来克隆单链抗体和免疫毒素的抗体部分；选择PE40毒素的适当位置分别设计5条引物，用来克隆PE38KDEL毒素和免疫毒素的毒素部分。引物序列如下SM5-1-15’-GGAGATCTGGACGACGACGACAAGGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCT-3’(SEQ ID NO4)；SM5-1-25’-ACCAGAGCCACCACCGCCAGAGCCACCACCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(SEQ ID NO5)；SM5-1-35’-TCTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCTAACATTATGATGACACAGTCG-3’(SEQ ID NO6)；SM5-1-45′-ACCAGAGCCACCACCGCCAGAGCCACCACCACCCCGCTTTATTTCCAGCTTGGT-3’(SEQ ID NO7)；SM5-1-55’-GGAAGCTTTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCCGCTTTATTTCCAGCTTGGT-3’(SEQ ID NO8)；PE38-15’-AAAGATCTGGACGACGACGACAAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTG-3’(SEQ ID NO9)；PE38-25’-AAAAGCTTTTACAGTTCGTCTTTCGGCGGTTTGCCGGGCTG-3’(SEQ ID NO10)；PE38-35’-TCTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTG-3’(SEQ ID NO11)；PE38-45’-GTCGCCGCTGTCCGCCGGGCCGTTGGCCGCGCCGGCCTC-3’(SEQID NO12)；PE38-55’-GAGGCCGGCGCGGCCAACGGCCCGGCGGACAGCGGCGAC-3’(SEQ ID NO13)引物所处的位置如图1a、1b和1c所示。
2.2重叠PCR PCR均采用热启动，SM5-1重链和轻链可变区序列的扩增条件是94℃5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 5min，30个循环。PE毒素序列中由于GC含量高达70％以上，用普通的PCR很难扩增，因此选用Takara公司专门用来扩增GC含量高的DNA聚合酶，其PCR条件是94℃1min，94℃ 30s，60℃ 50s，72℃1min，72℃5min，30个循环。
2.3质粒的构建2.3.1连接反应1)分别取适量以DNA回收试剂盒回收DNA片段、经匹配末端限制性内切酶线性化的载体DNA(两者末端浓度比为1∶1-1∶2)；2)加连接缓冲液1.0μl、T4DNA连接酶1μl，加水至10μl；3)16℃连接过夜；4)铺板，形成具有相应抗生素抗性的单克隆；2.3.2感受态细菌的制备1)挑取单一菌落于5ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜，制备过夜菌；2)按1∶100将过夜菌接种到LB液体培养基，37℃振荡培养约3h，OD值为0.3-0.6时停止培养；3)菌液加入1.5ml Ependorf管，1.5ml/管，离心，1krpm，1min，沉淀细菌，弃上清；4)加入冰预冷的100mM CaCl2溶液，200μl/管，冰浴30min；5)离心沉淀细菌，1krpm，1min，弃上清，加入冰预冷的100mM CaCl2溶液，100μl/管；6)冰浴1h以上，备用。
2.3.3转化1)取一个Ependorf管，加入DNA连接物2μl、感受态细菌100μl，冰浴1h；2)42℃热休克3min，冰浴2min；3)加液体LB培养基200μl，37℃振荡培养45min；4)取100μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，晾干；5)37℃倒置培养过夜；2.3.4重组质粒的提取1)挑取数个转化的单菌落，每个菌落分别接种于5ml含50μg/ml的抗生素LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；2)离心收获细菌，10krpm，1min；3)质粒提取试剂盒提取质粒；4)电泳检测质粒质量，测OD260/OD280决定质粒含量。
2.3.5重组质粒的酶切鉴定1)取Ependorf管，依次加入约5μl 10×酶切缓冲液、2μg质粒、1μl酶1、1μl酶2，以灭菌去离子水补充至50μl；2)置37℃，1h；3)琼脂糖凝胶电泳检测；实验结果3.1DNA的扩增采用常规PCR技术顺利扩增了SM5-1的单链抗体及用来构建免疫毒素的抗体部分。PCR扩增结果与预期吻合。同时扩增PE38序列。扩增序列大小与预期吻合。将上述PCR产物胶回收，取SM5-1-linker和linker-PE38KDEL胶回收产物进行重叠(over-lapping)PCR，即SM5-1-PE38KDEL的PCR扩增产物如图2所示。
3.2序列测定和分析将上述PCR扩增产物克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TG1，用蓝白斑筛选阳性克隆测序。将测序结果正确的克隆保存，用于表达载体的构建。它们的中间载体示意图如图3。SM5-1可变区序列和PE38KDEL毒素序列如图4a和4b所示。另外，SM5-1重链可变区序列显示在SEQ ID NO1中，SM5-1轻链可变区序列显示在SEQ ID NO2中，PE38KDEL毒素序列显示在SEQ ID NO3中。
单链抗体(ScFv)基因结构是由抗体基因的VH和VL通过非共价键或二硫键连接而成，保留原有的抗原结合能力[King DJ等.Biochem J，1993，290(Pt 3)723-728；Huston JS等.ProcNatl Acad Sci USA，1988，855879-5884]，鼠源性抗体的VH和VL的基因分别是由4个相对保守的骨架区(FR)和3个抗原互补决定区(CDR)组成，CDR区编码的氨基酸相互作用共同构成抗原结合位点，也决定了每种抗体的特异性。FR区呈β片层排列，碱基组成和排列顺序比较稳定，因此可以根据FR1和FR4的碱基组成和排列顺序扩增VH和VL基因的寡核苷酸引物，用编码易折叠的寡核苷酸接头将二者连接成VH-linker-VL即ScFv[Colcher D等.Ann N Y Acid Sci，1999，880263-280；Zu Putlitz J等.Biochem Biophys Res Commun，1999，24(255)785-791]，将此基因克隆入原核或真核表达载体中并在原核或真核细胞系统中表达，其产物即为ScFv。通用的连接肽有很多，连接肽必须能使轻、重链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型。同时Linker尽可能减少蛋白酶的攻击，并防止单链抗体的聚集。Linker长度以14-25个氨基酸残基为适，目前最常用的连接肽是由Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构和计算机辅助分析结果设计的具有刚性结构的15肽序列(G4S)3[Mansfield E等.Blood，1997，90(5)2020-2027]，Glockshuber等单链抗体在大肠杆菌中表达，并能自发折叠成天然构象，而其抗原的亲和力几乎和原来的完整抗体一样，其稳定性比通过二硫键相连的Fv片段提高近60倍。ScFv的研究为进一步制备鼠-人嵌合基因工程抗体和人源化重构抗体奠定了基础。将ScFv与毒素连接构成融合蛋白的研究意义重大，是近几年研究的热门课题。
由于ScFv分子量小，免疫原性小，特异性强，亲和力较高，组织穿透力强等优点[NivR等.Int J Cancer，2001，94864-872]，在其基因3’端接上与毒素、酶、细胞因子，构成重组免疫毒素，可以作为良好的导弹，对肿瘤细胞发挥杀伤作用[Van der Poel HG等.J Urol，2002，168266-272；Matsumoto H等.AnticancerRes，2002，222001-2007]。对于一个特定的scFv，其稳定性主要是由VH-VL间相互作用的性质和强度以及连接肽的类型决定的。柔性的连接肽使各个scFv中的VL和VH与附近抗体分子的VH和VL或其它的粘性表面之间不断的结合和解离，因而易于发生聚合和沉淀等现象[Reiter Y等Protein Eng.1995，121323-1331]。制备免疫毒素的抗体最好属于IgG类，因为IgM类抗体难于毒素偶联，偶联后的免疫毒素产量和活性均低。
SM5-1是新的小鼠抗人单克隆抗体，其抗原是理想的靶点，因此将SM5-1抗体的重链可变区和轻链可变区通过连接肽(G4S)3连接起来，构建SM5-1的单链抗体，然后又用连接肽将SM5-1的单链抗体与PE38KDEL毒素连接，构建天然的新的免疫毒素SM5-1-PE38KDEL，为下一步研究肿瘤的靶向治疗奠定基础。
发明人采用常见的over-lapPCR技术将两个DNA片段连在一起。由于PE38KDELDNA中GC含量很高，这给PCR扩增带来很大困难，用常用的DNA聚合酶和PCR常规条件很难扩增出对应的片段，于是选用专门用来扩增GC含量高的DNA序列的DNA聚合酶，成功地扩增了PE38KDEL和SM5-1-PE38KDEL。DNA基因重组技术的使用，使制备单链抗体和单链抗体免疫毒素在二周内即可实现，大大缩短了导向药物的制备时间，成本较低，操作方便，改善培养条件，大肠杆菌能表达并装配和折叠具有高生物活性的免疫毒素。
实施例2 免疫毒素SM5-1-PE38KDEL突变体的设计及构建绿脓杆菌外毒素(PE)，是66KD的单链蛋白，氨基末端构成Ia区，为细胞结合结构区域，Ib(365-404)，是介于II与III区之间的小分子，功能不清楚，但去除后不影响毒素的活性。第253-364氨基酸组成II区，负责毒素的转位。III区，405-613，具有ADP核糖基化活性。PE及衍生物到达细胞，在受体或抗体受体介导下内吞，在胞内蛋白水解酶的作用下I、II区被去除，III区转移入内质网，再转移至胞质。将PE的I区的部分去除，再将PE分子的羧基REDLK突变为KDEL，即PE38KDEL，其活性可提高6-10倍。利用PE构建的免疫毒素普遍存在渗漏综合征(VLS)，其活性位点主要位于第323-325、405-408、580-582氨基酸[Siegall CB等Clin.Cancer Res，1997，3339-345；Arthur E等Clin.Cancer Res，2000，6326-334]。发明人拟通过INSIGHTII软件，设计定点突变免疫毒素SM5-1-PE38KDEL的毒素部分，来降低渗漏综合征的副作用，构建既具有靶向杀伤作用，毒副作用又大大降低的新型免疫毒素SM5-1-PE38KDEL。
实验材料1.1菌株 大肠杆菌TG1和BL21(DE3)由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供。
1.2载体 中间载体pGEM-T vector购自美国Promega公司。原核表达载体PET32a(+)由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供。
1.3引物 PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4工具酶 限制性内切酶购自Promega公司。T4DNA ligase购自Promega公司。
1.5细菌培养试剂LB培养基氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司。
1.6试剂盒pGEM-T vector购自美国Promega公司，小量质粒抽提纯化试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。
1.7主要仪器设备PCR仪(Eppendorf)；复日FR-980生物电泳图像分析系统(上海复日生物实验技术研究所)；UV-2401PC紫外分光光度计(上海分析仪器总厂，UV755B型)；INSIGHTII生物软件(Accelrys公司)实验方法a)PE38KDEL分子的生物模拟和突变位点的选择同源模建是预测未知蛋白结构最为有效的方法之一，当模板序列和目的序列的同源性大于30％时，建模的结构较为可靠[Orengo C A等.Nature，1994，372631-633]。绿脓杆菌外毒素(PE)晶体结构取自PDB结构数据库，采用Accelrys公司的INSIGHTII软件包Homology程序建模，Discover程序进行分子力学和分子动力学优化，为评价建模结果，采用Profiles-3D程序进行合理化检测。基本步骤如下①首先选取PE蛋白作为模板，结构叠合，确定保守区(SCR)和Loop区。②初始模型构建将PE38KDEL的序列同SCRs联配③分子优化在CVFF力场下，利用INSIGHTII/Discover程序对初始模型进行分子力学和分子动力学优化，先用最陡下降法优化2000步，再用共轭梯度法直至能量RMS偏差小于0.5kcal/(mol.)，获得了能量较低的初始构象。为克服局域位能陷阱，在常温下(300K)进行分子动力学模拟，首先进行1000步的结构松弛计算，接着进行2000步的共轭梯度优化。对该结构进行500ps的常温动力学计算，每隔10ps收集一个构象，对收集的构象进行分子动力学优化，最终选定能量最低的构象作为建模结果。
b)SM5-1-PE38KDEL突变体的基因克隆根据INSIGHTII生物软件，发明人得到PE38KDEL合理的三维结构，在渗漏综合征的活性位点5范围内，与活性位点相关的氨基酸主要有A293、A297、A328、A416、A417、A421、A409、A414、A568、A448、A401、A576、A578、A579、A584。从这些位点选择突变的氨基酸，发明人筛出9个突变位点，共设计38条引物，over-lapPCR扩增SM5-1-PE38KDEL突变体序列，构建8个突变体。
c)SM5-1-PE38KDEL及其突变体表达载体的构建为了便于构建原核表达载体，需要给野生型和8个突变体免疫毒素的克隆基因加上适当的酶切位点，5’端含有BglII位点，3’端含有HindIII酶切位点，琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT vector中，得到含有免疫毒素的中间载体，经测序鉴定后用BglII和HindIII将目的基因从中间载体切下并克隆到经同样酶切的原核表达载体pET32a(+)中，得到SM5-1免疫毒素原核表达载体。
实验结果PE38KDEL的生物模拟发明人选取RCSB PDB数据库中全长毒素PE(1IKQ)作为模板进行模建，模建结果如图6。利用Profile 3D进行环境参数计算显示PE38KDEL的模建结构基本合理。
SM5-1-PE38KDEL突变体的基因克隆发明人根据计算机模拟的PE38KDEL三维结构，筛选出A293、A297、A328、A416、A417、A421、A576、A578、A579氨基酸位点进行突变，共设计了38条引物，进行over-lapPCR，得到8个突变体序列，结果如表1。构建其载体，挑选阳性克隆，测序，筛出序列正确的克隆，进行表达载体的构建。
表1.8个免疫毒素SM-PE38KDEL的氨基酸突变

SM5-1-PE38KDEL及其突变体的表达载体构建通过蓝白斑筛选阳性克隆，经测序证实后，用限制性内切酶BglII和EcoRI分别酶切目的片段和pET32a，用DNA连接酶将二者连接起来。
借助计算机预测分析蛋白质的结构，有助于发明人更好地认识蛋白作用机制。虽然现在人们对细胞内外蛋白质怎样折叠成其特定的空间结构不清楚，但是随着基因工程技术的运用，使得按人们的意愿创造自然界或改善现有蛋白质的特性和生物功能成为可能，从而设计出更合理的抗体导向药物。由于技术手段的限制，对某些蛋白的结晶和解析很难在短时间内完成，因此利用已知蛋白的晶体结构来预测未知蛋白的三维结构就成为解决这一瓶颈的重要方法。
PE由绿脓杆菌分泌，分子量为66kDa。从PE的晶体结构中得知，它在空间上分为3个结构域(Domam，D)，DI、DII和DIII，DI由DIa和DIb组成[V.S.Allureed等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1986，831320-1324；J.Hwang等，Cell.1987，48129-136；V.K.Chaudhary等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，852939-2943；R.J.Kreitman等，Biochem J.1995，30729-37]，它们在空间结构上靠近，但在一级结构中并不相连。DIa由第1～252aa组成，具有结合细胞的能力(cell-binding)，可引导PE与靶细胞膜上的受体识别并结合。PE受体广泛分布于哺乳动物的细胞膜上，因此，它对多数哺乳动物具有毒性。DIb第365～399aa组成，功能还不太清楚，其大部分氨基酸的缺失并不影响PE的活性。DII由第253～364aa组成，负责PE的跨膜运输，它由6～7个α螺旋组成，其中1、2两个的长度足以跨过细胞膜的磷脂双层。在第256～273aa中有14个为疏水氨基酸，其后的274、276、279位均为Arg，这一结构与典型的信号肽极相似[Li，M.等.Proc Natl Acad Sci U S A.1995，929308-9314；Wedekind，J.E.等J.Mol.Biol.2001，314823-835；Jinnno Y等.J.Biol.Chem.1989.264(27)15953-15959]。PE属于细菌核糖基转移酶类，其ADP-核糖基化活性(ADP-ribosylating activity)位于DIII。DIII由第400～613组成，其COOH-端的Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(简写(REDLK)，与内质网保留序列(endoplasmic reticulum retention sequence)Lys-Asp-Glu-Leu(简写为KDEL)相似，可引导PE进入内质网。
本发明首次通过计算机模拟PE38KDEL分子的三维结构，之所以选择同源模建的方法预测PE38KDEL的三维结构，主要基于以下事实全长PE毒素的晶体结构已经得到解析，容易获得所需要的模板。本实施例所涉及的引起渗漏综合征的活性位点A323-325、A405-407、A580-582均位于结构表面，这就为进一步构建突变体提供了理论依据，选择了9个突变位点，共构建了8个突变体的原核表达载体，进行下一步的表达和纯化工作。
实施例3免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的表达纯化免疫毒素原核表达载体构建成功后，转化BL21，挑选高表达阳性克隆，原核表达，收集细菌，用His-Ni++和分子筛纯化，用蛋白电泳和lowry酚法鉴定纯化效果。
实验材料
1.1菌株 菌株大肠杆菌TG1和BL21(DE3)由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供传代保存。
1.2细菌培养试剂LB培养基氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司。
1.3IPTG购自上海华舜生物有限公司。
1.4Chelating sepharose Fast Flow and Superdex75 resin购自Amersham PharmaciaBiotech(USA)。
1.5主要仪器设备AKTA FPLC(Amersham pharmacia biotech)；Vertical electrophoresis system(PharmaciaHoefer Biotech Inc，San Francisco CA，U.S.A，mini VE型)Electrophoresis PowerSupply(amersham Pharmacia biotech，EPS601型)；Mini Trans-Blot Cell(BIO-RAD公司)；UV-2401PC紫外分光光度计(SHIMADZU)实验方法2.1免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的诱导表达当发明人成功构建了免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及8个突变体的原核表达载体后，转化大肠杆菌BL21，在LB培养基中表达，37℃扩增，待OD600在0.6～0.8之间时，用IPTG诱导(终浓度为1mmol)4小时，分别在诱导前后取样。4000转/min离心30min，弃上清收集细菌菌体。-20℃保存，进行下一步的纯化工作。
2.2免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的纯化1)将收集的细菌菌体用50mmol Tris(pH7.5)(1g菌体用20液体重悬)重悬，4℃超生破碎菌体，高速离心(10000转/min)30min收集可溶性上清和包涵体，取小样进行SDS-PAGE蛋白电泳；2)将高速离心得到的包涵体用8M尿素、0.1M Nah2PO4、0.01Tris(pH 8.0)室温变性2小时，10000转/min离心30min，收集上清；3)将收集的上清用0.45um的滤膜过滤准备用His-Ni++金属鏊合柱纯化；4)装10ml的His-Ni++金属鏊合柱，用5个柱体积的水冲洗后，用5柱体积的平衡液(8M尿素、0.1M0.1M NaH2PO4、0.01Tris、10mmol咪唑pH8.0)平衡，上样(流速为2ml/min)；5)上样完备后，再用5柱体积的平衡液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01Tris、10mmol咪唑pH 8.0)平衡，然后用5小时将8M尿素的平衡液逐步减为0M尿素的平衡液，此为蛋白的柱上复性过程；6)蛋白柱上复性完成后，用5柱体积的洗脱液(0.02M PB，0.5M咪唑)洗脱，收集蛋白峰。蛋白电泳检测其纯化情况；7)将洗脱收集的蛋白再进行分子筛(20mmoolPB)纯化，收集蛋白峰，进行电泳，确定对应的目的蛋白。
2.3免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的浓度测定和纯度鉴定对纯化的蛋白采用SDS-PAGE蛋白电泳和280nm紫外读数法和lowry酚法检测纯度和浓度。
2.3.1蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)1)15％凝胶电泳，制胶后按预定顺序加样，每孔加15μl，在甘氨酸电泳缓冲液中初始以60V电压进行电泳；2)当样品进入分离胶时将电压改为150V，直至溴酚蓝跑出胶的底部。取出凝胶在染色液中室温染色4小时；3)在脱色液中脱色，每隔1小时换脱色液一次，充分脱色后，干胶。
2.3.2蛋白浓度测定1)根据紫外测定值，稀释样品至合适浓度，用Lowry酚法测免疫毒素蛋白浓度，配置标准蛋白质溶液(1mg/ml)，从1000μg/ml开始稀释为1000、500、250、125、62.5；2)样品也大概从1000μg/ml开始稀释5个浓度。3)以标准蛋白质浓度为横坐标，光密度(OD750)值为纵坐标，绘制标准曲线。
实验结果3.1免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的诱导表达将构建好的免疫毒素表达质粒转化大肠杆菌BL21，待OD600在0.6～0.8之间时，加入IPTG，37℃诱导表达4小时，4℃离心收集细菌，将诱导前后的细菌裂解，取样进行SDS-PAGE电泳，发现诱导后有明显的诱导条带(图7a)，而且蛋白分子量大小与预期蛋白分子量一致。将收集的菌体重悬后在冰水中超声碎菌，高速离心收集上清和包涵体，蛋白电泳显示其表达形式以包涵体为主(图7b)。
3.2免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的纯化根据蛋白电泳显示免疫毒素主要是以包涵体形式表达。对于包涵体变性，常用的变性剂主要有尿素(8M)、盐酸胍(GdnHCl 6-8M)，通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。采用8M尿素变性包涵体(室温2小时)，离心收集上清，过滤后用His-Ni++金属鏊合柱纯化，将目的蛋白结合到亲和柱上，缓慢地去除平衡液中的尿素，即为柱上复性的过程，最后用洗脱液洗脱收集蛋白峰，将收集的蛋白在用分子筛纯化，最后将纯化的免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图8和9所示。
3.3免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体的纯度和浓度测定将收集的蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，发现其纯度大于90％，可以满足实验要求。结合蛋白电泳、280nm紫外读数法和lowry酚法定量蛋白浓度，它们浓度在0.24-0.5mg/ml之间。
本实施例成功地构建了免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其8个突变体的原核表达载体，并进行了表达纯化。使用的表达载体是pET32a，得到的蛋白是融合蛋白，其主要是以包涵体为主。包涵体变性、复性是本部分的难点。
目前，对于包涵体变性，常用的变性剂主要有尿素(8M)、盐酸胍(GdnHCl 6-8M)，通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去垢剂如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。极端pH可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH＞9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。变性剂的使用浓度和作用时间一般在偏碱性的环境中，如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解[Rudolph，R.等.FASEB 1996，1049-56；Clark，E.B.等.Methods Enzymol.1999，309217-236；M.M.Altamirano等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997，943576-3578；R.Wito等.Protein Express.Purif.2002，25138-48；Suenaga，M.等.Biotechnol.Appl.Biochem.1998，28119-124]。
复性通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。复性中常采用的方法有稀释复性直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。透析复性好处是不增加体积，逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。超滤复性在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。柱上复性是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95％以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20％左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等[Giovane，C.等.J.Mol.Recognit.1999，12141-152；Ben Khalifa等，J.Mol.Recognit.2000，13127-139；Christensen，L.L.Anal.Biochem.1997，249153-164；Lilie，H.等.Curr.Opin.Biotechnol.1998，9497-501]。
复性效果的检测根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。1、凝胶电泳一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。2、光谱学方法可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。3、色谱方法如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，4、生物学活性及比活测定一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。5、黏度和浊度测定复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。6、免疫学方法如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态[Fischer，B.等，.Arzneimittelforschung.1992，421512-1515；Buchner，J.等.Anal.Biochem.1992，205263-270；Rogl，H.等，FEBS Lett.1998，42321-26；Mihic，S.J.等.BioTechniques.1996，20804-808；Werner，M.H.等.FEBS Lett.1994，345125-130；Batas，B.等.Biotechnol.Bioeng.1996，5016-23]。
根据目前包涵体变性、复性存在的问题，本发明者选择价格便宜的尿素为变性剂，复性方法采用柱上复性[Colangeli R.等.J.Chromatography B 1998，714223-235；Rapid andefficient purification and refolding of a(His)6-tagged recombinant protein produced in E.coli asinclusionbodies，18-1134-37，Amersham Pharmacia Biotech]。根据纯化结果和下一部分的活性检测结果，该方法是成功的。这样，仅用二步纯化法和His-Ni++柱上复性得到了目的蛋白，既节省了时间又减少了目的蛋白的损失。
实施例4 免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体体外活性研究免疫毒素原核表达载体构建成功后，转化BL21，挑选高表达阳性克隆，经His-Ni++亲和柱和分子筛纯化后，发明人对其体外生物学功能进行了研究，主要包括免疫毒素体外抑制蛋白合成作用、对P230阳性肿瘤细胞的生长抑制作用。
实验材料1.1肝癌细胞系ch-hep-1、ch-hep-3、BEL7404均由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供。
1.2RPMI-1640/DMEM混合培养基美国GIBCO公司，等比例混合0.22um滤膜过滤除菌，不含抗生素。
1.3胎牛血清杭州四季青产品，工作浓度为10％。
1.41×PBS溶液NaCl、KCl购自上海试剂二厂，Na2HPO4、KH2PO4购自上海试剂四厂，140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，溶于蒸馏水中，pH7.2，0.22μm过滤除菌。
1.5胰蛋白酶消化液胰蛋白酶购自美国sigma公司，浓度为0.05％；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)购自汕头市光华试剂厂，浓度为0.02％；溶于1×PBS溶液中，0.22μm过滤除菌。
1.6Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System体外蛋白翻译试剂盒购自Proega公司
1.7CellTiter96Aqueous非同位素细胞增殖试验试剂盒购自Promega公司1.8主要仪器LB 9507荧光记数仪，美国Berthold公司；Elx型自动酶标比色仪，美国BIO-TEK公司；CO2培养箱和超净工作台，美国Revco公司；流式细胞仪，美国Becton公司；-80℃低温冰箱ReVCO，Asheville，N，C.，U.S.A；台式低温离心机美国Eppendorf公司产品，5810R型。
实验方法2.1荧光素酶蛋白体外翻译实验利用兔网织红细胞翻译系统体外翻译荧光素酶，荧光计数仪检测荧光强度，绘制体外荧光素酶体外合成的量效曲线。
1)入下列反应物，混匀。
Flexi兔网织红细胞裂解液35μl氨基酸混合物，减去亮氨酸，1mM0.5μl氨基酸混合物，减去甲硫氨酸，1mM 0.5μl氯化钾，2.5M 1.4μlRNasin核糖核酸酶抑制剂(40u/μl) 1μl萤光素酶RNA，1mg/ml 0.1μl，0.2μl，0.4μl，0.8μl，1μl无核酸酶水终体积 50μl2)将上述反应物在30℃孵育60-90分钟3)反应产物可以直接进行下一步检测或在-20℃保存(2个月)或-80℃(6个月)，不影响荧光素酶的活性。
4)荧光素酶催化发光的最佳温度是20-25℃，将反应底物在室温放置30分钟以上，取50μl底物加入荧光检测管，设置程序，准备读数。
5)取2.5μl的荧光素酶反应产物加入到上述荧光检测管中，轻轻混匀，放入荧光计数仪中读数。
6)绘制荧光素酶量效曲线。
2.2免疫毒素体外抑制荧光素酶蛋白合成实验根据荧光素酶体外合成实验，发明人选取荧光素酶RNA 0.6ng进行体外蛋白合成抑制实验。
1)加入下列反应物，混匀。
Flexi兔网织红细胞裂解液35μl氨基酸混合物，减去亮氨酸，1mM0.5μl氨基酸混合物，减去甲硫氨酸，1mM 0.5μl
氯化钾，2.5M 1.4μlRNasin核糖核酸酶抑制剂(40u/μl) 1μl萤光素酶RNA，1mg/ml 0.1μl，0.2μl，0.4μl，0.8μl，1μl无核酸酶水终体积 50μl同时加入不同浓度的免疫毒素。
2)将上述反应物在30℃孵育60-90分钟；3)反应产物可以直接进行下一步检测或在-20℃保存(2个月)或-80℃(6个月)，不影响荧光素酶的活性；4)荧光素酶催化发光的最佳温度是20-25℃，将反应底物在室温放置30分钟以上，取50μl底物加入荧光检测管，设置程序，准备读数；5)取2.5μl的荧光素酶反应产物加入到上述荧光检测管中，轻轻混匀，放入荧光计数仪中读数；6)绘制蛋白抑制曲线，计算每个免疫毒素蛋白的IC50。每个蛋白重复6次实验。
2.3免疫毒素与靶抗原结合能力检测2.3.1流式细胞仪检测取肝癌细胞系细胞1×105细胞，与适当浓度的鼠源SM5-1和FITC-immunotoxin温育1小时，然后用2％BSA-PBS洗涤细胞3次后，进行流式细胞仪分析。
2.3.2Western Blotting鉴定1)取15μl样品做常规SDS-PAGE电泳；2)取出凝胶置于PVDF膜上，在转移缓冲液中电转移1小时，电流为360mA；3)转移结束后，用10％脱脂奶粉封闭膜1小时，加入1∶500的多克隆抗体与膜作用1小时，PBS洗涤34)加入1∶500的二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔G(H+L)与膜作用1小时，经PBST(含0.1％Tween20的PBS)洗涤3次；膜置于DAB底物液中显色。
2.1confocal实验观察免疫毒素的内吞过程。
1)选用p230高表达的肝癌细胞ch-hep-3，调整细胞密度，接种6孔板，每孔接种5×104。无菌盖玻片置于6孔板中，37℃，5％CO2孵箱培养24小时；2)分别在六孔板中加入50ug/mlFITC-PE38KDEL、FITC-SM5-1、FITC-CD25-PE38KDEL、FITC-SM5-1-PE38KDEL，37℃5％CO2孵箱培养；3)每个样品分别在作用10min、2h时，取贴附有细胞的盖玻片，置于3.7％甲醛固定15分钟，0.2％Tween PBS洗10分钟，将相应的盖玻片置于载玻片上，在共聚焦显微镜下观察细胞内吞情况。
2.5免疫毒素对肿瘤细胞的生长抑制实验1)选用p230高表达和中表达的肝癌细胞ch-hep-3、ch-hep-1和p230表达阴性的肝癌细胞BEL7404。在含10％FCS的RPMI1640/DMEM(v∶v＝1∶1)培养液中培养肿瘤细胞至对数生长期，收集细胞并调整细胞密度至1×105/ml。96孔板每孔加入100μl细胞悬液，在37℃、5％CO2的孵箱中孵育24小时；2)在1.5ml Epperdorf管中，以含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM培养液倍比稀释免疫毒素蛋白(浓度随不同细胞株而不同)，加入96孔板，每个浓度设3个复孔，同时设阴性对照和无关对照。然后在37℃、5％CO2的孵箱中孵育24小时；3)每孔加MTS/PMS显色剂(v/v20∶1)20μl，37℃、5％CO2的孵箱中孵育3小时；4)酶标仪以波长490nm(参考波长570nm)检测各孔的光吸收值A。用样品稀释度对A值绘制剂量反应曲线，判断免疫毒素蛋白对细胞株的体外杀伤作用；5)每个蛋白对肿瘤的抑制实验均重复6次以上。
实验结果3.1PE38KDEL的生物学功能测定首先，用体外蛋白翻译系统检测了PE38KDEL抑制荧光素酶的生物学功能。随着荧光素酶mRNA量的增加，荧光素酶蛋白也合成。根据荧光素酶体外蛋白合成曲线(图10)，选择荧光素酶mRNA 0.6ug进行蛋白合成抑制实验。当加入不同浓度的PE38KDEL，荧光素酶蛋白合成逐渐减少(图11)。
3.2SM5-1-PE38KDEL及其突变体的抑制蛋白合成功能根据上述实验，PE38KDEL蛋白能够在体外抑制荧光素酶蛋白的合成，具有生物学功能。将PE38KDEL与SM5-1单链抗体相连构建免疫毒素，进行原核表达、纯化，用兔网织红细胞体外蛋白翻译体系检测其生物学活性，结果表明天然的免疫毒素能够明显地在体外抑制荧光素酶的合成，IC50为5.305pmol。8个突变体蛋白在体外均能在一定程度上抑制荧光素酶的合成，其中突变体1的活性与天然型的免疫毒素活性接近(IC50为5.550pmol)，从8个突变体中筛选4个活性较高的进行体外细胞毒作用研究和体内功能研究(表2、3)。
表2 rSM-PE38KDELs在无细胞网织红细胞试验中的酶活性


表3 rSM-PE38KDELs在无细胞网织红细胞试验中的酶活性

3.3SM5-1-PE38结合抗原实验通过体外蛋白翻译实验，SM5-1-PE38及其突变体均能抑制荧光素酶和合成，发明人选择天然的免疫毒素SM5-1-PE38KDEL和突变体1检测其结合抗原p230的能力。流式细胞仪结果表明随着细胞表达抗原的增加，FITC-免疫毒素荧光强度逐渐增强，说明两个蛋白都具有与p230抗原结合的能力；Western blot结果表明兔的PE多克隆抗体能够与免疫毒素的PE38KDEL毒素部分结合而显色。这两实验表明两个蛋白既具有结合抗原的特性又保留了完整的毒素，其细胞毒作用需要用MTS法检测。
3.4SM5-1-PE38免疫毒素的内吞将FITC标记的蛋白加入接种的细胞培养液中，分别在作用1min、5min、10min、30min、1h、2h固定细胞，在共聚焦显微镜下观察蛋白在细胞的分布。发明人发现抗体SM5-1在1min时有少许进入细胞，大部分集中于细胞表面，PEKDEL和CD25-PE38KDEL在2h都没有观察到内吞。SM5-1-PE38KDEL在1min时分布在细胞表面，随着时间的延长，逐渐进入细胞。图14-15分别是作用10min和2h的蛋白内吞图。
3.4SM5-1-PE38KDEL及其突变体体外细胞毒作用。
从体外蛋白翻译实验中，发明人筛选SM5-1-PE38KDEL及4个突变体进行体外细胞毒作用研究。方法采用MTS和细胞计数法，选用p230表达逐渐减弱的细胞株ch-hep-3、ch-hep-1、BEL7404。结果发现突变体1细胞毒活性较天然性的免疫毒素仅降低一倍，其它三个突变体分别降低了6、14和30倍(见表4)。图15显示了用细胞记数法检测免疫毒素细胞毒作用。
表4 三个细胞系内的细胞毒性活性

对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想。在基因工程药物领域令人瞩目的一个动向是发展靶向药物和靶向治疗，特别是近年发展起来的以基因工程抗体为基础的分子靶向药物(生物导弹)，掀起了针对肿瘤的免疫毒素治疗研究的新高潮，即利用DNA重组技术，将scFv基因与经削减的毒素基因融合并克隆到适应的表达载体，构建分子量小、均一性高的免疫毒素[I.Pastan等，Cancer Immunol Immunother.2003，52338-341；R.J.Kreitman等，JClin Oncol.2000，181622-1636；R.J.Kreitman等，N Engl J Med.2001，345241-247；MessmanRA等，Clin Cancer Res.2000，61302-1313；Frankel AE等，Cancer Res.2001，615070-5077；Frankel AE等.Clin Cancer Res.2002，81004-1013；Grossbard ML等，Blood.1992，79576-585]。
SM5-1是新的小鼠抗人单克隆抗体，其抗原p230特异表达于人肝癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞表面。利用单克隆抗体SM5-1对401例临床黑色素瘤标本(250例原发，151例转移)的筛查中，p230在98％的标本中表达，而在正常组织中，除在汗腺和浆细胞表面有少量表达外，在其它正常组织中均不表达[Trefzer U等.Arch Dermatol Res，2000，292583-589]。但是目前报道的其它靶基因，不仅表达于肿瘤组织，而且表达于一些重要的正常组织器官，如肝、肾、心和胸腺等[Shimizu M等.Biochem Biophys Res Commun.1996，228(2)375-9；Yamashita Y等.Hum Gene Ther.2002，13(2)275-86；Mitsiades N等，Blood.2002，99(6)2162-71]。用流式细胞仪对十余株肝癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞株筛查结果中发现，p230不仅表达于黑色素瘤细胞株，还表达于肝癌和乳腺癌细胞，而且在肝癌细胞株的表达水平更高，理论上为一理想的肿瘤治疗靶点，因此利用抗p230的单克隆抗体SM5-1制备新的免疫毒素有很好的临床应用前景。
发明人构建了新的免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其8个突变体，在成功地表达和纯化后，发明人检测了其体外生物学功能。免疫毒素通过抗体的导向作用将PE送到肿瘤细胞表面，通过内吞作用进入细胞内部，通过作用于真核细胞的延长因子II(EF-II)抑制细胞蛋白合成，从而细胞死亡[Bonardi MA等.Cancer Res，1993，533015-3121；VanderSpek J等.Mol Cell Biochem.1994，138151-156；L.H.Pai等，Nature Med.1996，2350-353；R.J.Kreitman等，J Clin Oncol.2000，181622-1636；R.J.Kreitman等，N Engl J Med.2001，345241-247]。因此，发明人采用了兔网织红细胞裂解物(蛋白体外翻译系统)体系，体外翻译荧光素酶，同时加入不同浓度的免疫毒素，用荧光记数仪检测荧光素酶合成情况。结果表明天然型免疫毒素和8个突变体在体外均能不同程度的抑制荧光素酶mRNA合成蛋白荧光素酶，从9个免疫毒素蛋白中，发明人筛选出天然型和4个突变体的免疫毒素进行体外肿瘤细胞杀伤实验。
发明人表达纯化的免疫毒素具有抑制蛋白合成的生物学活性，在此基础上，发明人选用了3株表达不同p230抗原(强、中、弱)的肝癌细胞检测其杀伤肿瘤的功能。用MTS检测它们对p230抗原表达不同的三株细胞(ch-hep-1、ch-hep-3、BEL7404)的细胞毒作用，发现突变体1较天然型的细胞毒活性仅降低了一倍，另外三个突变体的细胞毒作用降低了6-30倍。结果表明，通过定点突变氨基酸，免疫毒素的细胞毒作用均受到不同程度的降低。
免疫毒素能否发挥特异性杀伤肿瘤的特性取决于抗体能不能内吞。尽管体外细胞毒杀伤实验证明免疫毒素SM5-1-PE38能够发挥细胞毒作用，但是发明人需要证明免疫毒素是否通过内吞细胞而发挥作用，因此在共聚焦显微镜下发明人观察免疫毒素作用于肿瘤细胞的过程，发现免疫毒素可以在很短的时间内就可以进入细胞而发挥细胞毒作用。所以发明人选择突变体1和天然型免疫毒素进行体内实验研究。
实施例5免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体体内毒性及抗肿瘤作用研究根据上述实验结果，免疫毒素SM5-1-PE38KDEL及其突变体均能在体外抑制荧光素酶蛋白的合成，而且能够明显抑制p230阳性的肝癌细胞的生长。但是，免疫毒素普遍存在血管渗漏的副作用，利用INSIGHTII生物软件突变引起渗漏综合征的氨基酸位点，试图改善此副作用的发生，发明人共构建了8个突变体。通过建立渗漏综合征和肝癌动物模型，检测突变后的免疫毒素是否改善了渗漏综合征的出现以及体内抑制肝癌的生长。
免疫毒素通过抗体的导向作用将PE送到肿瘤细胞表面，通过内吞作用进入细胞内部，通过作用于真核细胞的延长因子II(EF-II)抑制细胞蛋白合成，从而细胞死亡。体外培养中，SM5-1可在无补体作用条件下，通过p230诱导肝癌细胞株(CH-Hep-3)和黑色素瘤细胞株(U10)发生凋亡。免疫毒素SM5-1-PE38KDEL是否能够诱导细胞凋亡有待证实。
实验材料1.1细胞株肝癌细胞系ch-hep-1、ch-hep-3、BEL7404由第二军医大学国际合作肿瘤研究所提供。
1.2细胞培养试剂RPMI1640、DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶均为Invitrogen公司产品，新生牛血清购自杭州四季青公司。
1.3实验动物ICR小鼠雌性(6-8周龄)购自第二军医大学，BALB/c裸鼠6周龄，购自和饲养于第二军医大学动物所(GLP级)。
1.4主要仪器C02培养箱，美国Revco公司。超净工作台，造鑫企业有限公司，VCM-620型。-80℃低温冰箱ReVCO，Asheville，N，C.，U.S.A。流式细胞仪美国Becton Dickinson，SanJose，CA产品。电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司，DK-600型。普通显微镜中国重庆光学仪器厂，XDS-1B型。倒置相差显微镜德国Zeiss公司产品，Axiovert135型。
实验方法2.1渗漏综合征模型的建立2.1.1渗漏综合征预实验根据免疫毒素用于临床实验的文献报道，大多数的免疫毒素都能不同程度地引起血管渗漏综合征(VLS)。发明人选用不同的动物品系ICR小鼠、昆明种小鼠和SD大鼠建立肺的渗漏综合征。根据体重，尾静脉注射不同剂量的免疫毒素蛋白，24小时后，麻醉处死小鼠，解剖、观察其肺部病变。根据小鼠对免疫毒素敏感性的不同，发明人选择ICR小鼠建立肺的渗漏综合征模型(PVL)研究免疫毒素突变体的毒副作用。
2.1.2免疫毒素突变体对ICR小鼠肺的影响根据渗漏综合征预实验选择ICR小鼠进行研究。选择体重相近的小鼠随机分为PBS组、sm5-1(sFv)组，SM5-1-PE38KDEL(1mg/kg)、SM5-1-PE38KDEL.mut1、3、5、7(3mg/kg)，每组6只。尾静脉注射相应的蛋白。24小时后，麻醉处死小鼠，观察其肺部病理变化。
2.2SM5-1-PE38KDEL.mut1的毒性实验根据上述实验结果，筛选SM5-1-PE38KDEL(mut1)进行毒性研究。选用ICR小鼠(6-8周龄)，随机分为4组(8只/组)4mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg，尾静脉给药。观察小鼠肺部变化。
2.3肝癌肿瘤模型的建立1)细胞收集将体外扩增的肝癌细胞ch-hep-1胰酶消化，用1×PBS离心洗涤两次，细胞计数，调整细胞密度为5×107/ml，用预冷的1×PBS重悬。
2)细胞接种接种部位的皮肤用75％酒精消毒，以带有5号针头的1ml注射器吸取0.1ml瘤细胞悬液，接种于裸鼠的腋下或背部皮下，含活细胞总数5×106，隔日观察记录肿瘤细胞生长情况。
2.4免疫毒素SM5-1-PE38KDEL体内抗肿瘤研究发明人将接种肝癌细胞的裸鼠随机分为PBS组、SM5-1(sFv)、PE38KDEL组、CD38-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL组和SM5-1-PE38KDEL.mut1组。在皮下接种肝癌细胞第5、7、10天尾静脉注射免疫毒素蛋白，剂量分别为0.4ug/g(SM5-1-PE38KDEL)和1.2ug/g(mut1)，对照组尾静脉注射相应的体积。隔日观察小鼠的肿瘤生长情况。
皮下接种肝癌细胞，待肿瘤大小在30-50mm3时，随机分为PBS组、SM5-1(sFv)、PE38KDEL组、CD25-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL.mut1(1mg/kg)组、SM5-1-PE38KDEL.mut1(5mg/kg)组。观察小鼠的肿瘤生长情况。测最长径a和最短径b；根据以下公式计算肿瘤大小S，S＝ab2/2。
2.5免疫毒素的作用机理研究流式细胞术PI染色检测细胞凋亡峰。1)待测细胞胰酶消化；2)用含血清培养基洗细胞1次；3)离心，75％乙醇4℃固定30min；4)离心，500μl RNA酶(2mg/ml)4℃作用30min；5)离心，500μl PI(10mg/ml)4℃避光作用30min；6)离心，用200μlPBS重悬，在FCM上，通过测荧光表达，检测细胞凋亡情况。
实验结果3.1渗漏综合征模型的建立根据文献报道，选用昆明种小鼠、ICR小鼠、SD大鼠观察其对免疫毒素的敏感性。尾静脉注射免疫毒素(SM5-1-PE38KDEL)(3mg/kg)，24小时内，三种老鼠对免疫毒素表现出不同的敏感性。其中，SD大鼠出现症状最早，对免疫毒素敏感性最高，其次为ICR小鼠。但是由于SD大鼠体重比小鼠体重重，需要大量的免疫毒素蛋白，这就加大了蛋白纯化工作，其次在实验操作方面也带来一定的麻烦。发明人选用ICR小鼠构建肺的渗漏综合征模型。
将体重相近的ICR小鼠随机分为5组SM5-1-PE38KDEL(1mg/kg)、mut1、3、5、7(3mg/kg)，尾静脉给药，24小时后，麻醉处死，解剖小鼠发现SM5-1-PE38KDEL(1mg/kg)组小鼠肺部均有血性液体渗出，余4组小鼠肺部均有不同程度的液体渗出，收集渗出液及湿肺，称重(肺湿重)，然后置于68℃烤箱烘干(12小时)，称重，结果如表5和图16、17。通过t检验，有统计学意义，其中mut1效果最好。
表5 免疫毒素对小鼠肺的影响

3.2SM5-1-PE38KDEL.mut1的毒性实验根据上述实验结果，发明人筛选出SM5-1-PE38KDLE.mut1进行毒性研究，给药24小时内，12mg/kg组小鼠6只死亡，余2只在48小时内死亡。解剖发现小鼠肺部有大量的血性液体渗出。10mg/kg组小鼠第7天死亡4只，解剖发现都有血性液体渗出。8mg/kg、4mg/kg组小鼠在一周内都未死亡，在第9天将所有存活小鼠麻醉处死，解剖小鼠，10mg/kg组有5只小鼠出现PVL。8mg/kg、4mg/kg组小鼠未出现明显的PVL，结果表明SM5-1-PE38KDEL出现PVL的剂量为≥1mg/kg，而SM5-1-PE38KDEL.mut1出现PVL的剂量为＞8mg。发明人将对照组、SM5-1-PE38KDEL(1mg/kg)、mut1(1mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、10mg/kg)的肺组织用10％福尔马林固定24小时后，石蜡包埋，切片，HE染色，结果如图18所示。
3.3肝癌肿瘤模型的建立发明人选择ch-hep-1肝癌细胞建立肝癌动物模型。将细胞体外扩增到一定数量，皮下接种肝癌细胞(5×106/只)，三周左右，肉眼可观察到黄豆大小的肿瘤生长。如图19所示。
3.4SM5-1-PE38KDEL体内抗肿瘤研究皮下接种ch-hep-1细胞，每只裸鼠接种5×106细胞，随机分为PBS组、SM5-1(sFv)组、PE38KDEL组、CD25-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL.mut1组。根据体外实验SM5-1-PE38KDEL和mut1的IC50，发明人选择它们的给药剂量为0.4ug/g(SM5-1-PE38KDEL)、1.2ug/g(mut1)。在皮下接种细胞第5、7、10天，三次尾静脉给药，对照组尾静脉注射相应体积的PBS、PE38KDEL、SM5-1(sFv)、CD25-PE38KDEL。第3周后，PBS组和SM5-1(sFv)组等对照组相继观察到不同大小的肿瘤生长，而SM5-1-PE38KDEL和SM5-1-PE38KDEL.mut1组均在第5周都未观察到肿瘤的生长，但是，SM5-1-PE38KDEL组小鼠出现体重减轻、精神状态萎靡等症状，计算小鼠成瘤率，结果如表6和图20。
免疫毒素SM5-1-PE38KDEL和mut1均能预防肝癌的发生，为了进一步证比较mut1与天然的SM5-1-PE38KDEL的疗效，待肿瘤大小在30-50mm3时，随机分为PBS组、SM5-1(sFv)、PE38KDEL组、CD38-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL组、SM5-1-PE38KDEL.mut1(1mg/kg)组、SM5-1-PE38KDEL.mut1(5mg/kg)组。观察小鼠的肿瘤生长情况。4周后，对照组肿瘤平均体积为600mm3，而天然型SM5-1-PE38KDEL组肿瘤没有增长；突变体1(1.2mg/kg)组肿瘤也没有增长；突变体1(5mg/kg)组肿瘤基本消退(图21)。
表6免疫毒素预防肝癌发生的作用(成瘤率)


3.5免疫毒素作用机理研究体内外实验证实免疫毒素SM5-1-PE38KDEL均能有效地抑制肝癌细胞的发生。通过流式细胞术实验，检测免疫毒素作用后是否出现凋亡。SM5-1-PE38.mut1选择5pmol、10pmol、20pmol三个浓度，同时设空白、SM5-1单链抗体、PE38KDEL、SM5-1单链抗体+PE38KDEL、CD25-PE38KDEL对照。将ch-hep-3细胞分别给予不同处理，作用24小时后，显微镜下观察，在SM5-1-PE38.mut1作用下，ch-hep-3细胞出现皱缩，而其它处理均未出现明显的细胞皱缩，流式细胞术显示SM5-1-PE38.mut1在5pmol、10pmol、20pmol浓度下，细胞均出现凋亡峰(图22)。
本研究发明人针对含PE的免疫毒素所引起的渗漏综合征的问题，对PE毒素进行基因改造。PE毒素的晶体结构在80年代就已经用X衍射技术结晶出来。用PE毒素构建的免疫毒素大部分都有渗漏综合征的问题存在。最新报道渗漏综合征的发生是由于毒素分子中具有普遍的氨基酸序列X(D)Y，对于PE毒素，X(D)Y为323-325(GDL)，405-407(GDV)，580-582(GDL)。从PE毒素的晶体结构观察，这3个位点均位于分子表面，这可能也就是其能作用于血管内皮细胞而引起渗漏的原因。发明人应用INSIGHTII软件的同源模建方法，直观地模拟了PE38KDEL的三维结构，发现其三个位点的位置没有改变。通过分析这三个位点与周边相邻位点氨基酸侧链之间的相互作用，发明人构建了SM5-1-PE38KDEL的8个突变体。体外抑制蛋白实验证明发明人选择的突变位点与其生物学活性也有一定的关系，结合体外细胞毒作用，发明人筛选4个突变体作用于小鼠，观察是否能够改善渗漏综合征。渗漏综合征的主要症状有血清蛋白减少、体重增加，严重的有肺水肿、高血压、肌痛、呼吸困难等。但是，尾静脉注射免疫毒素的小鼠并不是非常明显地出现类似人类的症状，它们只出现PVL。尾静脉注射免疫毒素，构建了与血管渗漏综合征相似的肺渗漏综合征(PVL)。结果表明，经过保守突变的免疫毒素在保持一定的细胞毒作用下，3个突变体对PVL起了改善作用，特别是突变体1既保持了很高的细胞毒作用，有明显减弱甚至使PVL消失。所以发明人的突变是成功的，这为进一步研究打下了理论基础。
通过体外实验和体内渗漏综合征实验研究，发明人对未突变的SM5-1-PE38KDLE和突变体1进行毒性研究和体内抗肿瘤研究。毒性实验结果表明未突变的SM5-1-PE38KDEL在≥1mg/kg的情况下就可以诱发PVL，当3mg/kg时，小鼠会由于呼吸困难而很快死亡。突变体1在＞8mg/kg的情况下肺部才会出现轻微的液体渗出，10mg/kg时，绝大多数小鼠会出现PVL，但是一周内小鼠均没有死亡，12mg/kg时，小鼠才出现呼吸困难而立即死亡。因此，尽管突变体细胞毒活性较未突变的免疫毒素降低了一倍，但是其副作用较未突变的降低了至少8倍。这样发明人就需要比较二者的体内抗肿瘤作用。
皮下接种肿瘤细胞第5、7、10天，发明人尾静脉注射两种免疫毒素，观察小鼠成瘤情况。实验结果表明对照组小鼠均在3周后先继出现肿瘤，而注射免疫毒素的两组小鼠均在7周后仍未观察到肿瘤生长，但是未突变组均在5周后出现体重减轻，精神状态萎靡，到第7周，体重减轻20％。尽管二者都能抑制肿瘤的生长，但是在同样疗效的作用下，突变的免疫毒素较未突变的毒性降低，应用更加安全。在此基础上，待肿瘤大小为30-50mm3时，尾静脉注射天然型SM5-1-PE38KDEL和突变体1，4周后，对照组肿瘤平均体积约600mm3，而天然型SM5-1-PE38KDEL(0.5mg/kg)组肿瘤和突变体1(1.2mg/kg)组肿瘤没有增长；突变体1(5mg/kg)组肿瘤基本消退。毒性作用的存在限制了天然型SM5-1-PE38KDEL的给药剂量(0.5mg/kg)，在一定程度了延缓了肿瘤的生长速度，但是并不能使肿瘤消退，而突变体1的毒性大大降低，给药剂量可以是天然型免疫毒素的10倍，从而使肿瘤消退。在共聚焦显微镜镜下，免疫毒素能够迅速内吞细胞而发挥抑制蛋白合成，诱导细胞凋亡.再一次证明发明人通过INSIGHTII软件选择突变位点是成功的。
近20年来，免疫毒素分子在不断的完善，特别是在血液病方面，越来越多的免疫毒素展示了很好的应用前景[Sausville，E.A.等.Blood.1995，853457-3465；Arthur E.F等，Clin.Cancer Res，2000，6326-334；O.W.Press等，Cell.Immunol.1986，10210-20；Kreitman RJ等，Int J Cancer.1999，81148-156；Kreitman RJ等，N Engl J Med.2001，345241-249；Pai LH等，Nature Med.1996，2350-358].突变体1既保持了高的细胞毒活性，其毒性降低了8倍以上，能够安全地预防和抑制肿瘤的生长，为进一步的研究提供了方法和理论基础。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表<110>郭亚军<120>高效低毒免疫毒素及其制备方法和应用<130>053901<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>118<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>1Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser1 5 10 15Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val20 25 30Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly35 40 45Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys50 55 60Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val85 90 95Tyr Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr100 105 110Thr Val Thr Val Ser Ser115<210>2
<211>114<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser20 25 30Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln85 90 95Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg Glx<210>3<211>344<212>PRT<213>绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)<400>3Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro1 5 10 15Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu20 25 30Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala
35 40 45Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu50 55 60Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln65 70 75 80Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu85 90 95Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn100 105 110Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr115 120 125Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg130 135 140Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln145 150 155 160Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu165 170 175Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln180 185 190Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala195 200 205Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg210 215 220Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu225 230 235 240Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
245 250 255Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp260 265 270Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Gly Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu275 280 285Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro290 295 300Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro305 310 315 320Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro325 330 335Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu340<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ggagatctgg acgacgacga caaggaggtc cagctgcagc agtct 45<210>5<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5accagagcca ccaccgccag agccaccacc acctgaggag acggtgaccg tggt 54<210>6<211>54
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6tctggcggtg gtggctctgg tggcggtggt tctaacatta tgatgacaca gtcg 54<210>7<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7accagagcca ccaccgccag agccaccacc accccgcttt atttccagct tggt 54<210>8<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ggaagctttt acttgtcatc gtcgtccttg tagtcccgct ttatttccag cttggt 56<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9aaagatctgg acgacgacga caagggcggc agcctggccg cgctg 45<210>10<211>41<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10aaaagctttt acagttcgtc tttcggcggt ttgccgggct g 41<210>11<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11tctggcggtg gtggctctgg tggcggtggt tctggcggca gcctggccgc gctg 54<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12gtcgccgctg tccgccgggc cgttggccgc gccggcctc39<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>13gaggccggcg cggccaacgg cccggcggac agcggcgac39
权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，它包含小鼠抗人单克隆抗体SM5-1的单链抗体ScFv，以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL或其293、297、328、416、417、421、576、578、579位氨基酸有突变的突变体，所述单链抗体ScFv具有重链可变区-接头-轻链可变区的结构，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；所述免疫毒素PE38KDEL具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突变选自以下各组(1)A293(Arg)-Lys，A416(Asn)-Gln，A576(Arg)-Lys；(2)A293(Arg)-Trp，A416(Asn)-Ala，A576(Arg)-Trp；(3)A297(Leu)-Ala，A416(Asn)-Gln，A576(Arg)-lys；(4)A297(Leu)-Gln，A416(Asn)-Ala，A576(Arg)-lys；(5)A297(Leu)-Ala，A417(Trp)-Tyr，A579(Gly)-Ala；(6)A297(Leu)-Gln，A416(Asn)-Ala，A576(Arg)-lys；(7)A328(Ala)-Val，A421(Arg)-Lys，A578(Val)-Ala；(8)A328(Ala)-Tyr，A421(Arg)-Tyr，A578(Val)-Ser。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述接头由3-5个(GGGGS)重复序列组成。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子序列以及与所述序列操作性相连的表达调控序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5所述的表达载体转化。
7.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
8.权利要求1所述的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌和黑色素瘤。
10.一种制备权利要求1所述的分离的多肽的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求4所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述多肽表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述多肽。
全文摘要
本发明提供了一种分离的多肽，它包含小鼠抗人单克隆抗体SM5－1的单链抗体ScFv，以及与所述单链抗体ScFv偶联的免疫毒素PE38KDEL或第293、297、328、416、417、421、576、578、579位氨基酸有突变的突变体。本发明还提供了编码上述多肽的DNA分子、含有该DNA分子的表达载体和宿主细胞、其制备方法、用途以及含有该多肽的药物组合物。
文档编号A61K39/395GK1869070SQ20051002624
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月27日 优先权日2005年5月27日
发明者郭亚军 申请人:郭亚军