专利名称：碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水解酶——碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，属于酶学领域。
近年来，酶学在临床诊断与治疗中的应用发展非常迅速，现已分别发展为医学中的两个新领域，即诊断酶学和治疗酶学。目前已有上百种酶试验可用于临床诊断。临床酶学的这一发展，部分是由于测定技术的发展，使许多酶的测定已日益精确和简便，可用于常规测定。部分是由于认识到某些疾病发展过程中酶活力必然发生改变这一客观事实，特别是在疾病的早期，用X光片、CT还未能发现病灶时，而体内的酶活性已开始发生变化。如果能定期查体，可做到对疾病的早期发现。值得一提的是，目前临床上诊断酶学的应用多数是对酶的总活性的测定，并且市场上已有相应试剂盒销售，其缺点是缺乏器官特异性。目前有关酶活性测定的试剂盒约有20～30种，同工酶检测试剂盒约有3～5种，但多数用的是化学抑制法或免疫抑制法。而同工酶是指酶蛋白结构不同而具有相同的催化特性的一类酶，不同的同工酶来自不同的组织和细胞。当某一组织或器官发生病变时，由于组织受损或细胞膜通透性的变化，引起细胞内酶大量释入血液而引起血清酶活性的改变。通过同工酶的检测可确定患病部位，从而提高酶学诊断的特异性和敏感性，还可判断预后。目前由于自行配制酶显示液，因所用试剂品种繁多，规格不一，致使酶显示结果不稳定，结果判定不统一，且同工酶检测操作较繁琐，费时等等，特别是大型生化分析仪的应用，使临床生化检测的操作更简便，省时、省力，但其是对总酶活性的测定，缺乏组织特异性，相比较，同工酶的检测使病变早期定性和定位就精确的多了。
本发明的目的在于提供一种质量优良、性能稳定、重复性能好，同时大大简化了检测的操作过程且使用该试剂盒可使同工酶的检测操作规范化，从而使酶活性的检测及质量控制达到统一的标准的水解酶诊断试剂盒的制备。
本发明的目的由如下技术方案实施做醋酸纤维素薄膜电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.02～0.1mol/L电极液，pH为7.5-9.0；(2)、用冰乙酸做为固定剂；(3)、配制浓度为0.03～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液；将(3)所述的泡醋纤膜缓冲液分装安瓿A中；将(2)所述的固定剂分装安瓿E；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.05～0.3mol/L缓冲液，pH为9.0～11.0，分装安瓿B中，(b)将底物和重氮盐染料分装安瓿C；(c)、将琼脂糖或琼脂分装安瓿D；其中安瓿C中的内容物底物和重氮盐染料、安瓿D中的内容物琼脂糖或琼脂，按重量百分比，底物、重氮盐染料、琼脂糖或琼脂分别为20.0％～86.7％、10.5％～75.2％、1.2％～28.6％，将浓度为0.05～0.3mol/L的缓冲液为100ml～250ml分装安瓿B，用时将安瓿D加水加热溶解，然后将安瓿B、安瓿C、安瓿D的内容物混合即为显色液。
做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.02～0.1mol/L电极液，pH为7.5-9.0(2)、用冰乙酸做为固定剂分装安瓿E；(3)、琼脂糖凝胶的配制将琼脂糖(或琼脂)0.5g-1g加入浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液80ml～120ml，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A；或琼脂糖凝胶的配制也可以是将琼脂糖(或琼脂)、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮，按重量百分比分别为7.0％～32.3％、55.6％～91.0％、1.4％～19.4％，加入100ml～250ml浓度为0.05mol/L～0.2mol/L的泡醋纤膜缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A。
(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.05～0.3mol/L缓冲液，pH为9.0～11.0，分装安瓿B中，(b)将底物和重氮盐染料分装安瓿C；(c)、将琼脂糖或琼脂分装安瓿D；其中安瓿C中的内容物底物和重氮盐染料、安瓿D中的内容物琼脂糖或琼脂，按重量百分比，底物、重氮盐染料、琼脂糖或琼脂分别为20.0％～86.7％、10.5％～75.2％、1.2％～28.6％，将浓度为0.05～0.3mol/L的缓冲液100ml～250ml分装安瓿B，用时将安瓿B、安瓿C、安瓿D的内容物混合即为显色液。
显色液可以制备为冻干粉试剂，其是将所述安瓿B内装缓冲液和底物，溶解后冷冻干燥；其是将0.3g-1.5g底物加入100ml-250ml缓冲液分装安瓿B。所述安瓿C内装缓冲液和重氮盐染料，溶解后冷冻干燥，其是将0.2g-1g的重氮盐染料加入100ml-250ml的缓冲液分装安瓿C；用时将安瓿B内加水溶解，安瓿C内加水溶解，将安瓿B、安瓿C内容物混合，即为显色液。
所述安瓿B中配制的缓冲液，可用Tris系列的缓冲液、磷酸系列的缓冲液或硼酸缓冲液、二氨基二甲基1.3丙二醇-HCL缓冲液；所述安瓿C中底物可用萘酚或它的衍生物的磷酸酯，如α-萘酚磷酸或β-萘酚磷酸或α-萘酚磷酸盐类化合物、萘酚AS-MX磷酸、萘酚AS-BI磷酸，或其萘酚AS-MX磷酸盐类和萘酚AS-BI磷酸盐类，甲苯胺-5-溴-3-吲哚磷酸、硝基苯-5-溴-3-吲哚磷酸、磷酸甲苯胺盐；重氮盐染料可用固蓝B或固蓝BB、固蓝R或固蓝RR、固紫B、柘石榴红GBC、固红RC、固红TR、六偶氮付品红等。
此外，为提高ALP的特异性及敏感性，可结合用抑制剂和热失活法。显色时在显色液中加入下列任一种试剂，可特异性抑制某带而显示其它成份。这对于阐明ALP的脏器来源和病变定位，均具有重要价值。
特异性抑制剂在显色液中加入浓度为5～10mM L-苯丙氨酸，抑制ALP4、ALP5；浓度为5～10mM L-高精氨酸，抑制ALP2；浓度为5～10mM L-色氨酸或亮氨酸，抑制ALP4；浓度为3～5M尿素，抑制ALP3；浓度为1M乙二胺四乙酸，除ALP4外，其余均受抑制。
热失活法将样品在65℃水浴30分钟，除ALP4外，其余均受抑制。
碱性磷酸酶同工酶(ALP EC 3.1.3.1)是在碱性条件下水解多种磷酸酯的酶，广泛分布于人体各组织。同工酶的检测有助于肝脏疾患和骨骼疾患的诊断和鉴别诊断。
本发明的优点是将试剂分装于安瓿内，便于保存，性能稳定，重复性好，减轻了劳动强度，改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异，从而使操作规范化，使酶的检测及质量控制达到统一的标准，同时使用试剂盒简化了操作过程，省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用，为临床疾病的诊断与鉴别诊断提供依据。
实施例实施例1、醋酸纤维素薄膜电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.02mol/L巴比妥缓冲液为电极液，pH为8.0；(2)、用冰乙酸做为固定剂，取2ml分装安瓿E；(3)、配制浓度为0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A中；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.05mol/LTris缓冲液100ml，pH为9.0，分装安瓿B中，(b)将底物3mg和重氮盐染料10mg分装安瓿C；(c)、将琼脂糖0.3mg分装安瓿D；用时将安瓿B的内容物、安瓿C的内容物混合、安瓿D内容物加水加热溶解后，加入安瓿B的内容物、安瓿C的内容物的混合液，混合后即为显色液。
应用首先泡膜打开安瓿A加水至25ml，将醋纤膜泡在该液内20分钟。然后将醋纤膜取出，夹在滤纸中间吸去多余水份，膜条无光泽面朝上。用点样片醮血清点在距膜一端2cm处。将配制好的电极缓冲液倒入电泳槽内，使槽内电极缓冲液处于同一水平。在电泳槽的阴、阳极槽内分别用合适尺寸的滤纸折叠4层搭在槽的两侧，做为盐桥。将点样的膜条点样面朝下，点样处朝向阴极端搭在盐桥上，膜条需与盐桥贴紧，绷展。接通电源，调节电压100～260v，10～30分钟后，关闭电源。然后进行同工酶显色将安瓿B内液体加入安瓿C，使溶解，然后将安瓿D内干粉倒入一小试管，加1ml水，加热溶解，然后将安瓿B、安瓿C混合液加入溶解好的安瓿D液内，混匀，趁热铺在一个玻璃板上，冷却后，将电泳过膜条取出，点样面贴在胶板上，在37℃温育20～30分钟，即可见同工酶谱。
结果血清碱性磷酸酶(ALP)同工酶从正极向负极可出现ALP1-6条区带，正常人血清出现ALP2(肝型)和ALP3(骨型)两种同工酶。原发性肝癌、肝硬化时，肝型同工酶活性增强。成骨肉瘤、甲亢时骨型同工酶活性增强。妊娠中，血清可出现ALP4，如果ALP4活性急剧下降，常常是胎盘机能不全或胎儿已经死亡的诊断标志，其他人出现ALP4，预示有肿瘤疾患，ALP1和ALP6在病理情况时出现。
实施例2、做醋酸纤维素薄膜电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.1mol/Ltris-硼酸缓冲液为电极液，pH为9.0；(2)、用冰乙酸做为固定剂，取2.5ml分装安瓿E；(3)、配制浓度为0.1mol/Ltris-HCL泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A中；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.2mol/L硼酸-NaOH缓冲液100ml，pH为10.0，分装安瓿B中，(b)将底物10mg和重氮盐染料6mg分装安瓿C；(c)、将琼脂糖2mg分装安瓿D；用时将安瓿B的内容物、安瓿C的内容物混合、安瓿D内容物加水加热溶解后，加入安瓿B的内容物、安瓿C的内容物的混合液，混合后即为显色液。
应用如实施例1所述，结果也相同。
实施例3、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.08mol/Ltris-硼酸缓冲液电极液，pH为8.6；(2)、用冰乙酸做为固定剂，取2.5m1分装安瓿E；(3)、琼脂糖凝胶的配制将琼脂糖0.5g加入浓度为0.1mol/L泡醋纤膜缓冲液80ml，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.2mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇缓冲液100ml，pH为11.0，分装安瓿B中，(b)将底物15mg和重氮盐染料6mg分装安瓿C；用时将安瓿B的内容物、安瓿C的内容物混合，即为显色液。
应用将安瓿A隔水加热溶解，趁热浇在一玻璃板上，冷却后在距膜一端约2cm处放0.3×1cm的滤纸。约10分钟后取下滤纸，在该处加样8微升，放置5分钟。然后将凝胶板放在加好电极液的电泳槽架上，两端用4层纱布搭桥，电压100v，电泳30分钟，关闭电源。将胶板取出加入上述已混合好的显色液，放在37℃温箱里温育20-30分钟，即可见同工酶显色带。
结果血清碱性磷酸酶(ALP)同工酶从正极向负极可出现ALP1-6条区带，正常人血清出现ALP2(肝型)和ALP3(骨型)两种同工酶。原发性肝癌、肝硬化时，肝型同工酶活性增强。成骨肉瘤、甲亢时骨型同工酶活性增强。妊娠中，血清可出现ALP4，如果ALP4活性急剧下降，常常是胎盘机能不全或胎儿已经死亡的诊断标志，其他人出现ALP4，预示有肿瘤疾患，ALP1和ALP6在病理情况时出现。
实施例4、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.03mol/L巴比妥缓冲液做为电极液，pH为8.6；(2)、用冰乙酸做为固定剂，取2.5ml分装安瓿E；(3)、琼脂糖凝胶的配制是将琼脂1g、蔗糖2g和聚乙烯吡咯烷酮0.5g，加入100ml浓度为0.06mol/L的泡醋纤膜缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A。(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.2mol/L硼酸-NaOH缓冲液100ml，pH为9.8，分装安瓿B中，(b)将底物8mg和重氮盐染料4mg分装安瓿C；用时将安瓿B、安瓿C的内容物混合即为显色液。
应用如实施例3所述，结果也相同。
实施例5、做醋酸纤维素薄膜电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.02mol/L巴比妥缓冲液为电极液，pH为8.0；(2)、用冰乙酸做为固定剂，取2ml分装安瓿E；(3)、配制浓度为0.1mol/L泡醋纤膜缓冲液，分装安瓿A中；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.05mol/LTris缓冲液100ml，pH为10.2，分装安瓿B中，(b)将底物3mg和重氮盐染料10mg分装安瓿F；(c)、将琼脂糖0.3mg分装安瓿D；(d)、将6mmol/L L-苯丙氨酸分装安瓿E，用时将安瓿B的内容物、安瓿C的内容物和安瓿E的内容物混合、安瓿D内容物加水加热溶解后，加入安瓿B的内容物、安瓿C的内容物、安瓿E的内容物的混合液，混合后趁热铺板，即为显色胶板。
应用首先泡膜打开安瓿A加水至25ml，将醋纤膜泡在该液内20分钟。然后将醋纤膜取出，夹在滤纸中间吸去多余水份，膜条无光泽面朝上。用点样片醮血清点在距膜一端2cm处。将配制好的电极缓冲液倒入电泳槽内，使槽内电极缓冲液处于同一水平。在电泳槽的阴、阳极槽内分别用合适尺寸的滤纸折叠4层搭在槽的两侧，做为盐桥。将点样的膜条点样面朝下，点样处朝向阴极端搭在盐桥上，膜条需与盐桥贴紧，绷展。接通电源，调节电压100～260v，10～30分钟后，关闭电源。然后进行同工酶显色将电泳过膜条取出，点样面贴在上述显色胶板上，在37℃温育20～30分钟，即可见同工酶谱。
结果妊娠中可出现ALP4，其它人出现ALP4，提示有肿瘤疾患，用上述试剂显示后，ALP4消失，ALP5肝脏疾患时出现，加上述抑制剂ALP5消失。由此可鉴别ALP4、ALP5的脏器来源或病变定位。
实施例6、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.05mol/L巴比妥缓冲液电极液，pH为8.6；(2)、用冰乙酸做为固定剂，取2.0ml分装安瓿E；(3)、琼脂糖凝胶的配制将琼脂糖0.7g加入浓度为0.08mol/L泡醋纤膜缓冲液100ml，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A；(4)配制显色液显色液可以制备为冻干粉试剂，其是将0.5g底物和100ml缓冲液溶解后分装安瓿B，冷冻干燥；将0.7g重氮盐染料和100ml缓冲液，溶解后分装安瓿C，冷冻干燥，用时将安瓿B内加水溶解，安瓿C内加水溶解，将安瓿B、安瓿C内容物混合，即为显色液。
应用将安瓿A隔水加热溶解，趁热浇在一玻璃板上，冷却后在距膜一端约2cm处放0.3×1cm的滤纸。约10分钟后取下滤纸，在该处加样8微升，放置5分钟。然后将凝胶板放在加好电极液的电泳槽架上，两端用4层纱布搭桥，电压100v，电泳30分钟，关闭电源。将胶板取出加入上述已混合好的显色液，放在37℃温箱里温育20-30分钟，即可见同工酶显色带。
结果血清碱性磷酸酶(ALP)同工酶从正极向负极可出现ALP1-6条区带，正常人血清出现ALP2(肝型)和ALP3(骨型)两种同工酶。原发性肝癌、肝硬化时，肝型同工酶活性增强。成骨肉瘤、甲亢时骨型同工酶活性增强。妊娠中，血清可出现ALP4，如果ALP4活性急剧下降，常常是胎盘机能不全或胎儿已经死亡的诊断标志，其他人出现ALP4，预示有肿瘤疾患，ALP1和ALP6在病理情况时出现。
权利要求
1.一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，做醋酸纤维素薄膜电泳，其包括有(1)、配制0.02～0.1mol/L电极液，pH为7.5-9.0；(2)、将冰乙酸做为固定剂；(3)、配制0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液；其特征在于将(3)所述的泡醋纤膜缓冲液分装安瓿A中；将(2)所述的固定剂分装安瓿E；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.05～0.3mol/L缓冲液，pH为9.0～11.0，分装安瓿B中；(b)将底物和重氮盐染料分装安瓿C；(c)、将琼脂糖或琼脂分装安瓿D；其中安瓿C中的内容物底物和重氮盐染料、安瓿D中的内容物琼脂糖或琼脂，按重量百分比，底物、重氮盐染料、琼脂糖或琼脂分别为20.0％～86.7％、10.5％～75.2％、1.2％～28.6％，将浓度为0.05～0.3mol/L的缓冲液为100ml～250ml分装安瓿B，用时将安瓿B加入安瓿C内、安瓿D的内容物加水加热溶解，然后将安瓿B、安瓿C的混合液，加入安瓿D内混合即为显色液。
2.一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.02～0.1mol/L电极液，pH为7.5-9.0；(2)、用冰乙酸做为固定剂；其特征在于将(2)所述的固定剂分装安瓿E；(3)、琼脂糖凝胶的配制将琼脂糖(或琼脂)0.5g-1g加入浓度为0.05～0.2mol/L泡醋纤膜缓冲液80ml～120ml，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A；(4)配制显色液(a)、配制浓度为0.05～0.3mol/L缓冲液，pH为9.0～11.0，分装安瓿B中，(b)将底物和重氮盐染料分装安瓿C；(c)、将琼脂糖或琼脂分装安瓿D；其中安瓿C中的内容物底物和重氮盐染料、安瓿D中的内容物琼脂糖或琼脂，按重量百分比，底物、重氮盐染料、琼脂糖或琼脂分别为20.0％～86.7％、10.5％～75.2％、1.2％～28.6％，将浓度为0.05～0.3mol/L的缓冲液为100ml～250ml分装安瓿B，用时将安瓿B、安瓿C、安瓿D的内容物混合即为显色液。
3.根据权利要求1或2所述的一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于显色时在所述显色液中加入特异性抑制剂分装安瓿F，其中安瓿F中可加入浓度为5～10mM L-苯丙氨酸，抑制ALP4、ALP5；或浓度为5～10mM L-高精氨酸，抑制ALP2；或浓度为5～10mM L-色氨酸或亮氨酸，抑制ALP4；或浓度为3～5M尿素，抑制ALP3；或浓度为1M乙二胺四乙酸，抑制ALP2、ALP3、ALP5。
4.根据权利要求1或2所述的一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿B中配制的缓冲液，可用Tris系列的缓冲液、磷酸系列的缓冲液或硼酸缓冲液、二氨基二甲基1.3丙二醇-HCL缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿C中底物可用萘酚或它的衍生物的磷酸酯，如α-萘酚磷酸或β-萘酚磷酸或α-萘酚磷酸盐类化合物、萘酚AS-MX磷酸、萘酚AS-BI磷酸，或其萘酚AS-MX磷酸盐类和萘酚AS-BI磷酸盐类，甲苯胺-5-溴3-吲哚磷酸、硝基苯-5-溴-3-吲哚磷酸、磷酸甲苯胺盐；重氮盐染料可用固蓝B或固蓝BB、固蓝R或固蓝RR、固紫B、柘石榴红GBC、固红RC、固红TR、六偶氮付品红等。
6.根据权利要求1或2所述的一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述显色液的配制，其中所述安瓿B内装缓冲液和底物，溶解后冷冻干燥；其是将0.3g-1.5g底物加入100ml-250ml缓冲液溶解后分装安瓿B。
7.根据权利要求1或2所述的一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述显色液的配制，其中所述安瓿C内装缓冲液和重氮盐染料，溶解后冷冻干燥，其是将0.2g-1g的重氮盐染料加入100ml-250ml的缓冲液溶解后分装安瓿C。
8.根据权利要求2所述的一种碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述琼脂糖凝胶的配制也可以是将琼脂糖(或琼脂)、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮，按重量百分比分别为7.0％～32.3％、55.6％～91.0％、1.4％～19.4％，加入100ml～250ml浓度为0.05mol/L～0.2mol/L的泡醋纤膜缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿A。
全文摘要
本发明公开了一种水解酶——碱性磷酸酶同工酶诊断试剂盒的制备,属于酶学领域。其是将试剂分装于安瓿内,便于保存,性能稳定,重复性好,减轻了劳动强度,改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异,从而使操作规范化,使酶的检测及质量控制达到统一的标准,同时使用试剂盒简化了操作过程,省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用,为临床疾病的诊断与鉴别诊断提供依据。
文档编号G01N33/531GK1381725SQ0111075
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月20日 优先权日2001年4月20日
发明者阎美容, 舍英, 侯金凤, 陈必珍 申请人:呼和浩特同日试剂有限公司