专利名称：无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定 无机磷浓度的测定方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动 态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降 低，反之亦然。血桨中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每 100毫升血浆转磷浓度的乘积为35—"40。当二者乘积大于40时，钙 和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时，可发生转移性钙化。当乘积 <35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用， 引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状 旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分 析磷酸盐阴离子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷钼酸还原法，非 还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度 法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐 的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中
加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类 很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米
吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂 聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm 有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用 下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶 (还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷浓度 的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷诊断/测定试 剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化 分析仪上进行无机磷浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。
本发明无机磷浓度测定方法原理如下
无机磷+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶
氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸
腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸羧化酶
无机磷+腺苷二磷酸+草酰乙酸
氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶
L-谷氨酸+水+辅酶
丙酮酸羧化酶(EC6.4丄1)、谷氨酰胺合成酶(EC6.3丄2)作为循 环酶谷氨酰胺合成酶的酶促作用利用无机磷和腺苷二磷酸作用产生 腺苷三磷酸；丙酮酸羧化酶再将腺苷三磷酸再次变回无机磷及腺苷二 磷酸，使无机磷不断地被重复循环利用，产生大量的氨离子。
谷氨酸脱氢酶(EC 1.4丄2 ; EC 1.4.1.3、 EC 1.4丄4)作为显色酶， 利用氨离子使还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度 下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算出无机 磷浓度。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷诊断/ 测定试剂盒较为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂50 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶6000 U/L
谷氨酰胺合成酶6000 U/L
谷氨酸脱氢酶8000 U/L
腺苷二磷酸2 mmol/L
谷氨酰胺4 mmol/L
2-酮戊二酸酯 16mmol/L 丙酮酸 12mmol/L 二氧化碳 20 mmol/L
本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳
定剂、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、
丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化 碳、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸
脱氢酶。
腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮 酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶在试剂1或 试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。
腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮 酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
谷氨酰胺合成酶 8000 U/L
谷氨酸脱氢酶 8000 U/L
腺苷二磷酸 2 mmol/L谷氨酰胺
2-酮戊二酸酯
丙酮酸
4 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L
二氧化碳 20 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；
使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间IO分钟，起
始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无
机磷样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，
检测方法为速率法，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷
浓度的大小。
实施例二
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 腺苷二磷酸 谷氨酰胺 2-酮戊二酸酯
0.25 mmol/L 2 mmol/L 4 mmol/L 16 mmol/L丙酮酸
12 mmol/L
:氧化碳
20 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸羧化酶
谷氨酰胺合成酶
谷氨酸脱氢酶
50 mmol/L 6000 U/L 6000 U/L 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机 磷样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下 降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2 分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷 的浓度大小。
实施例三
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
50 mmol/L还原型辅酶
0.25 mmol/L
腺苷二磷酸 谷氨酰胺 2-酮戊二酸酯 丙酮酸
二氧化碳
2 mmol/L 4 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸羧化酶 谷氨酰胺合成f
50 mmol/L 8000 U/L 8000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
谷氨酸脱氢酶 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定无机磷浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反 应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波 长405nm，被测无机磷样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟 时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷 浓度的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化 分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外 源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷浓度测定方法，其方法原理如下无机磷+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳 丙酮酸羧化酶无机磷+腺苷二磷酸+草酰乙酸氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 L-谷氨酸+水+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的大小速度，测算出无机磷浓度大小测定结果。
2. —种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括: 缓冲液20－500 mmol/L 稳定剂 1-50 mmol/L 还原型辅酶 0.1-0.35 mmol/L 丙酮酸羧化酶 1000-500000 U/L 谷氨酰胺合成酶 1000-500000 U/L 腺苷二磷酸 1－12 mmol/L 谷氨酰胺 4-20 mmol/L 2-酮戊二酸酯 4-20 mmol/L丙酮酸 5-20 mmol/L二氧化碳 5——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、 2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶(EC6.4丄1)、谷氨酰胺合成酶(EC 6.3丄2)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4丄2 ; EC 1.4丄3、 EC 1.4丄4)、还原型辅酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、 2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶(EC6.4丄1)、谷氨酰胺合成酶(EC 6.3丄2)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4丄2 ; EC1.4丄3、 EC 1.4丄4)、还 原型辅酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、 谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷 氨酸脱氢酶组成。腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、还 原型辅酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、 2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶(EC6.4.1.1)、谷氨酰胺合成酶(EC6.3.1.2)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2 ; EC1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、还 原型辅酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、 谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶组成; 试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶组成。腺苷二磷酸、谷 氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶、谷氨 酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶在试剂l、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1一4000 mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的大小速度，从而测算出无机磷的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号G01N33/84GK101173937SQ20061009731
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司