专利名称：钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钠诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血清中钠离子含量(简称"血钠")在临床上有着非常重要的意义，
医学上有三个决定水平，依次为水平1——115mmo1/1，水平2—— 135mmo1/1，水平3——150mmo1/1。当患者血钠浓度等于或低于水平1 时，可出现神志不清、疲劳、恶心、头痛、呕吐和厌食等症状，表明 机体内水的比例大于钠，应采用相应治疗措施；当血钠浓度低于水平 2时，应査找低钠血症的原因，进一步测定血清渗透压、血钾并进行 尿液分析，以确定诊断；当血钠浓度高于水平3时，应检査其它试验 项目，寻找导致高钠血症的原因。
现有技术中测定钠离子含量的常用方法有火焰光度计法、离子 选择电极法、化学测定法、原子分光光度法、酶动力学法等。
火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今，可检测血清、 尿液、脑脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一种发射光谱分析法，其结 果准确可靠，广为临床采用。该方法分为内标准法和外标准法两种。 外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主要使用内部标准法，即 向标本及标准液中加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定，操 作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K+、 Na+和Li+的浓度， 以标本与标准液的Na+7Li+与K"VLi+比值，计算Na+、 K+浓度。由于 血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可以忽略不计。
离子选择电极法——简称ISE法，是采用灵敏的特定专用电极， 在专用仪器上进行血清和尿等体液中的K+、 Na+的测定，因标本用量 少，快速准确，几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是，用离子 选择电极与参比电极组合起来，浸泡在待测标本溶液中进行检测。目 前已有的电极种类有①玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜，有PH 电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属物质加压成 型，以固体膜或单日膜作为感应膜，有C卜电极和F-电极；③液态膜 电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜，有C^+电极；④用缬 氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的使用寿命，因为电极使 用一段时间后就会自动老化，有效期长短不一。目前离子选择电极法 应用也较为普遍，但是电极成本昂贵。
此外，化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚， 作为离子载体进行测定。由于大环结构内有空穴，分子内部的氧原子 有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不 同直径的金属离子，从而达到测出离子浓度的目的；原子分光光度法 也可用于检测血清中K+、 Na+，但操作繁杂，误差较大，不及火焰光 度法简便。
酶法测定钠离子含量的方法，与火焰光度计法或离子选择电极法 都有较好的一致性，这种方法抗干扰性强、稳定性好，但用生化分析 仪不能同时测定钠离子和钾离子各自的含量，导致这种方法不能得到 推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/ 连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的 变化，得以测定钠浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钠诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或 半、全自动生化分析仪上进行钠浓度测定，而且测定速度快、准确度 高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明钠浓度测定方法原理如下:
乳糖+水 β-半乳糖苷酶/N+ 葡萄糖+半乳糖
葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶葡萄糖-6-磷酸
+腺苷二磷酸
葡萄糖-6-磷酸+辅酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
葡糖酸内酯磷酸+还原型辅酶
这个方法应用需要钠离子激活的(3-半乳糖苷酶(lactase ; EC 3.2丄108)酶(偶)联己糖激酶(hexokinase; EC 2.7.1.1 ; EC2.7丄2)、 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1 1.1.49 ) 酶促反应速率比色法。β-半乳糖苷酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通 过(偶)联合己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在 340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量 340nm处吸光度上升的速度，可以测算钠的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钠诊断/测定 试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L辅酶 3 mmol/L
乳糖 20 mmol/L
腺苷三磷酸 6 mmol/L
氯化镁 6 mmol/L
P-半乳糖苷酶 10000 U/L
己糖激酶 10000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 10000 U/L
本发明的钠诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、P-半乳 糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁。 试剂2
缓冲液、稳定剂、p-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸
脱氢酶。
辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、(3-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直 接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸。 试剂2
缓冲液、乳糖、氯化镁。 试剂3
缓冲液、稳定剂、(3-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶。，
辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、p-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钠浓度的方法，其辅酶可 以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的钠诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100廳ol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
乳糖 20 mmol/L腺苷三磷酸6 mmol／L。氯化镁6 mmol／L。p．半乳糖苷酶10000 U／L，己糖激酶10000 U／L，葡萄糖．6一磷酸脱氢酶1 0000 U／L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37~C，反应时间10分钟，起始吸光度≤O．1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠样品与试剂的体积比例为1／25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠的浓度大小。实施例二本实施例的钠诊断／测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol／L，稳定剂50 mmol／L，辅酶3 mmol／L。乳糖10 mmol／L，腺苷三磷酸9 mmol／L，氯化镁 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
P-半乳糖苷酶 16000 U/L
己糖激酶 16000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 16000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始
吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠样品
与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为正反应(上升反应)，
延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠的浓
度大小。
实施例三
本实施例的钠诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
腺苷三磷酸12 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
乳糖 30 mmol/L
氯化镁 4 mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
P-半乳糖苷酶 20000 U/L
己糖激酶 8000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定钠浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测钠样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟 左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠的浓 度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用 。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的钠的浓度测定方法，其方法原理如下乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na+ 葡萄糖+半乳糖葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸 +腺苷二磷酸葡萄糖-6-磷酸+辅酶 葡萄糖-6-磷酸脱氧酶 葡糖酸内酯磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出钠的浓度大小测定结果。
2. —种钠诊断/测定试剂盒，主要成分包括: 缓冲液 稳定剂 辅酶 乳糖缓冲液20 500 mmolA。稳定剂1--50 mmolA。辅酶1--6 mmolA，乳糖1--50 mmol／L。腺苷三磷酸112 mmol／L。氯化镁1--10 mmol／L。β一半乳糖苷酶1 000--80000 U/L。
己糖激酶1000--80000 U/L。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1 000--80000 U/L。
其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖 苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于:由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、P-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶组成。辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖 激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖 苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸组成；试剂2，由缓冲液、乳 糖、氯化镁组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯 化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂l、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1﹪-100﹪体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钠诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出钠的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101173930SQ20061009730
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司