一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生命科学领域，设及一种试剂盒，具体设及一种薦糖憐酸合成酶活性 测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 薦糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的 胆存形式之一。薦糖憐酸合成酶(SPS)W果糖-6-憐酸为受体，形成的薦糖憐酸在薦糖憐酸 酶的作用下形成薦糖。一般把薦糖憐酸醋合成酶-薦糖憐酸酶系统看作是薦糖合成的主要 途径。
[0003] 目前市面已有的检测薦糖憐酸合成酶活性的方法是间苯二酪显色法。其原理是样 本中薦糖憐酸合成酶催化果糖-6-憐酸形成薦糖憐酸，薦糖憐酸与间苯二酪反应呈现的颜 色变化的深浅与薦糖憐酸合成酶活性高低成正比。该方法是市面上公认的唯一一种检测薦 糖憐酸合成酶活性的方法，但是该方法仍存在很多不足： 1、不能适用于检测薦糖含量较高的样本，样本中含有的薦糖会对测定该酶活性产生很 大的影响，造成测定结果不准确。
[0004] 2、反应总体积为2-3mL，各种试剂加入的量较大，尤其是UDPG的浓度达到lOmMW 上，该试剂价格昂贵，总体成本较高。
[000引3、试剂种类过多，操作过程过于繁琐。
【发明内容】
[0006] 为了弥补现有技术的不足，本发明旨在提供一种薦糖憐酸合成酶活性测定试剂盒 及其方法，可快速准确的对薦糖憐酸合成酶活性进行测定。
[0007] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过W下技术方案实现： 一种薦糖憐酸合成酶活性测定试剂盒，包括W下试剂： 提取液，液体X 1瓶，4°C保存，由一定量的化i S-HC1缓冲液、氯化儀、EDTA和疏基乙醇混 匀后制成，置于lOOmL试剂瓶中； 试剂一，液体X 1瓶，-20°C保存，由一定量的化iS-HC1缓冲液、氯化儀、6-憐酸果糖和 UDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中； 试剂二，薦糖溶液X 1瓶，4°C保存，由一定量的薦糖溶于蒸馈水后制成，置于lOmL试剂 瓶中； 试剂Ξ，液体XI瓶，4°C保存，由一定量的氨氧化钢溶于蒸馈水后制成，置于2mL试剂瓶 中； 试剂四，液体X 1瓶，4°C保存，由一定量的盐酸溶于蒸馈水后制成，置于25mL试剂瓶中； 试剂五，液体XI瓶，4°C保存，由一定量的间苯二酪溶于乙醇和蒸馈水后制成，置于6mL 试剂瓶中。
[000引进一步的，所述提取液中的TriS-HC1缓冲液的体积为1 OOmL，物质的量浓度为 1 OOmM，pH=7.ο，氯化儀的质量为203mg，邸ΤΑ的质量为58mg，琉基乙醇的体积为140祉； 进一步的，所述试剂一中的TriS-HC1缓冲液的体积为5mL，物质的量浓度为50mM，pH= 7.0，氯化儀的质量为lOmg，6-憐酸果糖的质量为15.2mg，UDPG的质量为9mg; 进一步的，所述试剂二，即所述薦糖溶液的体积为lOmL，浓度为Img/mL，其中薦糖的质 量为1 Omg，蒸馈水的体积为1 ΟιΛ; 进一步的，所述试剂Ξ中的氨氧化钢的质量为0.16g，蒸馈水的体积为2mL; 进一步的，所述试剂四中的盐酸的体积为7.5mL，蒸馈水的体积为17.5mL水； 进一步的，所述试剂五中的间苯二酪的质量为6mg，乙醇的体积为5.7mL，蒸馈水的体积 为0.3mL。
[0009] 薦糖憐酸合成酶催化果糖-6-憐酸形成薦糖憐酸，薦糖憐酸与间苯二酪反应可呈 现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
[0010] -种采用上述试剂盒且基于分光光度法的薦糖憐酸合成酶活性测定方法，包括W 下步骤： 步骤1仪器和用品的准备； 可见分光光度计或酶标仪、水浴锅、离屯、机、移液器、微量石英比色皿或96孔板、研鉢、 冰； 步骤2样品测定的准备： 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: (5~10)的比例，进行冰浴匀浆;然后采用离屯、 机8000g，4°C离屯、lOmin，取上清，置冰上待测； 步骤3分光光度计或酶标仪的预热； 分光光度计或酶标仪预热30min W上，调节波长至480nm，蒸馈水调零； 步骤4薦糖憐酸合成酶活性的测定操作； 1) 取4支EP管，分别设定为测定管、对照管、标准管和空白管； 2) 在测定管中加入10化样本和45化所述试剂一，在对照管中加入10化样本和45化蒸馈 水，在标准管中加入ASiiL蒸馈水和所述试剂二，在空白管中加入SSiiL蒸馈水； 3) 分别将上述4支EP管混匀，25°C准确水浴lOmin; 4) 水浴后分别在测定管、对照管、标准管和空白管中加入15化所述试剂Ξ; 5) 将上述加入所述试剂Ξ的4支EP管分别在沸水浴中煮沸lOmin，然后冷却； 6 )在冷却后的测定管中加入21化L所述试剂四和eOiiL所述试剂五，在对照管中加入210 化所述试剂四和60化所述试剂五，在标准管中加入21化L所述试剂四和60化所述试剂五，在 空白管中加入21化L所述试剂四和eOiiL所述试剂五； 7) 分别将上述加入所述试剂四和所述试剂五的4支EP管混匀，沸水浴30min，冷却； 8) 在上述冷却后的4支EP管中各取200化物质至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下 测定各管吸光值； 步骤5薦糖憐酸合成酶活性的计算； 1)按照蛋白浓度计算： 单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生化g薦糖定义为一个酶活力单位； 薦糖憐酸合成酶活性(U/mg protMC椅償X Vi X (A獅酱-細購）今（A标V償-A空館）]今（Vi X Cpr)今T =100 X (A獅酱-細臓）今（A好准ff-A绝旨）今Cpr; 2)按照样本鲜重计算； 单位定义:每g组织每分钟催化产生化g薦糖定义为一个酶活力单位； 薦糖憐酸合成酶活性(u/g鲜重)=[C椅償X Vi X (A獅酱-細購)今（A椅償-A注瘡)]今（WX Vi 今V2)今T =100 X (An酱-?}黯）今（Afi谁t-A注瘡）今W; 其中，C椅償=1000yg/mL，表示标准管浓度； Vi=0.0 lmL，表示加入反应体系中样本体积； V2=lmL，表示加入提取液体积； Aim着表示测定管中物质的吸光值； Am黯表示对照管中物质的吸光值； A?tt表示标准管中物质的吸光值； 表示标准管中物质的吸光值； Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL; W表示样本鲜重，单位为g; T=10min，表示反应时间。
[0011] 本发明的有益效果是： 1、本发明的试剂盒及其方法通过设定对照管，能够排除样本中薦糖的影响，使得测定 结果更加准确，适用于各种样本中薦糖憐酸合成酶活性的检测。
[0012] 2、本发明的试剂盒及其方法的反应总体积仅为3(K)yL，且在不影响准确性的基础 上缩小了 UDPG的浓度，大大降低了试剂成本。
[0013] 3、本发明的试剂盒将氯化儀，6-憐酸果糖和UDPG溶解于Tris-HCl缓冲液，配成试 剂一，大大减少了试剂种类，使得操作更加简便。
[0014] 4、本发明的方法既可用分光光度计检测也可W用酶标仪检测，用户可W根据需要 选用不同的仪器。
[0015] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实 施方式由W下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0017] -种薦糖憐酸合成酶活性测定试剂盒，包括W下试剂： 提取液，液体X 1瓶，4°C保存，由100血，物质的量浓度为lOOmM，pH=7.0的Tri S-肥1缓冲 液、203mg氯化儀、58m巧DTA和140uL疏基乙醇混匀后制成，置于1 OOmL试剂瓶中； 试剂一，液体X 1瓶，-20°C保存，由5mL，物质的量浓度为50mM，抑=7.0的化is-肥1缓冲 液、lOmg氯化儀、15.2mg 6-憐酸果糖和9mg UDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中； 试剂二Img/mL薦糖溶液lOmL X 1瓶，4°C保存，由lOmg薦糖溶于lOmL蒸馈水后制成，置 于lOmL试剂瓶中； 试剂立，液体X 1瓶，4°C保存，由0.16g氨氧化钢溶于2mL蒸馈水后制成，置于2mL试剂瓶 中； 试剂四，液体X 1瓶，4°C保存，由7.5mL盐酸溶于17.5mL蒸馈水后制成，置于化mL试剂瓶 中； 试剂五，液体X 1瓶，4°C保存，由6mg间苯二酪溶于ο. 3mL乙醇和5.7mL蒸馈水后制成，置 于6mL试剂瓶中。
[0018] 薦糖憐酸合成酶催化果糖-6-憐酸形成薦糖憐酸，薦糖憐酸与间苯二酪反应可呈 现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
[0019] -种采用上述试剂盒且基于分光光度法的薦糖憐酸合成酶活性测定