使用标记酶的染色用含dab底物试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种含DAB底物试剂盒，其对于使用过氧化物酶标记抗体的免疫组织 化学染色（MC)法、免疫细胞化学染色（ICC)法等免疫染色法W及原位杂交（ISH)法中的 显色反应，使用含有二氨基联苯胺值AB)及作为其敏化剂的咪挫的显色反应液，能够抑制 DAB凝集所致的在含DAB底物溶液中的沉淀及非特异性染色所致的例如背景染色，增强特 异染色强度。
【背景技术】
[000引 目前，在病理、分子生物学领域中，I肥法、ICC法或I甜法中使用的显色反应液根 据用于显色的标记酶的种类而将试剂分类使用。在非专利文献1中记载有，作为标记酶， 目前最常使用的是过氧化物酶，通常使用植物性的来自辣根的过氧化物酶（HRP)(分子量 40~45kDa)。作为HRP的酶反应的氨供体，日常使用的是显色为茶色的含有二氨基联苯胺 值AB)及过氧化氨的含DAB底物溶液。
[0003] 含DAB底物溶液分成2液或3液（通常将DAB和过氧化氨分开，W避免DAB发 生反应），市售的有使用时进行调制的高浓度浓缩（stock)溶液、或作为干燥品的板状 片剂。例如，可W列举化ko公司制的液体DAB+显色试剂盒化iquidDAB+SubStrate C虹omogenSystem) (Code:K3468)、赛默飞世尔科技公司灯hermoSCIENTIFIC)制的 DAB如anto(Code:TA-XXX-QHD)〇、生命技术公司（LifeTechnologies)制的St油Ie DAB(Code:750118)、日冷生物科学（NichireiBiosciencesINC.)制的DAB底物试剂盒。但 是，关于其的组成，通常是不公开的。
[0004] 非专利文献1中记载了添加咪挫作为DAB显色的敏化剂。根据迄今为止的经验，已 知咪挫虽然具有加快DAB反应的效果，但同时会引起DAB的凝集，引起经过一定时间后在反 应液中沉淀的现象。并且已知的是，由于敏化效果高，因此在组织上的目的物质W外的HRP 存在下，在周边也引起非特异性染色，例如背景染色。
[0005] 另外，专利文献1中记载了可W根据需要使含DAB底物溶液中含有非离子性表面 活性剂，专利文献2及3中记载了可W在含DAB底物溶液中配合邸TA。但是，运些文献对于 上述配合咪挫时的课题则未进行任何研究。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1:日本专利第3503890号公报
[0009] 专利文献2:加拿大专利申请公开第2417671号说明书
[0010] 专利文献3:德国专利申请公开第3812605号说明书
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献1:名仓宏，长村义之，堤宽：修订第四版渡边?中根酶抗体法学际企画 2002)"酶抗体法"（修订第四版渡边?中根学际企画2002)
【发明内容】
[001引发明要解决的课题
[0014] 本发明的课题在于提供一种含DAB底物试剂盒，其对于使用过氧化物酶标记抗体 的免疫组织化学染色法、免疫细胞化学染色法等免疫染色法W及原位杂交法等中的显色反 应，使用含有DAB及作为其敏化剂的咪挫的含DAB底物溶液，能够在增强特异染色强度的同 时抑制非特异性染色。
[0015] 本发明的另一课题在于提供一种含DAB底物试剂盒，其对于使用过氧化物酶标记 抗体的免疫染色法W及原位杂交法中的显色反应，使用含有DAB及作为其敏化剂的咪挫的 显色反应液，能够在增强特异染色强度的同时，抑制含DAB底物溶液中的DAB的凝集所致的 沉淀，并抑制非特异性染色。
[0016] 本发明的又一课题在于提供一种含DAB底物试剂盒，其对于使用过氧化物酶标记 抗体的免疫染色法W及原位杂交法中的显色反应，使用含有DAB及作为其敏化剂的咪挫的 含DAB底物溶液，在增强特异染色强度的同时，抑制背景染色等非特异性染色，且长期抑制 含DAB底物溶液中的DAB的凝集所致的沉淀，并改善使用感及保存稳定性。
[0017] 用于解决课题的手段
[0018] 本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在使目前免疫染色法 中的酶抗体法W及原位杂交法中通常使用的、用于显色的含DAB底物溶液的组成中含有已 知的作为敏化剂的咪挫而使特异染色强度增大时，也可W通过使其中含有特定的馨合剂和 特定的非离子表面活性剂，从而减轻非特异性染色的同时、抑制使用载玻片时产生的例如 背景染色。进而发现，可W抑制含DAB底物溶液调制后的DAB凝集，进而通过W2液型W 上形式来调制其组成，从而使其保存稳定性也变得格外良好，在4°C遮光保存下，各液混合 后2周也不会发生沉淀，且获得与含DAB底物溶液刚调制后同等的染色性，从而完成了本发 明。
[0019] 其中，本发明中，含DAB底物溶液是指，将本发明的试剂盒混合或混合并稀释而获 得的底物溶液。此外，本说明书中，有时将染色W染色或显色的意思来使用。
[0020] 根据本发明，提供一种含DAB底物试剂盒（W下有时简称为本发明的试剂盒），其 为含有含显色团溶液（A)和显色试剂度）、且至少含显色团溶液（A)及显色试剂度）分开 保管的2液型W上的用于使用过氧化物酶标记抗体的例如在I肥法、ICC法、或ISH法的 染色中使用的含DAB底物试剂盒，所述含显色团溶液（A)含有作为过氧化物酶显色团的二 氨基联苯胺值AB)和水，所述显色试剂度）含有：选自由四乙二胺四乙酸二钢?二水合物 (邸TA? 2化）、乙二胺四乙酸?二锭盐巧DTA? 2畑4)、乙二醇二乙酸二胺四乙酸（GEDTA)、W 及次氮基S乙酸（NTA)组成的组中的至少1种的馨合剂，包含聚氧乙締（W下简称为P0E) 烷基酸系非离子表面活性剂及聚氧丙締（W下简称为PO巧烷基酸系非离子表面活性剂中 的至少1种的非离子表面活性剂，咪挫，过氧化氨和水。
[0021] 此外，根据本发明，提供将试剂盒制成了 3液型的上述试剂盒，上述显色试剂度） 为显色化溶液度1)和底物稳定化溶液度2)分开保管的2液型，所述显色化溶液度1)含有 过氧化氨及水，所述底物稳定化溶液度2)含有上述馨合剂、包含POE烷基酸系非离子表面 活性剂及POP烷基酸系非离子表面活性剂中的至少1种的非离子表面活性剂、咪挫、及水。
[0022] 进而，根据本发明，提供一种I肥法、ICC法或I甜法，其在使用DAB的组织、细胞 或运些的一部分的染色中使用本发明的试剂盒。
[0023] 进而，根据本发明，还提供一种染色法，其特征在于，在使用DAB的组织、细胞或运 些的一部分的染色中使用本发明的试剂盒。
[0024] 发明的效果
[00巧]本发明的试剂盒由于是含有：含有作为过氧化物酶显色团的DAB和水的含显色 团溶液（A)、W及含有特定的馨合剂、特定的表面活性剂、咪挫、过氧化氨和水的显色试剂 度），且至少含显色团溶液（A)及显色试剂度）分开保管的2液型W上的试剂盒，因此在使 用过氧化物酶的IHC法、ICC法化及ISH法中，可W在增强特异染色强度的同时，抑制非特 异性染色且抑制DAB的凝集所致的在含DAB底物溶液中的沉淀。进而，可W长期抑制上述 沉淀，并改善使用感及保存稳定性。具有运样效果的本发明试剂盒，在通过IHC法将贴合于 载玻片的组织检体染色时、通过ICC法将细胞检体染色时、W及通过I甜法将组织、细胞检 体染色时尤其有用。
【具体实施方式】
[0026] W下对本发明进行更详细的说明。
[0027] 本发明的试剂盒为2液型W上的含DAB底物试剂盒，其用于W使用过氧化物酶标 记抗体的I肥法及ICC法中的染色W及I甜法中的显色为基础的、用DAB显色团将生物体 的正常组织或肿瘤组织、细胞等中存在的例如抗原、mRNA、DNA等特定物质染色，从而进行病 理诊断、分子生物学实验等。
[002引本发明中，I肥法中使用的组织检体、ICC法中使用的细胞检体、I甜法中使用的组 织、细胞检体在按照不使组织、细胞变性的方式固定后切薄而使用。例如可W优选使用如下 制备的检体：为了长期保存等，通常用福尔马林、醇等将检体固定，然后利用包括石蜡等在 内的包埋介质进行包埋后，将组织检体切薄并贴合于载玻片。染色前的抗原抗体反应、使用 经DIG(Digoxigenin)标记的探针的杂交后的抗体反应可W通过使用过氧化物酶标记抗体 的直接法或间接法等公知方法进行。此时，作为过氧化物酶，可W优选使用HRP。
[0029] 本发明的试剂盒可W优选用于使用上述贴合有组织、细胞检体的载玻片的间接法 的酶抗体反应中。例如可W用于如下的方法中：在用福尔马林将检体固定后，对石蜡包埋的 载玻片进行脱石蜡、亲水化，然后根据需要进行抗原性活化、内源性过氧化物酶的除去，然 后使其与第一抗体反应或与经DIG标记的探针反应，然后