，与结合有过氧化物酶、及第二抗 体或抗DIG抗体的聚合物等反应，然后与将本发明试剂盒的各溶液混合而调制的含DAB底 物溶液反应，W过氧化物酶为催化剂对其位置进行特异性显色。此外，在显色后还能够通过 苏木精等进行核染色，从而使其形态更容易观察。
[0030] 上述含DAB底物溶液的调制例如可W通过将本发明试剂盒中所含的各溶液混合 的方法、或将本发明的试剂盒中所含的各浓缩溶液混合在特定量的蒸馈水等水中的方法来 进行。
[003。 作为可W使用本发明的试剂盒、在I肥法中的染色和利用I甜法的显色中使用的 组织，可W列举例如大肠（正常?癌）、小肠（正常）、十二指肠（正常）、结肠（正常）、胃 (正常?癌）、食道（正常）、舌（正常）、肝脏（癌）、膜脏（正常）、肾脏（正常）、脑（正 常）、小脑（正常）、屯、脏（正常）、乳腺（正常?癌）、胎盘、前列腺（正常?癌）、肺（正 常?癌）、甲状腺（正常）、扁桃体（正常）、淋己结（正常）、子宫颈（正常）、恶性黑色素 瘤、霍奇金淋己瘤、胸腺增生症、GIST(Gast;rointestinalstromaltumor,胃肠道间质瘤）、 间皮瘤。W上的组织中，由于在大肠（正常?癌）、小肠（正常）、十二指肠（正常）、结肠 (正常）、胃（正常?癌）等包含肌肉组织或结缔组织的部分中存在背景染色尤其明显的倾 向，因此本发明的试剂盒对于运些组织的染色是极为有效的。
[0032] 作为可W使用本发明的试剂盒、在ICC法中的染色、I甜法中的显色中使用的细 胞，可W优选列举例如乳腺癌细胞、肺癌细胞、成淋己细胞（正常）。
[0033] 本发明的试剂盒含有含显色团溶液（A)，所述含显色团溶液（A)含有作为过氧化 物酶显色团的DAB和水。该溶液（A)中所含的DAB在后述的过氧化氨与过氧化物酶反应时 作为酶反应的氨供体起作用。并且，该DAB可W通过聚合反应而使过氧化物酶结合部分特 异性地显色为茶色系。
[0034] 溶液（A)中，DAB的含量为最终作为在I肥法、ICC法的染色或ISH法的显色中使 用的含DAB底物溶液能进行显色反应的量即可，W在所使用的含DAB底物溶液中的浓度计 优选为0. 1~lOmg/mL。若小于0.Img/mL，则有显色反应未充分发生的担屯、，另一方面，若 超过lOmg/mU则制成含DAB底物溶液时，有DAB发生凝集等而产生沉淀的担屯、。
[0035] 溶液（A)中，作为水，可W使用例如蒸馈水或超纯水。水的量为可在溶液（A)中溶 解DAB的量，可W按照最终制成含DAB底物溶液时各成分的含量在适当范围内的方式适当 选择、确定。
[003引溶液（A)中，除了DAB及水W外，为了提高DAB的溶解性或稳定性，还可W含有各 种有机溶剂，其含量可W根据该目的适当选择。
[0037] 本发明的试剂盒含有显色试剂度），所述显色试剂做含有特定的馨合剂、POE烧 基酸系非离子表面活性剂和/或POP烷基酸系非离子表面活性剂、咪挫、过氧化氨和水。
[0038] 显色试剂度）可W分成例如含有过氧化氨及水的显色化溶液度1)、W及含有特定 的馨合剂、POE烷基酸系非离子表面活性剂和/或POP烷基酸系非离子表面活性剂、咪挫及 水的底物稳定化溶液度2)。
[0039] 本发明的试剂盒只要是将DAB和过氧化氨分开保管的2液型W上的试剂盒，则可 W为任意液型，考虑到效率性时，优选制成由上述含显色团溶液（A)及上述显色试剂度） 构成的2液型，或由上述含显色团溶液（A)、上述显色化溶液度1)及上述底物稳定化溶液 度2)构成的3液型。
[0040] 显色试剂做或底物稳定化溶液度。中使用的特定的馨合剂为选自由 邸TA? 2化、邸TA? 2畑4、G邸TA及NTA组成的组中的至少1种，从其效果的观点出发，尤其 优选使用邸TA'2化或G邸TA。运些特定的馨合剂尤其在抑制DAB的非特异性结合、尤其是 使用贴合于载玻片的组织检体时，可W抑制背景染色。此外，通过与后述的特定的非离子表 面活性剂组合，即使检体组织是肌肉组织、结合组织等，也可W有效地抑制DAB的非特异性 结合。
[0041] 上述显色试剂度）或上述底物稳定化溶液度2)中的上述馨合剂的含量存在用量 依赖性地改善上述作用效果的倾向，可W考虑其作用效果适当地选择。具体而言，作为在所 使用的含DAB底物溶液中的浓度，可WW优选成为0. 1~IOmM的量、尤其优选成为0.3~ SmM的量来含有。
[0042] 显色试剂度）或底物稳定化溶液度2)中使用的特定的表面活性剂可W列举选自 由？06(23)月桂基酸度'。'35)、口06(20)嫁蜡基酸度'。'58)、口06硬醋基酸、口06油基酸、 POE肉豆違基酸、POE辛基十二烷基酸等POE烷基酸，POP月桂基酸、POP嫁蜡基酸、POP硬醋 基酸、POP油基酸、POP肉豆違基酸、POP辛基十二烷基酸等POP烷基酸组成的组中的至少1 种，尤其优选使用化ij35。运些特定的非离子表面活性剂尤其是在制成含有DAB和过氧化 氨的含DAB底物溶液时，抑制DAB在水溶液中聚合、沉淀的效果优异，此外，还可W增强DAB 的显色强度。使用其他表面活性剂、例如TritonX-100(4-(l，l，3,3-四甲基下基）苯 基-聚乙二醇）、NP-40 (4 -壬基苯基一聚乙二醇）或Tween20 (聚氧乙締失水山梨醇单月 桂酸醋）时或使用非质子性极性溶剂、例如DMSO(二甲基亚讽）时，无法获得期望的效果。
[0043] 显色试剂做或底物稳定化溶液度2)中的上述POE烷基酸系非离子表面活性剂 和/或POP烷基酸系非离子表面活性剂的含量存在用量依赖性地改善上述作用效果的倾 向，可W考虑其作用效果适当选择。具体而言，作为在用于I肥法、ICC法、！甜法的含DAB 底物溶液中的含有比例，可W优选W成为0. 05~30质量％的量、尤其优选W成为0. 1~5 质量％的量来含有。
[0044] 显色试剂度）或底物稳定化溶液度2)中使用的咪挫，是在DAB的显色中起到增强 显色强度的增强剂作用的成分。显示运样的作用效果的咪挫一方面使显色强度增强，另一 方面在过氧化氨的存在下引起DAB的凝集，引起经过一定时间后在含DAB底物溶液中沉淀 的现象，并且还成为引起检体组织、检体细胞上的目的物质W外的非特异性染色、例如背景 染色的原因。因此，在本发明的试剂盒中，在组合有上述特定的馨合剂及上述特定的非离子 表面活性剂的显色试剂度）或底物稳定化溶液度2)中配合咪挫。
[0045] 显色试剂度）或底物稳定化溶液度2)中的咪挫含量虽然呈用量依赖性地获得上 述DAB的显色增强作用，但含量多时发生上述问题点的可能性也变高，因此作为在用于IHC 法、ICC法、I甜法的含DAB底物溶液中的浓度，通常优选W成为3~300mM的量、尤其优选 W成为5~IOOmM的量来含有。此外，在提高咪挫浓度时，上述特定的馨合剂的浓度也优选 在上述范围内设定为较高。
[0046] 显色试剂度）或显色化溶液度1)中使用的过氧化氨是作用于过氧化物酶、关系到 DAB的显色反应的成分。过氧化氨的含量可W为过量，但过多时有特异染色强度下降的担 屯、。此外，过少时，有显色反应未充分进行、W及制成含DAB底物溶液后的保存性下降的担 屯、。
[0047] 因此，W在用于I肥法、ICC法、I甜法的含DAB底物溶液中的含有比例计，过氧化 氨的含量可W优选W成为0.OOl~0. 3质量％的量、尤其优选W成为0.Ol~0. 05质量％ 的量来含有。
[004引显色试剂度）、显色化溶液度1)及底物稳定化溶液度2)中使用的水可W使用例如 蒸馈水或超纯水。水的量可W按照使各成分的含量在适当范围的方式适当选择、确定。
[0049]为了有效地获得本发明的期望效果，本发明的试剂盒中，显色试剂度）或底物稳 定化溶液度2)的抑优选按照获得的含DAB底物溶液的抑通常为5~9、尤其为6~8的 方式进行调整。
[0050] 抑的调整可W利用盐酸等抑调整剂来进行，此外也可W使用憐酸、Tris、MOPS、 肥PES、ADA、C肥S、MES等缓冲剂来进行。从进一步提高含有过氧化氨的显色试剂度）或获 得的含DAB底物溶液的保存稳定性的观点出发，尤其优选使用盐酸等抑调整剂。
[0051] 本发明的试剂盒中使用的上述各溶液中，为了获得其他效果，可W在不损害本发 明的效果的范围内配合其他成分。作为其它成分，可W列举例如防腐剂、杀菌剂。
[0052] 本发明的试剂盒在手工方式下、使用自动设备的方式下均可W使用。尤其是在使 用溫度可控的自动设备及自动免疫组织化学染色设备、自动原位杂交装置的方法中的使用 均简便，故而优选。
[005引使用本发明的试剂盒的在I肥法、ICC法及I甜法中的染色或显色可W如下进行： 将试剂盒的各溶液混合，或在特定量的水中混合、溶解试剂盒的各溶液，调制含DAB底物溶 液，例如在使用载玻片的检体组织、检体细胞的酶抗体法时，通