来自长蒴黄麻和圆果种黄麻的编码wuschel相关的同源框4(wox4)蛋白的核苷酸序列和其 ...的制作方法
【专利说明】来自长菊黄麻和圆果种黄麻的编码WUSCHEL相关的同源框 4(W0X4)蛋白的核音酸序列和其使用方法
[000。 相关申请
[0002] 本申请要求2013年11月22日提交的美国临时申请号61/907, 617的益处；其全 部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明一般设及分子生物学领域并且设及通过调节植物中编码WUSC肥L相关的 同源框4蛋白（W0X4)多肤的核酸的表达，增强纤维产率相关的特性的方法。更具体地，本 发明提供了分离自两个黄麻植物物种，即，长葫黄麻和圆果种黄麻的WUSCHEL相关的同源 框4 (W0X4)同系物，和其在产生黄麻植物的初皮纤维中的应用，W及其转基因黄麻植物。
【背景技术】
[0004] 黄麻是环境友好的和生物可降解的天然纤维。其是可再生资源，每单位±地面积 具有高的生物质产生。超过100个黄麻物种（包括野生近亲缘类）产生天然初皮纤维。黄 麻由黄麻属植物产生，其曾经归类为锻树科，最近归类为锦葵科。但是，运些物种中的仅仅 两个，长葫黄麻和圆果种黄麻，产生适于工业目的使用的高质量纤维。作为天然纤维，黄麻 可用于各种途径，补充或替换人工合成材料，并且已经接收增加来自工业的注意。随着全球 对黄麻纤维需求的增加，需要进一步改善黄麻纤维产生。因此，研究纤维生物合成和开发设 及该纤维生物合成的分子生物学非常令人感兴趣。
[0005] 黄麻的纤维是木质部外纤维，其由两种类型的纤维组成和/或包括两种类型的 纤维：（i)在原生初皮部区域通过细胞分裂和修饰，由原形成层发育的主要初皮部纤维，和 (ii)由形成层通过纺键状活性和射线起始发育的第二初皮部纤维（Maiti和Mitra, 1972. BullBotSocBengal26:79 - 85)。运些原形成层和形成层组织通过导管元件分化抑制因子 (TID巧和TDIF受体（TDR)膜蛋白质激酶介导细胞与细胞通信，其促进原形成层细胞的增殖 和抑制它们的木质部分化（图l;Hirakawa等，2010).PlantCell，22:2618-2629;Etchells 等，2013.Development140, 2224-2234)。
[0006]WUSC肥L相关的同源框（WO讶基因家族在启动和/或保持各种胚芽、分生组织和器 官初始细胞期间进行相关的功能Ofaecker等，2004)。在WUSC肥L相关的同源框（WO讶基 因家族蛋白质中，W0X4用作TDIF信号传导途径的关键调节剂化irakawa等2010)并且优选 在原形成层和形成层中表达（Sc虹ader等，2004 ;Ji等，2010和Hirakawa等2010)。例如， TDIF-TDR诱导主转录因子WUSC肥L相关的同源框4 (W0X4)的转录，其促进保持拟南芥属和 西红柿中的原形成层/形成层干细胞。
[0007]WUSC肥L相关的同源框4(W0X4)多肤催化植物中初皮纤维的启动。但是，还未有许 多与该多肤相关的表征报道或存在现有技术提供的技术。美国专利号2011/0283420A1 (通 过参考并入）已经公开了WUSChel相关的同源框1样（WOXl样）多肤，用于改善植物中相 关的特征的产率。在另一欧洲专利号1451301B1中，公开了WUSChel基因在促进植物中体 细胞胚芽发生中的用途。最近，美国专利号2010/0100981A1(通过参考并入）中公开了一 些wuschel基因同系物。
[0008] 鉴于WUSC肥L相关的同源框4蛋白可在黄麻纤维的生物合成途径中其重要作用的 事实，期望通过开发和利用WUSC肥L相关的同源框4 (W0X4)的分子生物学和遗传信息，工业 提供植物中与纤维的生物合成相关的遗传方法。另外，因为植物每个物种的纤维生物合成 途径和遗传组成通常不同，所W物种特异性方法也是优选的W便优化从黄麻植物的纤维产 率，并且获得兼容的结果，W确保工业中的使用。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个方面等是提供基因编码蛋白质，源自长葫黄麻和圆果种黄麻，其参 与催化它们初皮纤维形成的启动，并且具有WUSC肥L相关的同源框4(W0X4)样序列。更具 体而言，本发明提供了具有诱导初皮部纤维能力的基因，因此提供了从而编码的蛋白质，W 及其用途。
[0010] 本发明的另一目的提供了待开发/使用而用于改善长葫黄麻和圆果种黄麻植物 W及其他产生初皮纤维的植物中纤维的生产、生长、强度和产率的WUSC肥L相关的同源框 4 (W0X4)的分子生物学和遗传信息。
[0011] 仍本发明的另一目的是通过调节WUSC肥L相关的同源框4 (W0X4)在植物中的生物 合成，获得具有增加的纤维产生的长葫黄麻和圆果种黄麻的转基因植物。
[0012] 本发明的仍另一目的是提供分离的多核巧酸，其具有特定的核巧酸序列，其可利 于公开方法的表现，并且提供对转基因长葫黄麻和圆果种黄麻植物的利用。
[0013] 本发明的进一步目的是提供潜在的商业上可行的方式，W增加用于黄麻纤维基产 品的纤维的生产。
[0014] 本发明提供了分离自长葫黄麻的基因，其编码具有如SEQ ID NO :3中阐释的氨 基酸序列的蛋白质，其参与催化初皮部纤维形成的启动并且具有WUSC肥L相关的同源框 4(W0X4)样序列。本发明进一步提供编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过添加或缺失 一个或多个氨基酸和/或用如SEQ ID NO :3中阐释的氨基酸序列的其他氨基酸替换而修 饰的氨基酸序列，其参与催化初皮部纤维的形成的启动并且具有WUSC肥L相关的同源框 4(W0X4)样序列。本发明进一步提供了与SEQ ID NO :1中阐释的核酸杂交的基因，尤其其 DNA或其一部分，并且编码参与催化初皮部纤维的形成的启动并且具有WUSC肥L相关的同 源框4(W0X4)样序列的蛋白质。
[0015] 本发明也提供了分离自圆果种黄麻的基因，其编码具有如SEQ ID NO :6中阐释的 氨基酸序列的蛋白质，其参与催化初皮部纤维的形成的启动并且具有WUSC肥L相关的同源 框4(W0X4)样序列。本发明进一步提供了编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过添加或 缺失一个或多个氨基酸和/或用如SEQ ID NO :6中阐释的氨基酸序列的其他氨基酸替换 而修饰的氨基酸序列，其参与催化初皮部纤维的形成的启动并且具有WUSC肥L相关的同源 框4(W0X4)样序列。本发明进一步提供了与SEQ ID NO :4中阐释的核酸杂交的基因，尤其 其DNA或其一部分，并且编码参与催化初皮部纤维的形成的启动并且具有WUSC肥L相关的 同源框4 (W0X4)样序列的蛋白质。
[0016] 根据本发明的一种优选的实施方式，使用的长葫黄麻的植物是品种0-4,和使用的 圆果种黄麻的植物是品种CVkl。
[0017] 本发明的另一实施方式公开重组基因构建体包括具有SEQIDNO:2和/或SEQID NO:5中阐释的核巧酸序列的多肤，其中多核巧酸在宿主细胞中是可表达的，W分别在长葫 黄麻和圆果种黄麻的植物中产生WUSC肥L相关的同源框4 (W0X4)的同系物。
[0018] 本发明的进一步实施方式是包括重组基因构建体的转化株，所述重组基因构建体 能够表达具有SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:5中阐释的核巧酸序列的多核巧酸，W产生 WUSCHEL相关的同源框4 (W0X4)蛋白的同系物。
[0019] 本发明也提供了产生蛋白质的方法，所述蛋白质参与初皮部纤维启动的催化活 性，并且具有WUSC肥L相关的同源框4 (W0X4)样序列，所述方法包括培养和/或栽培上述宿 主。
[0020] 本发明也提供了诱导植物或植物细胞的初皮部纤维启动的方法；此外，其也公开 了包括和/或由下述组成的方法：将上述基因引入植物或植物细胞，并且驱动所述基因的 表达。
[0021] 本领域技术人员容易认识到，本发明非常适于进行目标并且获得提到的目的和优 势，W及其中固有的那些。本文所述的实施方式不旨在限制本发明的范围。
[0022] 参考下述说明书和权利要求，将更容易理解本发明的运些和其他特征、方面和优 势。
【附图说明】
[0023] 图1显示TDIF-TDR信号传导途径。TDIF-TDR信号传导分成两个途径，一个是参与 初皮部细胞增殖的W0X4,其促进纤维细胞启动和另一个是假设因子X，其抑制脉管干细胞 的木质部分化。
[0024] 图2显示系统发生树，其比较来自长葫黄麻的SEQIDNO. 3和来自圆果种黄麻的 SEQIDNO. 6,W及产生WUSC肥L相关的同源框4 (W0X4)蛋白的其他氨基酸序列。
[00幼发明详述
[0026] 从下述形成本申请一部分的详细说明书和附图可更充分理解本发明。
[0027] 本文提供的定义和/或方法限定本发明并且在本发明的实践中指导本领域技术 人员。除非W其他方式指明，应根据相关领域技术人员的常规的用途理解术语。在任何定义 和/或方法与本文并入的任何专利或非专利参考文献提供的或其他地方出现的任何参考 文献的任何定义和/或方法不一致的情况下，应理解，本文使用在本申请中已经清楚提供/ 改编的所述定义和/或方法。单数术语"一个（a/an)"和"所述"包括复数参照物，除非上 下文清楚得另外指出。类似地，词语"或"旨在包括"和"，除非上下文清楚得另外指出。因 此，"包括A或B"意思是包括A或B，或A和B。进一步理解，为核酸或多肤提供的所有基础 尺寸或氨基酸尺寸，和所有分子量或分子量值是近似的，并且提供为了说明。尽管与本文所 述的那些类似或相同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但是下面描述了适当的方 法和材料。
[0028] 本发明设及分离的多核巧酸和源自其的相应多肤，所述多核巧酸编码提取自长葫 黄麻和圆果种黄麻的WUSC肥L相关的同源框4蛋白。更具体地，本发明提供了WUSC肥L相 关的同源框4同系物，和它们在改善都为黄麻植物物种的长葫黄麻和圆果种黄麻中纤维产 生的用途，W及相关的转基因长葫黄麻和圆果种黄麻植物。主要通过比较长葫黄麻和圆果 种黄麻基因组DNA的核巧酸序列和其他植物已知酶基因的核巧酸序列鉴定本发明编码酶 的基因组序列。在本发明之前，f运些长葫黄麻和圆果种黄麻基因的核巧酸序列、阅读框、 外显子和内含子的位置、酶的结构，W及它们在开发高纤维产率潜能的黄麻植物中的潜在 用途是未知的。
[0029] 商业上栽培的黄麻物种，长葫黄麻和圆果种黄麻的基因组序列的分析掲示两个物 种都具有编码具备优选用于增强纤维产生的催化活性的酶的单个基因。起初由软件程序， 比如Augustus,半HMM基核酸分析程序（SNAP)、Geneid(GenomeBioInformaticsResearch Lab)注释核巧酸序列，其可鉴定推定编码区域，内含子，和拼接接头。进一步进行自动和手