一种测定rhCNB含量的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及生物技术领域，特别设及一种测定rhCNB含量的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生 变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，最常见的是半脫氨酸，蛋白质对空气中 的氧较为敏感，容易发生结构的转变，形成一系列聚合物。
[0003] 巧调憐酸酶(化1C i neur i η, CN)是目前所知唯--种依赖化2 YCaM (巧调素）的蛋白 憐酸酶，由A，B亚基W1:1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，B亚基(CNB)是调节亚基。CN 在免疫激活通路中发挥重要作用，示T细胞活化的关键没。CN作为大分子酶蛋白，易失活，不 稳定，而CNB作为该酶的调节亚基，能促进CAN的活性，且相对分子质量小，性质稳定。由研究 表明CNB能刺激T细胞和NK细胞增殖W及增强NK细胞的杀伤活性，增强巨隧细胞吞隧能力等 免疫功能，且重组人巧调憐酸酶B亚基（Recombinant human Calcineurin B subunit, rhCNB)是开发中的基因工程创新肿瘤药物。
[0004] rhCNB具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，单体是一种含有两个琉基结构的蛋白，在 生产、放置等过程中，易受溫度、水分、pH值、光照、氧化等因素影响形成二聚体、Ξ聚体等多 聚体结构，造成各组分比例不稳定，无法准确测定其量。其纯化工艺中又需要用到缓冲盐、 络合剂、金属离子、氧化还原性物质等等对蛋白测定有干扰的物质。
[000引传统的蛋白质测量方法普遍存在专属性弱、准确度低、重复性差、操作复杂、易受 干扰等等缺点。蛋白质在纯化过程中往往含有各种干扰性物质或者目标蛋白自身组分复杂 等问题，造成目标蛋白在各工艺步骤中回收率难W准确计算。
[0006] 凯氏定氮法缺点:①主要针对氮为负Ξ价的有机氮化合物，不包括叠氮化合物，联 氮，偶氮，腺，硝酸盐，亚硝酸盐，硝基，腊，目亏和半卡己腺类的含氮化合物，导致最终测定的 是总有机氮，而不只是蛋白质氮;②精度差;③所用试剂有腐蚀性等问题。
[0007] Lowry法缺点：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的 蛋白质，有一定的误差.故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。②若样品 中含有嚷岭、喀晚、核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
[0008] Folin酪法缺点：①费时，要精确控制操作时间；②试剂的配制比较繁琐且酪类和 巧樣酸、硫酸锭、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原型DTT、琉基乙醇、EDTA、脈素均会干 扰反应。
[0009] 紫外吸收法缺点①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差;②干扰物质多，若样 品中含有嚷岭、喀晚及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。
[0010] 考马斯亮蓝法缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
[0011] 双缩脈法缺点①灵敏度差;②化is、一些氨基酸和邸TA等会干扰该反应。
[0012] 2010版《中国药典》Ξ部附录VIU采用高效液相法及Ci8色谱柱梯度洗脱检测重组人 粒细胞集落刺激因子方法，对疏水性相近的蛋白质分辨率较低。
[0013] 因此，提供一种准确测定重组人巧调蛋白憐酸酶B亚基蛋白质含量的方法具有重 要的现实意义。
【发明内容】
[0014] 有鉴于此，本发明提供一种测定rhCNB含量的方法。该方法能够准确测定rhCNB的 含量，排除使用经典方法所带来的重复性差、抗干扰能力低、结果不准确等问题。
[0015] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0016] 本发明提供了一种现憶rhCNB含量的方法，包括如下步骤：
[0017] 步骤1:取rhCNB粗品，与还原剂混合发生还原反应，制得供试品溶液；
[0018] 步骤2:取所述供试品溶液、已经标定的化CNB对照品分别经高效液相色谱测定，按 照外标法W峰面积获得rhCNB的含量。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述还原剂为还原型DTT(二硫苏糖醇）、还原型 谷脫巧肤、β-琉基乙醇、棚氨化钢或亚硫酸氨钢中的一种或两者W上的混合物。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述还原反应的反应溫度为80°C~100°C，所述 还原反应的反应时间为15~60min。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，所述还原剂的使用量至少为所述rhCNB粗品的 蛋白量的l%(w/w)。
[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，Wg/mol计，所述rhCNB粗品（折纯重组人巧调蛋 白憐酸酶B亚基6. Omg)与所述还原剂的质量摩尔比为6:0.08。
[0023] 在本发明中，所述rhCNB粗品（折纯重组人巧调蛋白憐酸酶B亚基6.Omg)是指将被 检测蛋白调到运个浓度附近可W得到准确度更高的结果。一般蛋白样品在制备提取时是采 用色谱层析等纯化技术获得的，层析的过程中一般有280nm、214nm等图谱，根据收集样品量 和吸收峰的高度大概可知蛋白浓度，运是一个经验值。对于完全未知浓度的样品可W先预 配一个浓度的样品测定后再进行重新稀释或者浓缩使指符合检测要求;也可W通过紫外等 简易粗略的的方法来测定其大概浓度，再由高效液相进行精密测定。
[0024] 在本发明的一些具体实施方案中，所述还原反应还需碱性环境;所述碱性环境包 括添加金属氨氧化物、强碱弱酸盐、TRIS生物碱或碱性氨基酸中的一种或两者W上的混合 物。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，Wg/mL计，所述rhCNB粗品（折纯重组人巧调蛋 白憐酸酶B亚基6. Omg)与所述金属氨氧化物的质量体积比为6:40。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，所述供试品溶液的浓度为0.6mg/mL。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱采用凝胶柱，W含异丙醇的 憐酸盐缓冲液pH7.0溶液为液动相。
[0028] 在本发明的一些具体实施方案中，所述流动相的流速为0.7mL/min。
[0029] 在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱的检测波长为280nm。
[0030] 本发明具体设及了一种能够准确测定蛋白质含量的方法。通过还原型DTT或其他 还原剂打开各种聚合物的二硫键形成均一稳定的单体结构，使用高效液相和凝胶色谱柱进 行分析后采用面积归一化法计算其含量。
[0031 ]本发明提供了一种测定rhCNB含量的方法，包括如下步骤:步骤1:取rhCNB粗品，与 还原剂混合发生还原反应，制得供试品溶液;步骤2:取所述供试品溶液、已经标定的rhCNB 对照品分别经高效液相色谱测定，按照外标法W峰面积获得RhCNB的含量。本发明在研究 rhCNB项目的过程中，发现rhCNB由于二硫键的形成，产生了单体、二聚体、Ξ聚体、四聚体等 一系列聚合物。其含量的测定因组分比例的不同而出现较大偏差重复性较差。对含有rhCNB 的多组分样品进行还原，得到单一rhCNB单体的样本。再采用高效液相和凝胶柱进行测定， 既排除了各种无机盐和含氮小分子又排除了杂蛋白、核酸等大分子的干扰，得到单一的目 标峰。该方法专属性好、抗干扰性强、结果准确、重复性高。为验证该方法的专属性、抗干扰 性、准确性W及重复性，在实施例中对样品加入各种类型的干扰物质仙15、66了4伯 2+、构祿 酸盐缓冲液、小分子盐类及氨基酸），均取得良好结果。
[0032] 本发明相较凯氏定氮法、Lowry法(福林酪法）、双缩脈法等经典方法，本法具有专 属性好、准确度高、简便易行等优点。
【附图说明】
[0033] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0034] 图1示实施例2的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、TRIS等小分子、最 后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0035] 图2示实施例3的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、巧樣酸根峰、最后 一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0036] 图3示实施例4的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、最后 一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0037] 图4示实施例5的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、还原 型DTT及其衍生物氧化型DTT、最后一个峰是色氨酸峰，金属离子(Ca 2+)的峰未有明显吸收峰 即使有吸收也在DTT附近远离目标蛋白峰；
[0038] 图5示实施例6的色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、最后一个峰 是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0039] 图6示实施例6的色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、最后一个峰 是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0040] 图7示实施例6的色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、最后一个峰 是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0041] 图8示实施例6的色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、最后一个峰 是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0042] 图9示实施例6的色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸根峰、最后一个峰 是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0043] 图10示实施例7中重复1的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸 根峰、最后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0044] 图11示实施例7中重复2的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸 根峰、最后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0045] 图12示实施例7中重复3的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸 根峰、最后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0046] 图13示实施例7中重复4的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸 根峰、最后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0047] 图14示实施例7中重复5的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸 根峰、最后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0048] 图15示实施例7中重复6的色谱图；色谱图中各吸收峰依次是目标蛋白峰、构祿酸 根峰、最后一个峰是还原型DTT及其衍生物氧化型DTT。
【具体实施方式】
[0049] 本发明公开了一种测定rhCNB含量的方法，本领域技术人员可W借鉴本文内容，适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0050] 本发明的主要目的是准确测定rhCNB的