专利名称：铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
正常成人体内含铜量为80~150mg，血循环铜占总铜量的10%。血 浆中约95。/。铜a2球蛋白牢固结合，称为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin),经 酸处理后才能与铜试剂反应。其余5%为游离铜。许多酶都含有铜，如 细胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪 氨酸酶、多巴胺P-羟化酶等。与白蛋白疏松结合的铜是运输、吸收、 排泄的重要形式和中间环节，也是合成各种细胞蛋白的原料。其它铜 蛋白还有血铜蛋白、肝蛋白和脑铜蛋白。铜参与造血过程，主要影响 铁的吸收、运送和利用。
生物体液与组织中铜的测定方法包括分光光度法，火焰和无火焰原
子吸收分光光度法、发射光谱法、中子活化分析法和阳极溶出伏安法 等。铜的分光光度法都是利用铜形成有色络合物。火焰原子吸收法利 用铜离子在火焰中被还原为CuQ，从铜空心阴极灯发出的光波CuG吸收 的量与浓度成正比，用于血清、尿、组织中铜的测定。阳极溶出伏安 法是将铜离子作为汞齐被镀于阳极上，电压变得更正，使Cu从阳极"剥 下"或再次溶解，形成的电流与Cu的浓度成正比，广泛应用于环境分
析。中子活化分析是利用中子将"Cu转变成不稳定6401同位素，后者 衰变时释放Y射线可在1。 34MeV计数，应用于特定研究中心。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶倍增法(Enzymatic doubling Method)、酶比色t去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定铜浓度的方法，同时，本发 明还将给出用以实现该方法的铜诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可 以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行铜浓度测定， 而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明铜浓度测定方法原理如下
赖氨酸+氧+水赖氨酸氧化酶/Cu^ 6-氨基-2-氧代己酸
+氨+过氧化氢
氨+酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+
水+辅酶
过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+ 2水 这种方法应用需要铜激活的赖氨酸氧化酶(lysine oxidase; EC 1.4.3.13; EC 1.4.3.14)酶(偶)联谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3)、 NADH过氧化物酶(NADH peroxidase ; EC
l.ll丄l; EC1.11丄2)酶促反应连续监测/速率比色法。赖氨酸氧化酶
酶解赖氨酸反应产生氨及过氧化氢，再通过(偶)联合谷氨酸脱氢酶、
NADH过氧化物酶分别作用于氨及过氧化氢，最终都将还原型辅酶(在
340nrn处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nrn处没有吸收峰)，从而 得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm 处吸光度下降的速度，可以测算铜的浓度大小。谷氨酸脱氢酶及NADH 过氧化物酶可以只加一个，二个都加就起倍增作用，可以提高灵敏度'倍。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明铜诊断/测定 试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
赖氨酸 20 mmol/L
酮戊二酸酯 16 mmol/L
赖氨酸氧化酶 12000 U/L
谷氨酸脱氢酶 16000 U/L
本发明的铜诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸 氧化酶、谷氨酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯。
试剂2
缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶 在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、赖氨酸、酮戊二酸酯。 试剂3
缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶 在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定铜浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的铜诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
酮戊一
指
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 16 mmol/L 12000U/L 16000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测铜样 品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时 间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出铜的浓 度大小。 实施例二
本实施例的铜诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
画mmol/L
50 mmol/L
还原型辅f
0.25 mmol/L12 mmol/L
酮戊二酸酯
20 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
赖氨酸氧化酶
100mmol/L
50 mmol/L
16000U/L 20000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测铜样 品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反 应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出铜的浓 度大小。 实施例三
本实施例的铜诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂 还原型辅酶 试剂2
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
酮戊二酸酯
100mmol/L 10 mmol/L 26 mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂
赖氨酸氧化酶
50 mmol/L 24000 U/L 36000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定铜浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm，测试副波长 405nm，被测铜样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5， 反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间 2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出铜的浓
度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应
用。
权利要求
1.一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的铜浓度测定方法，其方法原理如下赖氨酸+氧+水 赖氨酸氧化酶/Cu2+ 6-氨基-2-氧代己酸 +氨+过氧化氢氨+酮戊二酸酯+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸+ 水+辅酶过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶 辅酶+2水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出铜的浓度大小测定结果。
2. —种铜诊断/测定试剂盒，主要成分包括: 缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 1-20 mmol/L还原型辅酶 0.1-0.35 mmol/L赖氨酸 1-50 mmol/L酮戊二酸酯 1-50 mmol/L赖氨酸氧化酶1000"——80000 U/L谷氨酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液体试剂，直接使用。根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧 化酶、谷氨酸脱氢酶组成单剂试剂。
3.
4. 根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧 化酶、谷氨酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯组成；试剂2，由缓冲液、稳定 齐U、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、赖氨酸、酮 戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。
5. 根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧 化酶、谷氨酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶组成；试剂2,由缓冲液、赖氨酸、酮戊二酸酯组成； 试剂3，由缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成。 还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶 在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1—4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸 铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出铜的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101173933SQ200610097309
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司