专利名称：热稳定脂肪酶及其编码基因与应用和专用工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及遗传工程领域，特别是涉及一种热稳定脂肪酶及其编码的基因，生产热稳定脂肪酶的工程菌及其构建，及利用该工程菌制备热稳定脂肪酶的方法。
背景技术：
脂肪酶(EC3.1.1.3)是一类催化分解三脂酰甘油的水解酶，分解反应发生的部位是三脂酰甘油的酯键，分解的最终产物是甘油和脂肪酸。在特定的非水相系统中，脂肪酶还催化分解反应的逆反应，及酯化合成和转酯反应(Biochem.J.1999，343177-183；Curr.Opin.Biotechnol.2002，13390-397)。脂肪酶从结构上看属于α/β水解酶类，具有由Ser，His和Asp三个氨基酸构成的典型的活性区，其中Ser通常位于具有保守的Gly-X-Ser-X-Gly五肽结构内(Protein Eng.1992，5197-211，Biochem.J.1999，343177-183)。
脂肪酶的一个最显著的特点是它不同于其它多数水解酶类，其反应体系是一种非均相体系，水溶性的酶在非水溶性底物与水的界面上催化底物进行反应。80年代后期以来，界面酶学和非水相酶学的研究与应用取得了突破性进展，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的研究和开发。脂肪酶可催化反应的底物众多，在有机溶剂中能催化大量的反应，包括以许多非天然的酰基受体，如乙醇、酰胺、胺和过氧化物为底物的反应(Asymmetry，1993，41105)。同时脂肪酶催化反应通常具有位置选择性，如有的脂肪酶主要作用于三脂酰甘油的1，3位酯键；有的脂肪酶同时水解三个酯键；而有的脂肪酶主要水解2位酯键等。更重要的是，脂肪酶催化反应通常具有立体构象选择性。因此脂肪酶已成为手性物质酶法合成中重要的酶类之一，如利用脂肪酶催化的酯化或酯水解反应拆分芳基丙酸类非甾体消炎镇痛药物萘普生、布洛芬，产物的光学纯度可达95％以上；利用脂肪酶催化的酯化反应拆分合成手性药物、农药、液晶等的重要原料2-辛醇，产物光学纯度达80％左右。
近年来，脂肪酶的应用范围不断拓宽，已成为目前国际上最重要的工业酶类之一。不仅能用于人们的日常生活中，如洗衣粉、污水处理，还能用于精细化工、生物柴油、医药工业、食品工业等行业中(Curr.Opin.Biotechnol.2002，13390-397)。来源不同的脂肪酶的底物专一性、最适催化条件和稳定性都有差异。其中热稳定脂肪酶以其高度的热稳定性而具有更广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种热稳定脂肪酶及其编码基因。
一种热稳定脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
所述缺失，插入和/或取代，可以是除去N-端推测的信号肽序列、在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合等、不影响序列的修饰形式上的差异等，其中衍生的蛋白质还包括热稳定脂肪酶的活性片段等。
序列表中的SEQ ID №2由403个氨基酸残基组成，其中自C末端1-24氨基酸为热稳定脂肪酶信号肽序列，25-403氨基酸为热稳定脂肪酶成熟肽序列，350-354氨基酸(GPSDG)为脂肪酶保守的五肽序列。
一种热稳定脂肪酶的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在中度严谨条件下能与序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
其中所说的同源性是指至少70％相同，较佳的是至少80％相同，更佳的是至少90％相同，最佳的是至少95％相同。
序列表中的SEQ ID №1由1212个碱基组成，其中1-72bp编码热稳定脂肪酶信号肽，73-1212bp编码热稳定脂肪酶成熟肽。
序列表中的SEQ ID №1来源于腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)，该菌生活在我国云南省腾冲地区热泉中，是一种嗜热的真细菌，最适生长温度为75℃，厌氧生长，革兰氏染色呈阴性。
本发明的目的之二是提供一种构建生产热稳定脂肪酶基因工程菌的方法以及用该方法得到的工程菌。
一种生产热稳定脂肪酶工程菌的构建方法，包括以下步骤1)构建含有热稳定脂肪酶基因的表达质粒；2)将其转化到宿主细胞中；3)经抗性培养基筛选得阳性克隆。
生产热稳定脂肪酶的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞
1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在中度严谨条件下能与序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中所述原核细胞或真核细胞优选的为大肠杆菌、枯草杆菌和酵母细胞，也可以是其它的各种动植物细胞。
当用大肠杆菌为宿主细胞时，得到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)LIP7093，该菌株已于2003年05月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 0925。
在构建生产热稳定脂肪酶工程菌的过程中，可选用本领域已知的各种载体，如市场销售的各种质粒、粘粒、噬菌体及病毒载体等。可以将热稳定脂肪酶基因序列直接连于表达载体中表达调控序列下游，形成热稳定脂肪酶表达载体。用本发明基因的部分序列构建表达热稳定脂肪酶的表达载体，是指用可编码具有相当热稳定脂肪酶活性基因的部分序列，如去除编码信号肽的核苷酸序列后的基因序列，来构建该酶的表达载体。该表达载体含有复制起始点和表达调控序列，启动子，还可能含有增强子和必要的加工信息位点。表达载体还可以含有可供选择的标记基因，如提供对抗生素或其它毒性物质(氨苄青霉素，卡那霉素，氨甲蝶呤等)的抗性的编码基因，或互补营养缺陷型的蛋白质的编码基因，或提供复合培养基中没有的必需营养成分的蛋白质的编码基因。各种不同宿主的合适标记基因是本领域中所熟知或生产厂商说明书注明的。这些表达载体可以用本领域技术人员所公知的重组DNA技术制备，如可参考Sambrook等人的做法(分子克隆实验指南，1989)等。重组表达载体可以用本领域熟知的方法引入宿主细胞，这些方法包括电转化法，氯化钙法，基因枪法等。将外源重组载体导入宿主细胞的过程称为“转化”。本发明所述的分离的热稳定脂肪酶基因全长序列或其片段通常可以用PCR(聚合酶链式反应)扩增法，重组法，或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，用本领域技术人员已知的常规方法制备的嗜热厌氧菌全基因组DNA为模板，扩增而得到有关序列。一旦获得了有关序列，就可以将其克隆入有关载体，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量的有关序列。
本发明的目的之三是提供一种生产热稳定脂肪酶的方法。
为了达到上述目的本发明采取以下技术方案
一种生产热稳定脂肪酶的方法，包括以下步骤1)大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌LIP7093 CGMCC No.0925在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，36-38℃条件下振荡培养10-18小时；2)转接入发酵罐中继续培养，加入IPTG诱导热稳定脂肪酶过量表达；3)收集菌体，超声破碎得到热稳定脂肪酶。
本发明中，通过培养宿主细胞，诱导所需蛋白的高效表达表达，并通过本领域所熟知的蛋白分离技术，如柱层析等得到所需的蛋白质。也可采用固相技术等人工合成该蛋白质。所谓“高效表达”，是指该热稳定脂肪酶表达产量至少可达该“宿主细胞”总蛋白的15％以上，通常最佳可达“宿主细胞”总蛋白的30-45％。
生产过程中的诱导剂IPTG是在菌体浓度的OD650值达到0.6-1.0时加入的，并且IPTG在培养基中的终浓度以0.1～1mM为宜。
本发明所提供的具有序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列特征的热稳定脂肪酶，根据实验结果具有如下性质1)在15-85℃间均具有明显的脂肪酶活性，其最适温度为60-70℃(如图2-A所示)；2)高度的热稳定性，在50℃保温10小时后可仍保持80％以上的活性(如图2-B所示)；3)该酶碱性环境(pH7.0-10.0)中具有脂肪酶活性，其最适pH为9.0(如图3所示)；4)该酶的脂肪酶活性不依赖于金属离子；5)该酶在1％的Triton X-100或CHAPS中相对稳定；6)该酶对短链的脂肪类物质具相对较高的脂肪酶活性，具有广泛的工业应用价值。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
图1为热稳定脂肪酶高效表达工程菌构建示意2-A为温度对热稳定脂肪酶活性的影响曲线图2-B为温度对热稳定脂肪酶稳定性的影响曲线图3为pH值对热稳定脂肪酶活性的影响曲线图4热稳定脂肪酶活性快速检测的三丁酸甘油平板法结果图5热稳定脂肪酶基因在大肠杆菌中的高效表达产物及其纯化产物的电泳鉴定图具体实施方式
实施例1、热稳定脂肪酶基因的克隆及高效表达工程菌的构建如图1所示，热稳定脂肪酶基因的克隆及高效表达工程菌的构建包括以下步骤1)分析腾冲嗜热杆菌的基因组DNA，通过核酸序列分析，发现在腾冲嗜热杆菌的基因组中存在着编码具有α/β水解酶折叠结构的乙酰基转移酶或水解酶(predictedacetyltransferases and hydrolases with the alpha/beta hydrolase fold)的基因，将其命名为LipA，通过同源性分析发现其编码的氨基酸序列(SE ID NO.2)第101至221位氨基酸所在的片段与典型的脂肪酶家系I(Curr.Opin.Biotechnol.2002，13390-397)具有26％至36％的一致性，并具有保守的五肽序列Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly(第350至354位氨基酸)。因此推测其为一种热稳定脂肪酶。其N末端24个氨基酸编码1个典型的信号肽结构，通过信号肽分析软件可得到证明(Protein Eng.1997，10，1-6)。
2)根据推测的热稳定脂肪酶的基因序列(SEQ ID NO.1)，设计如下引物引物15’-TCGGATCCCACATCATATTTTGATCCAAC-3’BamHI引物25’-CGAAGCTTTTCTCATTTTGACAATT-3’HindIII为了实现在大肠杆菌胞内的高效表达，通过上述引物扩增出该基因主要的功能序列，而去除了编码该热稳定脂肪酶蛋白N端的信号肽的序列。
3)以腾冲嗜热杆菌总DNA为模板，以上述引物，采用常规PCR技术扩增得到编码热稳定脂肪酶成熟肽(指不含信号肽部分)的DNA片段。SEQ ID NO.1中的1-72bp编码热稳定脂肪酶信号肽，73-1212bp编码热稳定脂肪酶成熟肽。
4)回收PCR产物，经过BamHI和HindIII酶切，酶切产物用T4连接酶连接到同样酶切后的pET23b表达载体上，获得热稳定脂肪酶表达质粒pLip709；将其转化到大肠杆菌BL21DE3中，经抗性培养基筛选得阳性克隆并进行酶切鉴定。从而获得该热稳定脂肪酶在大肠杆菌中高效表达的工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)LIP7093。
实施例2、热稳定脂肪酶基因在工程菌LIP7093中的高效表达在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养工程菌LIP709312小时，转接入发酵罐中，当菌体浓度的OD650值达到0.6-1.0时，加入IPTG至0.5mM诱导该热稳定脂肪酶过量表达，收集菌体，超声破碎。表达产物的活性可通过三丁酸甘油平板检测法进行初步鉴定，结果如图4所示，表明发酵产物具有脂肪酶活性。产物表达量用SDS-PAGE电泳鉴定，如图5中的2泳道所示，其表达量可达菌体总蛋白45％左右。
表达后的湿菌体悬浮于50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。超声破碎，离心去沉淀，上清用截留分子量为10KDa的切向流超滤膜包浓缩和部分纯化，浓缩液经Sephadex G100柱层析，柱用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱，收集有脂肪酶活性部分，进行纯度鉴定，纯度可达电泳检测为单一条带(如图5中的5、6泳道所示)。
实施例3、活性测定及性质分析2.0ml对硝基苯酚月桂酸酯(p-nitrophenyl laurate)溶液(在50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中加入p-NPL 0.05％(W/V)，Triton X 100 1％(V/V)，异丙醇5％(V/V))中加入2.0ml 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，混匀后在70℃条件下保温5分钟，加入0.4ml本发明实施例2中得到的稀释酶液，70℃反应15分钟(对照用0.4ml的同样稀释的死酶液代替)，在410nm用对照反应液作对照测吸光度A，根据对产生的对硝基苯酚的浓度可计算酶活性。采用类似反应条件，分析出本发明热稳定脂肪酶的最适温度为60-70C(图2-A)，最适pH为9.0(图3)，具有高度的热稳定性，在50℃保温10小时后可仍保持80％以上的活性(图2-B)，以及该酶的脂肪酶活性不依赖于金属离子，在1％的Triton X-100或CHAPS中相对稳定，对短链的脂肪类物质具相对较高的脂肪酶活性。证明基因工程生产的该热稳定脂肪酶保持了其天然产物基本相同的性质。
序列表<160>2<210>1<211>1212<212>DNA<213>腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)<400>1atgaggaagc taagagtatt tcctctattg gtaataatgt cgttgttatt atttcaagga 60cattataaag caacatcata ttttgatcca acaccagtaa aaacctttac cgactctaaa 120tactgggcta aagtggaact tttgagagat agcaatccta atataggaca agaaaaattt 180ataacagata atcaacaaaa agatccagaa attatcaaag aatttaacaa caatcctcaa 240ccaaattcac aatatttttt gctccactat gcacccggtt gggatacagg cacaaagcca 300tatcctgtaa ttcttgttca cggtgctggg tccgatgcaa acttttttgc agatcctaaa 360agggatggtt cgattactgg tttgatgcaa tatctttcgc aaagaggtta taaagtcttt 420gctgttacat ttgcgcatcc tcatggggac aattacattc aaagagagat tcttgctgat 480gtgattcaga aggttaaggc tgtaacagga gcaagtaaag ttgatattgt agcacatagt 540aaaggcaata tgtccgcaag aatgtacgtg tcaaatgtca aagaatcatg gggagttgat 600tttggaaaag atgtgagaag atatatccag ctgggagctc caaatggtgg aattgacttt 660acttttagga atccaaatat ggcatggggt ataatgacaa ctggaggatt tggacctgtt 720ccttatactt atatgttgat ttatggatta tggtataata ccacctatca cagtatatat 780acagaaggtg gtgcctatcc aggacaactt cagatgctag caagatggga tagtgtatat 840cctctaaata caacgcagca agattggtat acaacttatt atggagggtg gggatttgct 900agttattcct atggaataaa ttatgcaatt aaagaaggcg gaaatcttgt taatacatta 960cagaattccc ctgtagatcc ttctgtagaa atagctgtgt tggctggaga ttataattat1020ataaatggtg ttccgtggga gaccacaggg cccagtgatg gattagtatt tgtaaaaagt1080gctactgata catcggcaat gacaaaatca ggggcaaaac ttttagcgaa agacgtatac1140catttaaatc accttgagct ggcatatgat aaatcagcta tggattggat agatgcacaa1200ttgtcaaaat ga1212<210>2<211>403<212>PRT<213>腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)<400>2
Met Arg Lys Leu Arg Val Phe Pro Leu Leu Val Ile Met Ser Leu15 10 15Leu Leu Phe Gln Gly His Tyr Lys Ala Thr Ser Tyr Phe Asp Pro20 25 30Thr Pro Val Lys Thr Phe Thr Asp Ser Lys Tyr Trp Ala Lys Val35 40 45Glu Leu Leu Arg Asp Ser Asn Pro Asn Ile Gly Gln Glu Lys Phe50 55 60Ile Thr Asp Asn Gln Gln Lys Asp Pro Glu Ile Ile Lys Glu Phe65 70 75Asn Asn Asn Pro Gln Pro Asn Ser Gln Tyr Phe Leu Leu His Tyr80 85 90Ala Pro Gly Trp Asp Thr Gly Thr Lys Pro Tyr Pro Val Ile Leu95 100 105Val His Gly Ala Gly Ser Asp Ala Asn Phe Phe Ala Asp Pro Lys110 115 120Arg Asp Gly Ser Ile Thr Gly Leu Met Gln Tyr Leu Ser Gln Arg125 130 135Gly Tyr Lys Val Phe Ala Val Thr Phe Ala His Pro His Gly Asp140 145 150Asn Tyr Ile Gln Arg Glu Ile Leu Ala Asp Val Ile Gln Lys Val155 160 165Lys Ala Val Thr Gly Ala Ser Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser170 175 180Lys Gly Asn Met Ser Ala Arg Met Tyr Val Ser Asn Val Lys Glu185 190 195Ser Trp Gly Val Asp Phe Gly Lys Asp Val Arg Arg Tyr Ile Gln200 205 210Leu Gly Ala Pro Asn Gly Gly Ile Asp Phe Thr Phe Arg Asn Pro215 220 225Asn Met Ala Trp Gly Ile Met Thr Thr Gly Gly Phe Gly Pro Val230 235 240Pro Tyr Thr Tyr Met Leu Ile Tyr Gly Leu Trp Tyr Asn Thr Thr245 250 255Tyr His Ser Ile Tyr Thr Glu Gly Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Leu260 265 270Gln Met Leu Ala Arg Trp Asp Ser Val Tyr Pro Leu Asn Thr Thr275 280 285Gln Gln Asp Trp Tyr Thr Thr Tyr Tyr Gly Gly Trp Gly Phe Ala290 295 300Ser Tyr Ser Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Ile Lys Glu Gly Gly Asn305 310 315
Leu Val Asn Thr Leu Gln Asn Ser Pro Val Asp Pro Ser Val Glu320 325 330Ile Ala Val Leu Ala Gly Asp Tyr Asn Tyr Ile Asn Gly Val Pro335 340 345Trp Glu Thr Thr Gly Pro Ser Asp Gly Leu Val Phe Val Lys Ser350 355 360Ala Thr Asp Thr Ser Ala Met Thr Lys Ser Gly Ala Lys Leu Leu365 370 375Ala Lys Asp Val Tyr His Leu Asn His Leu Glu Leu Ala Tyr Asp380 385 390Lys Ser Ala Met Asp Trp Ile Asp Ala Gln Leu Ser Lys395 400 40权利要求
1.一种热稳定脂肪酶基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在中度严谨条件下能与序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述基因为序列表中的SEQ ID №1。
3.一种热稳定脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的热稳定脂肪酶，其特征在于所述热稳定脂肪酶具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列。
5.一种生产热稳定脂肪酶工程菌的构建方法，包括以下步骤1)构建含有热稳定脂肪酶基因的表达质粒；2)将其转化到宿主细胞中；3)经抗性培养基筛选得阳性克隆。
6.生产热稳定脂肪酶的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在中度严谨条件下能与序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中所述原核细胞或真核细胞优选的为大肠杆菌、枯草杆菌和酵母细胞。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)LIP7093 CGMCC No.0925及其突变体或变异体。
8.一种生产热稳定脂肪酶的方法，包括以下步骤1)大肠埃希氏菌(Escherichia coli)LIP7093 CGMCC No.0925在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，36-38℃条件下振荡培养10-18小时；2)转接入发酵罐中，继续培养至对数中期，加入IPTG诱导热稳定脂肪酶过量表达；3)收集菌体，超声破碎得到热稳定脂肪酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的IPTG是在菌体浓度的OD650值达到0.6-1.0时加入的。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的IPTG在培养基中的终浓度为0.1-1mM。
全文摘要
本发明公开了一种热稳定脂肪酶及其编码基因与应用和专用工程菌。该热稳定脂肪酶的基因，是与序列表中的SEQ ID№1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。其编码蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与序列2所限定蛋白活性基本相同的由序列2衍生的蛋白质。本发明还公开了一种生产热稳定脂肪酶的基因工程菌LIP7093，其保藏号为CGMCC No.0925，以及该工程菌的构建方法及利用该工程菌生产热稳定脂肪酶的方法。本发明所得到的热稳定脂肪酶具有高度的热稳定性，该工程菌能够在宿主细胞中高效表达，具有广泛的应用前景和经济意义。
文档编号C12N1/16GK1552866SQ0313656
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月27日 优先权日2003年5月27日
发明者向华, 张健, 周坚, 田宇清, 谭华荣, 向 华 申请人:中国科学院微生物研究所