专利名称：重组人骨形成蛋白4和7在甲醇酵母中的高效表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用甲醇酵母(Pichia pastoris)高效表达人骨形成蛋白技术，尤其涉及根据酵母偏爱密码子对人骨形成蛋白成熟肽序列进行定点突变技术，属于生物工程技术领域。
骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一类广谱性的蛋白质生长调节因子，其全长cDNA约为1.2Kb。在哺乳动物(包括人类)中已发现的BMPs家族成员至少有16种，它们对骨质的生长、神经细胞的再生、创口愈合以及神经肿瘤的治疗等均有明显的促进作用。就骨质生长发育而言，BMP-2(也称之为BMP-2A)、BMP-4(也称之为BMP-2B)及BMP-7具有明显的促使细胞组织分化形成骨组织的作用，而且这三种BMPs同时具有明显的促进成体骨组织再生的作用。因此BMPs在骨科临床及相关的临床学科上有着极为广泛的应用前景。然而BMPs在骨组织中的含量只有百万分之一。提取的步骤烦琐，存在重复性差、产量低、生产成本昂贵以及产品纯度不高等缺点。因而不能满足临床科研和基础研究的要求。
1988年至今，人BMP 1-13的cDNA序列均已得到克隆，这使得应用基因工程技术生产重组人BMPs成为可能(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87卷，第2220-2224页，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87卷，第9843-9847页，1990；J.Biol.Chem.第267卷，第25220-25227页，1992；Mel.Reprod.Dev.第32卷，160-167页，1992)。对人BMPs基因表达的研究，国外多用CHO、COS、HOS等真核细胞，其活生虽好，但生产成本高、产量低、无法达到大规模生产要求。利用人BMP-7和鼠BMP-2的启动子探测骨相关物质的方法已申请专利(CN 1307643 A，WO 97/15305)，然而其获得的只是小分子量有机化合物，而非重组BMPs。国内也有相关研究，构建了重组人BMP-2、-3部分或完整成熟肽cDNA片段的表达载体，利用大肠杆菌表达出了有诱导骨活性的人BMP-2、-3肽段(生物工程学报15卷3期，288-292，1999；CN1165189A；生物化学杂志10卷3期，318-324，1994)。大肠杆菌表达体系表达量虽高，但其背景杂蛋白多，纯化麻烦，重要的是不能对真核生物蛋白质进行翻译后的修饰和加工，最终影响产物的生物活性。
甲醇酵母表达体系是最近发展迅速的一种外源蛋白表达系统，与以往的基因表达体系相比，它具有无可匹敌的高表达特性(1)适合高密度发酵培养。生产成本低，便于工业化生产；(2)能高效严格地调控外源蛋白的表达，表达的蛋白可分泌至胞外，且自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，利于纯化。
统计学分析110个酵母基因使用密码子的情况表明61个密码子中有25个为偏爱密码子，对偏爱密码子的使用程度和基因表达水平呈正比。如在酵母大量表达的基因中编码精氨酸的6个密码子中AGA的使用频率为86.6％，几乎不使用CGA和CGG这两个密码子。目前利用甲醇酵母表达外源蛋白不乏报道和专利，如表达人血管内皮细胞抑制素(CN 1305004A)，鱼生长激素(CN 1207415A)及人白细胞介素11(CN 1288062A)等，但利用甲醇酵母高效表达人骨形成蛋白在国内外尚属首例。由于人BMPs是一类磷酸化的二聚体糖蛋白多肽，其磷酸和多糖结构与其生理活性密切相关，因此本发明中可通过甲醇酵母表达体系对定点突变后的人骨形成蛋白成熟肽cDNA序列进行表达，并对表达蛋白进行结构上的加工修饰，使其生物活性增强。另外修饰后的人骨形成蛋白具较低的糖基化程度，对人体也无明显的抗原性，适于临床治疗用途。
本发明的目的在于提供甲醇酵母基因工程菌株GS115。该工程菌能够分别高效表达人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7异型二聚体，为大规模生产高纯度重组人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7异型二聚体以用于骨科及相关临床治疗奠定基础。
本发明的另一目的在于提供了构建能高效表达重组人BMP-4和BMP-7及BMP-4-BMP-7异型二聚体的甲醇酵母基因工程菌株GS115的方法。
本发明通过以下技术方案加以实现分别以含人BMP-4和人BMP-7 cDNA序列的质粒pBluescript KS-BMP4和pBluescript KS-BMP7为模板，PCR扩增得到人BMP-4和人BMP-7成熟肽cDNA序列。分别克隆到甲醇酵母表达质粒pPIC9K中，得到pPIC9K-BMP4和pPIC9K-BMP7。碱性溶菌小量制备法提取质粒DNA，分别以pPIC9K-BMP4和pPIC9K-BMP7为模板，利用简化的重叠PCR技术分别对人骨形成蛋白4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密码子进行定点突变。其中人骨形成蛋白4和7的成熟肽cDNA序列长度分别为348bp和417bp。改造后的人BMP-4成熟肽cDNA序列特征为第22-24位、第49-51位由CGG突变为AGA。人BMP-7成熟肽cDNA序列第66-68位、第400-402位的CGG突变为AGA，第142-144位的CGA突变为AGA。改造后的基因产物作为模板克隆到甲醇酵母表达质粒pPIC9K中。碱性溶菌小量制备法提取质粒DNA，内切酶SacI酶切线性化重组甲醇酵母表达载体，并采用电转化法转化到甲醇酵母GS115中。MD平板初筛His4+转化子，然后用不同浓度的G418筛选多拷贝转化子。利用人BMP-4和人BMP-7成熟肽cDNA序列的上下游引物进行PCR反应复筛多拷贝转化子，筛选能够获得正确扩增片段的真阳性转化子，并在MM和MD平板上培养鉴定多拷贝转化子的表型。挑取上述单菌落于BMGY和BMMY培养基中培养，22-30℃，250rpm摇床培养至OD600＝2-6，离心收集细胞，将细胞悬浮于BMMY培养液中，22-30℃振荡培养，每24小时加入100％甲醇诱导重组蛋白表达，直至甲醇终浓度达到0.5-1.2％。离心收集上清液。表达产物经SDS-PAGE及Western blot测定重组蛋白表达量，并验证目的蛋白。本发明提供甲醇酵母基因工程菌株GS115，利用简化的重叠PCR技术分别对人骨形成蛋白4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密码子进行定点突变及体外重组的方法，制备重组人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7异型二聚体，用于骨科及相关临床治疗。
基于上述叙述，本发明的显著优点是①首次构建了高效表达重组人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7异型二聚体的甲醇酵母基因工程菌株。
②自我设计引物，利用简化的重叠PCR技术对人BMP-4、BMP-7成熟肽cDNA序列进行了定点突变，将其中的哺乳动物细胞使用的精氨酸密码子全部改变为酵母偏爱的精氨酸密码子，使表达量提高了至少5倍，发酵液上清中重组蛋白含量可达到0.2mg/ml以上。
③构建的高效表达重组人骨形成蛋白的甲醇酵母基因工程菌株，可生产重组人骨形成蛋白用于临床骨缺损、骨折愈合、骨不连等方面的治疗。所表达的重组人BMP-4-BMP-7异型二聚体的生理效应可为同型二聚体的10-20倍，提高了促进骨质生长的作用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是对发明的限制。
图1是本发明的人BMP-4成熟肽序列及定点突变的位点示意图。
图2是本发明的人BMP-7成熟肽序列及定点突变的位点示意图。
图1中，人骨形成蛋白4的成熟肽序列长度为348bp，改造后的人BMP-4成熟肽序列特征为第22-24位、第49-51位由CGG突变为AGA。
图2中，人骨形成蛋白7的成熟肽序列长度为417bp，改造后的人BMP-7成熟肽序列第66-68位、第400-402位的CGG突变为AGA，第142-144位的CGA突变为AGA。
实施例11、人骨形成蛋白成熟肽cDNA序列的亚克隆根据已知的人BMP-4和人BMP-7的cDNA序列，设计并合成引物如下人BMP-4 cDNA序列5’端引物5’-AGCCCTAAGCATCACTCACAG-3’3’端引物5’-TCAGCGGCACCCACATC-3’人BMP-7 cDNA序列5’端引物5’-TCCACGGGGAGCAAACAG-3’3’端引物5’-CTAGTGGCAGCCACAGGC-3’分别以含人BMP-4和人BMP-7cDNA序列的质粒pBluescript KS BMP-4和pBluescript KS BMP-7为模板，PCR扩增得到348bp的人BMP-4的成熟肽cDNA序列和417bp的人BMP-7的成熟肽cDNA序列。PCR产物经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化后分别与经SnaBI内切酶消化的酵母表达质粒pPIC9K连接，转化到大肠杆菌Top10F’。酶切、PCR、测序分析筛选得到含正确的人BMP-4成熟肽cDNA序列的质粒pPIC9K-BMP4和含正确的人BMP-7成熟肽cDNA序列的质粒pPIC9K-BMP7。碱性溶菌小量制备法提取质粒DNA。
2、利用简化的重叠PCR技术进行定点突变，构建含突变后人BMP成熟肽cDNA序列的甲醇酵母表达载体①.人BMP-4成熟肽cDNA序列的定点突变首先设计人BMP-4成熟肽cDNA序列5’端引物，其中载体引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)位于质粒pPIC9K BamH1位点的上游，载体引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)位于质粒pPIC9K EcoIRI位点的下游。其余为突变位点引物，每对突变引物有部分序列重叠。
引物序列和退火温度以载体引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)扩增pPIC9K-BMP-4，PCR反应温度条件95℃4min；94℃1min，53℃2min，72℃90sec(30个循环)；72℃10min。扩增产物经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。
第一步以上述PCR产物为模板，分别用三对引物进行PCR扩增反应引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和突变位点1的反链引物(antisense mutagenicprimer)C(5’-GCTCTCTGTGAGTGATGC-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)和突变位点1正链引物(sense mutagenic primer)D(5’-CACAGAGAGCAGGAAG-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)与突变位点2正链引物F(5’-CAGACGCCACTCGT-3’)。得到三个PCR产物片断，分别用符号AC(AC为引物A与引物C扩增的产物)、BD(BD为引物B与引物D扩增的产物)和BF(BF为引物B与引物F扩增的产物)表示，经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。
第二步重叠PCR反应先使产物片断AC与BD退火，形成互补。反应温度条件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5个循环)。然后加入引物A和突变位点2的反链引物E(5’-GGCGTCTGCAGTTCTTAT-3’)，使终浓度达到20pM，继续进行PCR扩增。反应温度条件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25个循环)；72℃10min。扩增产物AE(AE为引物A与引物E扩增的产物)经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。产物AE含两个突变位点。
第三步重叠PCR反应使第二步的产物AE与第一步的产物BD退火，形成互补。反应温度条件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5个循环)。然后加入引物A和引物B，使终浓度达到20pM，继续进行PCR扩增。反应温度条件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25个循环)；72℃10min。扩增产物AB(AB为引物A与引物B扩增的产物)经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。终产物AB为含两个突变位点的人BMP-4成熟肽cDNA序列。
②.人BMP-7成熟肽cDNA序列的定点突变本发明为提高人BMP-7在酵母中的表达量，在分子水平上对人BMP-7成熟肽cDNA序列进行改造，第66-68位、第400-402位的CGG突变为AGA，第142-144位的CGA突变为AGA。
首先设计引物，其中载体引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)位于质粒pPIC9K BamH1位点的上游，载体引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)位于质粒pPIC9K EcoIRI位点的下游。其余为突变位点引物。
引物序列及退火温度以载体引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)扩增pPIC9K-BMP-7，反应温度条件95℃4min；94℃1min，53℃2min，72℃90sec(30个循环)；72℃10min。扩增产物经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。
第一步以上述PCR产物为模板，分别用四对引物进行PCR扩增反应引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和突变位点1的反链引物I(5’-TTGGCCATTCTCAGGG-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)和突变位点1的正链引物J(5’-GCCCTGAGAATGGCC-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)与突变位点2正链引物L(5’-CTTCAGAGACCT GGGCT-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’’)与突变位点3正链引物N(5’-GGTGGTCAGAGCCTGTG-3’)。得到的四个PCR产物片断，分别用符号AI(AI为引物A与引物I扩增的产物)、BJ(BJ为引物B与引物J扩增的产物)、BL(BL为引物B与引物L扩增的产物)和BN(BN为引物B与引物N扩增的产物)表示。经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。
第二步重叠PCR反应先使产物AI与BJ退火，形成互补。反应温度条件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5个循环)。然后加入引物A和突变位点2的反链引物K(5’-AGCCCAGGTCTCTGAAG-3’)，使终浓度达到20pM，继续进行PCR扩增。反应温度条件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25个循环)；72℃10min。扩增产物AK(AK为引物A与引物K扩增的产物)经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。产物AK含两个突变位点。
第三步重叠PCR反应使第二步的产物AK与第一步的产物BL退火，形成互补。反应温度条件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5个循环)。然后加入引物A和突变位点3的反链引物M(5’-CAGGCTCTGACCACCAT-3’)，使终浓度达到20pM，继续进行PCR扩增。反应温度条件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25个循环)；72℃10min。扩增产物AM经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。产物AM(AM为引物A与引物M扩增的产物)含三个突变位点。
第四步重叠PCR反应使第三步的产物AM与第一步的产物BN退火，形成互补。反应温度条件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5个循环)。然后加入引物A和引物B，使终浓度达到20pM，继续进行PCR扩增。反应温度条件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25个循环)；72℃10min。扩增产物AB经DNA胶回收试剂盒(Promega产品)进行纯化。终产物AB为含三个突变位点的人BMP-7成熟肽序列。
3、突变后的人BMPs成熟肽序列克隆到甲醇酵母表达载体中以EcoRI和BamHI过夜消化上述1和2中获得的已突变过的成熟肽cDNA片段以及质粒pPIC9K，用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小无误，将片段纯化回收，将线性质粒和已突变的成熟肽cDNA片段进行连接反应，形成带有突变位点的重组甲醇酵母表达载体，转化到大肠杆菌Top10F’，酶切、PCR、测序分析确定得到的重组表达载体中的人BMP-4成熟肽cDNA片段和人BMP-7成熟肽cDNA片段均含有特定的突变位点。碱性溶菌小量制备法提取质粒DNA。
4、构建及筛选重组人BMP甲醇酵母菌株SacI酶消化处理上述的重组甲醇酵母表达载体使其线性化，用1％琼脂糖凝胶电泳检测小部分消化片段，检验是否消化完全。用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提消化产物并用乙醇沉淀消化的DNA，将DNA溶解于TE中，-20℃保存备转化用。电转化法转化甲醇酵母菌株GS115(His4-)，MD平板初筛His4+转化子，再从中筛选多拷贝整合转化子105个His+细胞涂布于G418浓度分别为0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0mg/ml的YPD平板。在3.0mg/mlG418的平板上筛选到4个克隆，4.0mg/mlG418的平板上筛选到3个克隆。挑取4.0mg/mlG418耐受菌，纯化后用15％甘油冷冻保存。应用PCR方法简单直接的筛选甲醇酵母克隆，先取10μl酵母液于1.5ml离心管，加5μl的5U/μl溶菌酶，35℃孵育10min，-80℃冰冻样品10min，建立50μl的PCR体系，以模板即上述酵母液5μ1，10×buffer 5μl；25mM Mg2+，5μl；25mMdNTP，1μl；Taq DNA聚合酶2.5U；5’AOX1引物和3’AOX1引物(10mM)，各1μl；加水至50μl。1％琼脂糖凝胶电泳分析证明转化子基因组中整合有重组甲醇酵母表达质粒中的目的基因片段。将等量多拷贝转化子分别接种于MM和MD平板上，筛选表型是Mut+的转化子。
5、摇瓶中甲醇诱导重组甲醇酵母菌株挑取G418浓度为4.0mg/mlYDP板上的单克隆，接种于内含10mlBMGY培养液的50ml离心管中，28-30℃，250rpm摇床培养至OD600＝2-6(大约16小时)，4℃1500g离心9min，去上清，加入10mlBMMY培养液重悬后继续培养8小时，4℃1500g离心9min，去上清，再加入10mlBMMY培养液重悬后继续培养，每24小时加入100％甲醇诱导重组蛋白表达，直至甲醇终浓度达到0.5％。分别在诱导后0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和144小时取1ml表达上清液，分析其表达水平，确定最佳收获时间为96小时。取少量上清用15％SDS-PAGE电泳分析，同时用鼠抗人BMP-4抗体、鼠抗人BMP-7抗体以及羊抗鼠IgG-AP对上清液进行Western杂交。结果表明上清中表达蛋白为人BMP-4和人BMP-7。筛选所得的含突变基因的重组酵母菌株，其表达重组人BMP-4和人BMP-7比未突变基因的菌株分别提高了7倍和10倍，上清液中重组蛋白含量达到0.2mg/ml以上。
权利要求
1.一种高效表达重组人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于在甲醇酵母Pichia pastoris的基因组DNA中整合了人骨形成蛋白成熟肽序列，并能在胞外高效表达重组人骨形成蛋白。
2.根据权利要求1所述的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于表达的人骨形成蛋可以是人骨形成蛋白4、人骨形成蛋白7及人骨形成蛋白4和7异型二聚体。
3.根据权利要求1所述的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于甲醇酵母菌株为GS115/pPIC9K-BMP4，GS115/pPIC9K-BMP7和GS115/pPIC9K-BMP4-BMP7。
4.一种高效表达人骨形成蛋白基因工程甲醇酵母菌株的构建方法，其特征在于构建方法包括以下步骤(1)将已克隆到质粒pBluescript KS中的人骨形成蛋白基因亚克隆到表达载体中；(2)利用简化的重叠PCR方法对表达载体中的人骨形成蛋白成熟肽序列进行定点突变，以酵母偏爱的精氨酸密码子取代原来的精氨酸密码子，构建重组人骨形成蛋白表达载体；(3)重组人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的构建和筛选；(4)重组人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的培养及蛋白的诱导表达、产物验证。
5.根据权利要求4所述的高效表达人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的构建方法，其特征在于其中所说的酵母表达载体为甲醇酵母的分泌型表达载体pPIC9K。
6.根据权利要求4所述的高效表达人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的构建方法，其特征在于所述的经精氨酸密码子进行定点突变后，人骨形成蛋白4和7的突变株成熟肽序列长度分别为348bp和417bp。
7.根据权利要求6所述的高效表达人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的构建方法，其特征在于所述突变株重组序列特征为人骨形成蛋白4成熟肽序列第22-24位、第49-51位由CGG突变为AGA，人骨形成蛋白7成熟肽序列第66-68位、第400-402位的CGG突变为AGA，第142-144位的CGA突变为AGA。
8.根据权利要求4所述的一种高效表达人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的构建方法，其特征在于所说的重组人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的构建及筛选包括以下步骤(1)重组酵母表达载体用内切酶SacI进行酶切线生化；(2)重组酵母表达载体电转化法转化到甲醇酵母中；(3)MD平板初筛转化子，并用G418筛选多拷贝转化子；(4)PCR方法复筛多拷贝转化子；(5)MM和MD平板上鉴定多拷贝转化子的表型。
9.根据权利要求4所述的一种高效表达人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的构建方法，其特征在于其中所说的重组人骨形成蛋白甲醇酵母菌株为构瓶过夜培养，至OD600＝2-6，离心收集菌种，每天加入甲醇诱导蛋白，直至甲醇终浓度达到0.5％。表达产物经SDS-PAGE及Western blot测定蛋白表达量，并验证目的蛋白。
全文摘要
本发明涉及应用甲醇酵母高效表达人骨形成蛋白技术，尤其涉及根据酵母偏爱密码子对人骨形成蛋白成熟肽序列进行定点突变技术。其特征是用含人BMP4和7cDNA序列的质粒pBluescript KS－BMP4和pBluescript KS－BMP7为模板，PCR扩增得到人BMP4和7成熟肽cDNA序列。利用简化的重叠PCR技术分别对人BMP4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密码子进行定点突变。突变后的序列作为模板克隆到甲醇酵母表达质粒pPIC9K中并转化到甲醇酵母GS115内。通过筛选并获得阳性克隆。构建好的工程菌在BMGY和BMMY培养基中培养，经甲醇诱导后，高效表达重组人骨形成蛋白。本发明方法可高效表达分泌型重组人BMPs。通过定点突变，表达量提高了至少5倍，达到0.2mg/ml以上。重组人BMPs可用于骨科及相关临床治疗。
文档编号C12N15/81GK1513979SQ0313658
公开日2004年7月21日 申请日期2003年5月20日 优先权日2003年5月20日
发明者张彦定, 陈一平, 黄义德 申请人:福建师范大学