专利名称：光合细菌高效制备方法
技术领域：
本发明涉及一种光合细菌高效制备方法。
背景技术：
光合细菌是指一大类能将光能转化成生物代谢活动的原核微生物，是地球上最早的光合生物，能进行不放氧光合作用的一大类细菌的总称，英文名称为photosynthetic bacteria，简称PSB。光合细菌与其他光合生物构成了自然生态系统中的原始生产者，并在自然界的物质转化和能量循环中起到重要的作用。由于光合细菌对碳源的利用范围因种而异，因此光合细菌的分布极为广泛，分布在海洋、江河、湖泊、沼泽、池塘、活性污泥及水稻、水葫芦、小麦等根际土壤中。
近年来由于资源匮乏，环境污染，生态失衡等问题的困扰，使世界各国不少科学工作者将目光转向了一种新的微生物资源开发和运用。实际上早在上世纪60-70年代，在日本以北村博、小林正泰为首的一批科学家开始对光合细菌的应用开展了广泛的研究，并在环保、水产养殖运用上取得了丰硕的成果。由于其运用成果显著，引起了世界各国的普遍关注。在世界范围内掀起了一股研究、运用光合细菌的热潮，并水产养殖，生物菌肥，农业种植，食品保健等领域，在运用上取得了成功。在我国以上海交大、华东师大为开拓者的一大批科技工作者上世纪60-70年代开始了光合细菌的研究、运用，目前在水产养殖，生物菌肥，农业种植、生物环保等领域取得了成功。
据测定光会细菌是营养成份很丰富的菌类之一，蛋白质含量高达65％，其氨基酸组成接近轮虫和枝角类蛋白；光会细菌含有丰富的维生素，特别是动物幼体发育所必需的B族维生素，其B12、叶酸、生物素的含量相当高，是啤酒酵母和小球藻的20至60多倍，此外还含有多种微量元素、促生长因子、促免疫因子和辅酶Q等生理活性物质。因此可以说光会细菌是一种高营养成份并具有很强保健功能和环境改良的新型农用微生物。同时，由于其具有较强净化污水功能；还是十分难得的优良水质改良剂。
但总体上讲，光合细菌的工业化、规模化的光合细菌生产技术目前在国内外均不是非常的成熟。在法国和意大利，利用管型环状生物反应器进行中试生产；Shipman报导了光合细菌在卧式透明的聚氯乙烯培养罐中培养；Juttner报导了在管道系统中连续培养。在国内采用玻璃缸或塑料桶静置培养，也有用槽式装置作半开放或开放式培养，这些培养方式易造成杂菌污染，而且得菌率低，一般得菌率在一亿/ml左右。而且在光合细菌的培养基设计、培养池设计、产品的生产及发酵罐的设计等方面距大规模实际运用还有一段差距，原因在于生产成本较高、操作不方便和活菌数低。
发明内容
本发明的目的是提供一种光合细菌高效制备方法，建立一套完整、方便、灵活的规模化生产工艺，使光合细菌这一具有较大运用前景的产品得到广泛的运用。
具体内容一种光合细菌高效制备方法，光合细菌与菌种培养基按1∶30-50的容积比混合后置于光合细菌发酵罐中培养，培养基中除正常的成分外添加浓度为千分之0.05至1的寡聚糖，寡聚糖的作用为提高光合细菌的繁殖速度；发酵罐底部安装有发红光的水下灯，灯的开关采用时间控制集成块控制；塑料制品底部装有水下循环泵，供培养循环用；底部有两个外接开口，其一接外源供给的二氧化碳，其作用为一是为培养的光合细菌提供光合作用所需的二氧化碳，二是培养过程中培养基的混合；其二为培养基和菌种的接入口；发酵罐的下部装有电热恒温控制棒，该电热恒温控制棒有温度控制器，是控制温度的。光合细菌与培养基的混合液在发酵罐中厌氧发酵，发酵期间温度控制在25-34摄氏度，光照强度控制在1000-3000Lux，Ph控制在6.5-7.5；当发酵罐中的活菌浓度达到5-35×108时，将发酵罐中的发酵液体通过旋转式离心机离心浓缩，装入塑料容器或将浓缩液体通过载体吸附经低温干燥后真空包装成为可用于水产、种植、养殖、环保等领域的光合细菌制剂。光合细菌发酵罐可以并联的方式安排生产。以下是各种实验情况说明实验1培养基中添加寡聚糖寡聚糖，又称低聚糖，是由2～10个糖基通过糖苷键连接而成的具有直链或直链结构的低聚物的总称。寡糖种类很多，但目前常用作于饲料添加剂中，常用的类型主要包括异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、果寡三糖、果寡四糖、果寡五糖、半乳寡糖、甘露寡糖、大豆寡糖、龙胆寡糖、木糖寡糖等寡糖。这些寡糖可以选择地促进动物肠道中有益菌的增殖。这些有益菌利用寡糖发酵产生短链脂肪酸，降低肠道pH值，抑制病原菌在体内消耗养分，减少有毒和致病的代谢物产生，从而维护、增进动物健康。某些寡糖可以提高机体对药物和抗原的免疫应答能力，增进动物的免疫能力。而寡聚糖对光合细菌的增殖促进目前未见报导。
1.材料与方法1.1菌株 从水底污泥中分离的菌株YB279、WTB13、SCTB15、SYB106用于实验，经形态鉴定、对碳源利用、与氧关系，四个菌株分别属于红螺菌属的深红红螺菌(Rs.rubrum)、纤细红螺菌(Rs.tenue)、胶质红假单胞菌(Rp.gelatinosa)和沼泽红螺菌(R.plalustris)。
1.2培养基 3.5g磷酸二氢钾，4g磷酸氢二钾，2g乙酸钠，2g氢氧化钠，1g氯化铵，1.25g氯化镁，0.5g氯化钙溶于1000ml蒸馏水，再加入本产品生产中用的生长因子溶液和微量元素溶液各1ml及必须的碳源，搅拌均匀，测定pH于6.5至7.0之间。培养基在113℃，高压灭菌30min。在无菌条件下将过滤灭菌的碳酸氢钠和抗坏血酸添加到灭菌后的培养基中。
1.3寡聚糖添加 在上述培养基中添加不同浓度的寡聚糖，浓度为50mg、100mg、200mg、500mg。添加的种类有果寡五糖、甘露寡糖、大豆寡糖。添加方法是在超菌工作台上将75％乙醇浸泡处理15min.过的寡聚糖按不同的量添加培养基中。
1.4培养方法 在无菌条件下将菌种添加到5000ml三角瓶、100L光合细菌培养种子罐、2T生产罐中进行培养。每个处理重复三次，结果以三次的平均结果计。
1.5光合细菌的生长测定 采用红血球计数法直接计数。
2.结果添加寡聚糖可提高光合细菌的繁殖速度、缩短增殖时间将YB279按2％的比例添加到装有5000ml添加过寡聚糖的培养基，加入菌种后将三角瓶置于光照培养箱中培养。培养条件为温度30-34℃，光照强度为1500Lux，每天上午9点定时摇动培养瓶，使细菌的分布更加均匀。培养24小时后在无菌条件下取每个处理的培养物1ml用于测定细菌的数目。
表1.寡聚糖对光合细菌YB279生长的影响细菌数(个/ml×106)
从表中可以看出寡聚糖对光合细菌的生长、繁殖的影响，各种寡聚糖对光合细菌的影响结果基本类似。由于前2天一般是光合细菌培养的延迟期，因此对光合细菌的影响不大。而进入第三天，添加的寡聚糖则大大促进光合细菌的生长、繁殖，原因是此时光合细菌培养群体的繁殖已经进入了群体生长的对数期，在第五天，果寡五糖、甘露寡糖、大豆寡糖对光合细菌YB279繁殖数量的增殖均是对照的7倍左右。传统上采用静置培养法培养光合细菌使产物中的细菌数达到5×108一般需要10-14天，而添加寡聚糖后一般只需培养4-5就能达到该数量，较传统的培养方法缩短了1.5-2倍的培养时间了。而且在7天内可使培养物中的细菌数达到25-32×108，这个数量级的细菌总数以传统方法是很难达到的。
为确定寡聚糖对复合性菌种生长的影响，将四株光合细菌及其复合种按1％的比例添加到装有5000ml添加了100mg/L甘露寡糖的培养基，按上述的方法培养，结果发现不管是对单一光合细菌种还是复合光合细菌种，寡聚糖均有提高其繁殖倍数的作用，表2为培养培养6天时的测定结果。结果表明寡聚糖对复合种增殖的提高较单一种的提高大，但提高到一定的倍数时，这种增殖促进作用就会越来越来小，原因估计同培养基的消耗和群体种菌体总数较大有关。
从以上的实验可以看出寡聚糖对于单一种还是复合性菌种的繁殖来讲均具有促进作用。目前采用一般的静置培养法，光合细菌的最终繁殖数只能达到5-8×108，而添加寡聚糖后最终的繁殖数量可以达到25-32×108，较传统的培养法提高了5倍。同时也表明采用静置培养法要将光合细菌的培养产物中细菌数提高到50亿至上百亿是极为困难的，采用必要的浓缩手段是可起的。表2.寡聚糖(甘露寡糖)对光合细菌繁殖的影响(×106)
为表明放大后寡聚糖的增殖促进作用，采用复合种在我们的自己的光反应器中在120L和2T的规模下作了实验，结果表明大规模的培养中添加寡聚糖同样能提高增殖速度、缩短培养时间。
实验2发酵过程中直接加入二氧化碳的实验说明光合细菌特别是红螺菌科的大部分种均能利用低级脂肪酸、氨基酸和糖类为能量，固定二氧化碳并进行生长。因此培养基中二氧化碳的浓度是光合细菌生长中的一个限制因素，传统的培养中采用添加碳酸氢钠在酸性或微酸性的环境下释放的二氧化碳作为二氧化碳供给源，而采用气态二氧化碳直接提供二氧化碳源目前尚未见报导。
1.材料与方法1.1菌株 从水底污泥中分离的菌株YB279、WTB13、SCTB15、SYB106用于实验，经形态鉴定、对碳源利用、与氧关系，四个菌株分别属于红螺菌属的深红红螺菌(Rs.rubrum)、纤细红螺菌(Rs.tenue)、胶质红假单胞菌(Rp.gelatinosa)和沼泽红螺菌(R.plalustris)。
1.2培养基 3.5g磷酸二氢钾，4g磷酸氢二钾，2g乙酸钠，2g氢氧化钠，1g氯化铵，1.25g氯化镁，0.5g氯化钙溶于1000ml蒸馏水，再加入本产品生产中用的生长因子溶液和微量元素溶液各1ml及必须的碳源，搅拌均匀，测定pH于6.5至7.0之间。培养基在113℃，高压灭菌30min。在无菌条件下将过滤灭菌的抗坏血酸添加到灭菌后的培养基中，同时添加100mg/L的甘露寡糖。
1.3二氧化碳添加 在上述培养基中添加不同浓度的二氧化碳，添加方法是将市售的工业用二氧化碳经过空气过滤器后通入培养容器底部，添加量以在固定压力下添加的时间计。
1.4培养方法 在无菌条件下将菌种添加到5000ml三角瓶和100L光合细菌培养种子罐中进行培养。每个处理重复三次，结果以三次的平均结果计。
1.5光合细菌的生长测定 采用红血球计数法记菌数直接计数。
2.结果气态二氧化碳直接通入培养基中不影响光合细菌的生长、繁殖，在一定程度上还可提高光合细菌的繁殖速度、缩短增殖时间，而且培养基的成本可下降3-5％。
将YB279按2％的比例添加到装有5000ml培养基的三角瓶中后将三角瓶置于光照培养箱中培养。培养条件为温度30-34℃，光照强度为1500Lux，每天上午9点定时摇动培养瓶，使细菌的分布更加均匀。二氧化碳的通气时间分别为30sec.、1min.、1.5min.、3min.、5min.。培养6天后，采用血球计数板测定细菌的数目。表1为气态二氧化碳对光合细菌生长的影响，对照为添加碳酸氢钠的培养基。从表中可以看出以通气的方式添加二氧化碳，不仅可以降低生产成本，而且在一定程度上还可以适当促进光合细菌的繁殖，二氧化碳的最佳通气时间是每12小时通气180分钟。每生产1吨光合细菌的培养基成本为380-450元，因此通过通入二氧化碳，培养基的成本可降低2-3％。而且在添加碳酸氢钠的培养基中培养，如果采用硬水，生产结束后光合反应器的底部会有大量的沉淀，给下一次生产设备的清洗带来一定的困难。碳酸氢钠的添加一般是通过过滤灭菌后再添加到灭菌培养基中，实际操作中碳酸氢钠的过滤非常困难。如果考虑到碳酸氢钠的过滤灭菌，以通气添加二氧化碳降低的生产成本将在6-10％。
表1.气态二氧化碳对光合细菌生长的影响 细菌数(个/ml×106)
实验3内置式红色光源的利用实验说明光合细菌的繁殖同光照的强度有直接的关系，光照不足不仅会影响到光合细菌的生长、繁殖速度，而且会影响产品的色泽。光合细菌的生长速度过慢，还会造成杂菌的污染，最终导致培养的失败。光合细菌红螺菌科中的色素吸收的光谱波长为800-900nm，将培养罐中装有的内置光源通过过滤处理后可以得到一定波长的特定光，这种特定光对红螺菌科的大部分种的光合作用应有促进作用。目前未见有关将特定波长的光源利用于光合细菌培养的报导。
1.材料与方法1.1菌株 从水底污泥中分离的菌株YB279、WTB13、SCTB15、SYB106用于实验，经形态鉴定、对碳源利用、与氧关系，四个菌株分别属于红螺菌属的深红红螺菌(Rs.rubrum)、纤细红螺菌(Rs.tenue)、胶质红假单胞菌(Rp.gelatinosa)和沼泽红螺菌(R.plalustris)。
1.2培养基 3.5g磷酸二氢钾，4g磷酸氢二钾，2g乙酸钠，2g氢氧化钠，1g氯化铵，1.25g氯化镁，0.5g氯化钙溶于1000ml蒸馏水，再加入本产品生产中用的生长因子溶液和微量元素溶液各1ml及必须的碳源，搅拌均匀，测定pH于6.5至7.0之间。培养基在113℃，高压灭菌30min。在无菌条件下将过滤灭菌的抗坏血酸和碳酸氢钠添加到灭菌后的培养基中，同时添加100mg/L的甘露寡糖。
1.3特定波长光源的利用 通过将三角瓶瓶壁分别用黄、红、绿、兰染料涂抹放置在白炽灯光源下或采用装有黄、红、绿、兰滤色片的灯光照明。
1.4培养方法 在无菌条件下将菌种添加到5000ml三角瓶和100L光合细菌培养种子罐中进行培养。每个处理重复三次，结果以三次的平均结果计。
1.5光合细菌的生长测定 采用红血球计数法记菌数直接计数。
3.结果通过采用不同的内置性光源直接照射培养基，发现红光可以促进光合细菌的生长、繁殖。
表1.不同光源对光合细菌生长的影响 细菌数(个/ml×106)
将YB279按1％的比例添加到装有5000ml培养基的三角瓶中后将三角瓶置于光照培养箱中培养。培养条件为温度30-34℃，光照强度为1500Lux，每天上午9点定时摇动培养瓶，使细菌的分布更加均匀。三角瓶的瓶壁用黄、红、绿、兰染料涂抹，对照为未涂抹的透明三角瓶，培养6天后，采用血球计数板测定细菌的数目。结果从表中可以看出不同波长的光源对光合细菌的生长、繁殖有较大的影响，红光可以促进光合细菌的生长、繁殖，提高率为7-10％。而其他波长的光源在一定程度上反而会降低光合细菌的生长、繁殖，特别是兰光降低的程度最大，可达200％。
白天采用自然光，夜间采用红色内置光源在100L光合反应器中，重复以上的实验，结果同上面的基本相同。
实验4利用旋转式离心机浓缩发酵液的实验说明从实验1所介绍的情况可以看出目前采用一般的静置培养法，光合细菌的最终繁殖数只能达到5-8×108，而添加寡聚糖后最终的繁殖数量可以达到25-32×108，较传统的培养法提高了5倍。同时也表明采用静置培养法要将光合细菌的培养产物中细菌数提高到50亿至上百亿是极为困难的，采用必要的浓缩手段是可取的。选择式离心机是目前在发酵、制药、化工等领域采用的一种工业浓缩装置。目前上未见在光合细菌培养产物中的浓缩。本试验采用8000-15000转的旋转式离心机，可将光合细菌菌液浓缩2-50，使培养产品的细菌浓度达到50-1500×108，而且浓缩的菌液可直接作为浓缩型产品或添加少量的固化剂即产物固体产品。目前的浓缩大多采用有机物和无机物以沉淀的方式进行浓缩，这种方法第一会引起环境的二次污染，第二添加的物质不一定对光合细菌的保存及生长有利。
所以，本发明具有以下特点1.生产过程的可控程度高，便于工业化生产；2.添加寡聚糖提高了发酵的效率，可缩短发酵时间0.5-2倍，活菌数提高2-10倍；3.直接加入二氧化碳，降低了生产成本，方便了培养基的制备；4.内置式红光光源发酵罐的利用，提高了光的利用率；5.旋转式离心机的利用可以方便的浓缩发酵液，使一种生产工艺产生多种剂型的产品。
四
(无)五、具体实施方案一种光合细菌高效制备方法，光合细菌与培养基按1∶30-50的容积比混合后置于光合细菌发酵罐中培养，培养基中除正常的成分外添加浓度为千分之0.05至1的寡聚糖；发酵罐为容积大小在0.5-2立方米的硬质透光的塑料密闭制品，底部安装1-3个发红光的水下灯，每盏灯的功率为30-60瓦，灯的开关采用时间控制集成块控制；底部相应位置还装有一个功率为40-100瓦的水下循环泵；底部有两个外接开口，其一接外源供给的二氧化碳；其二为培养基和菌种的接入口。发酵罐的下部装有1-2个功率为30-100瓦的电热恒温控制棒。光合细菌与培养基的混合液在上述的发酵罐中养氧发酵72-144小时，发酵期间温度控制在25-34摄氏度，关照强度控制在1000-3000Lux，Ph控制在6.5-7.5。当发酵罐中的活菌浓度达到5-35×108时，将发酵罐中的发酵液体通过旋转式离心机离心浓缩装入塑料容器或将浓缩液体通过载体吸附经低温干燥后真空包装成为可用于水产、种植、养殖、环保等领域的光合细菌制剂。
光合细菌发酵罐可以并联的方式灵活安排生产。
权利要求
1.一种光合细菌高效制备方法，利用光合细菌发酵罐、培养基培养光合细菌，其特征在于光合细菌与菌种培养基按1∶30-50的容积比混合后置于光合细菌发酵罐中培养，培养基中除正常的成分外添加浓度为千分之0.05至1的寡聚糖；发酵罐底部安装有发红光的水下灯；底部有两个外接开口，其一接外源供给的二氧化碳，其二为培养基和菌种的接入口；下部装有电热恒温控制棒；光合细菌与培养基的混合液在发酵罐中厌氧发酵，发酵期间温度控制在25-34摄氏度，光照强度控制在1000-3000Lux，Ph控制在6.5-7.5；当发酵罐中的活菌浓度达到5-35×108时，将发酵罐中的发酵液体通过旋转式离心机离心浓缩。
全文摘要
本发明公开一种光合细菌高效制备方法，其生产过程的可控程度高，便于工业化生产；添加寡聚糖提高了发酵的效率，可缩短发酵时间0.5－2倍，活菌数提高2－10倍；直接加入二氧化碳，降低了生产成本，方便了培养基的制备；内置式红光光源发酵罐的利用，提高了光的利用率；旋转式离心机的利用可以方便的浓缩发酵液，使一种生产工艺产生多种剂型的产品。
文档编号C12N1/20GK1597925SQ0313585
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月16日 优先权日2003年9月16日
发明者张云峰 申请人:昆明汇佳生物工程有限公司