专利名称：一种具有产氢特性的光合细菌菌株的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种具有产氢特性的光合细菌菌株的培养方法，属于生物能源领域，具体涉及以环境中有机废弃物为营养物质，培养一种具有产氢行为的光合细菌菌株的方法。
背景技术：
目前世界上氢的年产量在3600万吨以上，主要来自化石燃料、生物质和水，主要是采用传统的物理化学方法如水电解、天然气催化重整和热裂解、煤炭气化、石油脑的部分氧化等制取氢气，传统的制氢方法实质上是以消耗大量化石能源为代价换取氢能，净增能值低，经济适用性不强，同时对环境产生污染。运用光电技术和电解技术结合的方法也可以制取氢气，用太阳能光伏电池或太阳能热收集器能产生较高的转化效率，但由于地球表面太阳能辐射率仅为1kW·m-2，因此需要建造巨大的面积以收集足够多的能量，这明显限制了其商业运用，同时这种方法的最不利条件是需要非常高的投资成本和高技术要求，从而在技术方面阻碍了其在欠发达国家和地区对太阳光的运用。而利用微生物法制取氢气具有许多优点使用丰富的可再生资源微生物和水为原料，直接或间接利用地球上最经济和最清洁的能源太阳光，能治理环境污染，保护环境，经济适用性强，生产安全，设备简单，操作方便，不需消耗大量的能量，成本低、投资省，光合产氢微生物种类繁多，利用前景广阔，易于普遍推广应用。因此利用微生物法制取氢气已成为可再生能源利用和开发领域的研究热点。
目前利用太阳能制氢的方法有太阳能热分解水制氢、太阳能发电电解水制氢、阳光催化光解水制氢、太阳能生物制氢等等，其中以太阳能生物制氢具有最广阔的前景。
在太阳能光生物制氢技术中光合细菌因能分解有机物质，转化和利用太阳光能为氢能而具有独特的优势，即在光能的驱动下以有机物为原料，分解有机物获得氢气，属于光能异养型。在微生物产氢系统中，光合细菌制氢被认为是最有前途的微生物产氢方法，这是由于(1)光合细菌制氢具有高的理论光氢转化量；(2)不产生O2，避免了O2造成的微生物失活问题；(3)光能利用中的光谱范围宽；(4)具有消耗废水处理过程中排放的有机底物的能力，实现了有机废物的综合利用和环境保护的目的，因此这对可再生能源的开发和可持续发展战略的实现将是很有前途的处理技术。国外文献报道光合细菌产氢速率一般为0.058016-17.696ml·h-1·l-1，这类光合细菌产氢效率仍然较低。
目前没有专门培养产氢光合细菌方法的文献报道，同时在光合细菌筛选方面更多的文献资料集中于光合细菌的增殖培养及富集培养，得到的是含有杂菌的光合细菌培养液，其筛选光合细菌的目的仅仅用于饲料或蛋白质的生产或污水处理，没有将有机废弃物处理与能源化紧密联系起来，部分资料报道对光合细菌的筛选是采用厌氧培养箱，但这种方法仅仅提供厌氧条件，而没有同时提供光能，因此不能保证获得的光合细菌具有较高的产氢能力。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有产氢特性的沼泽红假单胞菌菌株的培养方法。
本发明的目的之二是提供一种具有产氢特性的胶状红长命菌菌株的培养方法。
本发明的技术方案一是一种具有产氢特性的沼泽红假单胞菌菌株的培养方法，采用如下步骤(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集滤液或上清液；(2)沼泽红假单胞菌菌株的增殖培养取上述滤液或上清液放入无菌的培养瓶中，同时按与之1比7～7比7的比例加入新鲜灭菌的培养基到培养瓶中，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25℃～35℃，培养6天～12天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；(3)沼泽红假单胞菌菌株的富集培养取上述红色培养液的中下层液体加入灭菌的干净培养瓶中，按与之1比7～7比7的比例加入已灭菌的新鲜培养基，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯或发红光的LED灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25℃～35℃，再次光照静置转化培养3天～10天，进一步淘汰非光合细菌，增强光合细菌的生长和适应能力，再取中下层的红色培养液重复本步骤2次以上，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为杆形或椭圆形细菌为止；(4)沼泽红假单胞菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的光合细菌菌株的富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)沼泽红假单胞菌菌株的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的沼泽红假单胞菌菌株富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置5分钟~20分钟，倒入35℃～45℃的仅含琼脂且含量为1.5％-2.0％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于25℃～35℃，光照度为2000lx～7000lx的光照恒温培养箱中光照培养4天～10天；待长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一且颜色为紫红色，细胞形态分别为椭圆形者为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法进行培养基的制备和接种，重复进行3次以上的分离纯化，直到观察到生长的菌落形态一致，菌落颜色为紫红色且光学显微镜下观察到细胞形态分别为椭圆形即判定得到相应的纯菌种。
所述培养基的组成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生长因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
本发明的技术方案二是一种具有产氢特性的胶状红长命菌菌株的培养方法，采用如下步骤(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集滤液或上清液；(2)胶状红长命菌菌株的增殖培养取上述滤液或上清液放入无菌的培养瓶中，同时按与之1比7～7比7的比例加入新鲜灭菌的培养基到培养瓶中，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25～35℃，培养6～12天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；(3)胶状红长命菌菌株的富集培养取上述红色培养液的中下层液体加入灭菌的干净培养瓶中，按与之1比7～7比7的比例加入已灭菌的新鲜培养基，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯或红色的LED灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25℃～35℃，再次光照静置转化培养3天～10天，进一步淘汰非光合细菌，增强光合细菌的生长和适应能力，再取中下层的红色培养液重复本步骤2次以上，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为杆形或椭圆形细菌为止；(4)胶状红长命菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的光合细菌菌株的富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)胶状红长命菌菌株的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的胶状红长命菌菌株富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置5分钟-20分钟，倒入35℃～45℃的仅含琼脂且含量为1.5％-2.0％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于25℃～35℃，日光灯光照度为2000lx～7000lx的光照恒温培养箱中光照培养4天～10天；待长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一且颜色为橙黄色，细胞形态分别为短杆形者为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法进行培养基的制备和接种，重复进行3次以上的分离纯化，直到观察到生长的菌落形态一致，菌落颜色为橙黄色且光学显微镜下观察到细胞形态分别为短杆形即判定得到相应的纯菌种。
所述培养基的组成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生长因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
本发明所述技术方案得到的沼泽红假单胞菌和胶状红长命菌菌株具有如下特性(1)所述菌种无毒性，产氢能力高，能吸收和转化太阳光能，有效分解和利用各种有机物质；(2)本发明得到的菌种为兼性厌氧生活方式，但在好氧条件下不产生氢气，在厌氧光照条件下能分解各种有机物质产生氢气。
(3)本发明所述菌株对底物的利用类型广泛，能有效分解和利用葡萄糖、酒石酸钠、乙酸钠、丙酸钠等有机物质，表明该菌株利用和代谢这类有机物质的能力较强，其中特别嗜好利用葡萄糖和多种有机酸，这有利于在环境污染治理中的应用。
(4)由于本发明得到的菌株是以有机底物为碳源、同时提供氮源、无机盐及生长因子等而培养获得，除在产生氢能方面具有独特的优势外，同时能分解有机物，降低有机废水的COD值，该菌种对有机物质的分解和利用率最高可达到98％以上，因此本菌种在转化和利用有机底物方面具有很大的优势，同时本菌种特别适合分解和利用厌氧发酵后的有机废水，能进一步降低废液中的有机物含量，取得良好的净化性能，充分利用了生物质能，实现了化害为宝，保护环境的目的。因此在环境保护和实现资源的可持续利用方面具有广阔的应用前景和社会价值。
本发明所述的技术方案与现有技术相比，由于采用双层固体平板培养基能为沼泽红假单胞菌和胶状红长命菌的生长繁殖提供厌氧环境，同时由于固体培养基是透光的，能保证沼泽红假单胞菌和胶状红长命菌生长和产氢代谢过程中对光能的需求，保证了获得的沼泽红假单胞菌和胶状红长命菌菌种具有较高产氢能力，能吸收和转化太阳光能，有效分解和利用各种有机物质。
具体实施例方式
实施例1(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，静置5小时，收集上清液；显微镜下初步镜检微生物的种类和数量分布，发现有大量的其它杂菌，如念珠藻菌、绿藻等，光合细菌数量很少；(2)沼泽红假单胞菌菌株的增殖培养取上述上清液70ml倒入250ml的三角瓶中，同时加入30ml灭菌的新鲜培养基于瓶中，将上清液和新鲜培养基摇匀，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为3000勒克斯(lx)，培养温度为30℃，培养10天，培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长；(3)沼泽红假单胞菌菌株的富集培养取上述培养液的中下层液体40ml于灭菌的干净培养瓶中，再加入40ml的已灭菌的新鲜培养基，将培养液和新鲜培养基摇匀，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯为光源，光照度为3000勒克斯，培养温度为30℃，再次光照静置转化培养，培养1天后观察到培养瓶中溶液变浑浊，培养3天后显微镜观察到活菌碱性美蓝染色后，进行显微镜镜检，发现念珠藻菌株消失，含大量的长杆形非运动性细菌(革兰氏染色不明显)和部分长丝状的多细胞连接的细菌(革兰氏染色阳性)，观察到少量的运动性、细胞呈椭园形的细菌，还含有部分球形、细胞形态很小的细菌(革兰氏染色为阴性)，还具有少量的能快速弯曲变形运动的细菌；在第7天后观察到大量的具有运动性、细胞呈椭圆形，革兰氏染色为阴性的细菌出现，其它菌的数量明显减少。再取中下层的红色培养液重复本步骤3次，光学显微镜下观察到大量的优势菌种为短杆形或红色椭圆形细菌；(4)沼泽红假单胞菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)沼泽红假单胞菌菌株的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置15分钟，倒入40℃左右的仅含琼脂且含量为1.8％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于30℃，光照度为5000lx的光照恒温培养箱中光照培养8天；长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一而大、菌落颜色为红色者为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法重复进行4次分离纯化后，生长的菌落形态一致，菌落颜色为紫红色，光学显微镜下观察到细胞形态均为椭圆形，即判定得到纯菌种；该菌种菌落表面湿润，极易挑取，细胞易分散，且革兰氏染色为阴性，细胞运动性强，电镜下可见细胞表面分泌有大量的粘液；鞭毛多而长，周生，直径为100-200μm，长约4.0μm左右，宽约2.5μm左右；该菌种经生理生化分析和16SrRNA比对，鉴定该菌种属于红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，并命名为Rhodopseudomonas palustris CQK 01。
其中，培养基的组成如下K2HPO4·3H2O1.2g/l；MgSO4·7H2O0.5g/l；KH2PO40.6g/l；FeSO4·7H2O0.05g/l；C6H12O6·H2O6.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0005g/l；NaCl1.5g/l；CaCl20.015g/l；NH4Cl1.5g/l；生长因子溶液浓度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.002g/l；实施例2(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，静置5小时，收集上清液；显微镜下初步镜检微生物的种类和数量分布，发现有大量的其它杂菌，如念珠藻菌、绿藻等，光合细菌数量很少；(2)沼泽红假单胞菌菌株的增殖培养取上述上清液70ml倒入250ml的三角瓶中，同时加入60ml灭菌的新鲜培养基于瓶中，将上清液和新鲜培养基摇匀，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为5000勒克斯(lx)，培养温度为35℃，培养10天，培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长；(3)沼泽红假单胞菌菌株的富集培养取上述培养液的中下层液体50ml于灭菌的干净培养瓶中，再加入30ml的已灭菌的新鲜培养基，将培养液和新鲜培养基摇匀，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以发红光的LED灯为光源，光照度为5000勒克斯，培养温度为30℃，再次光照静置转化培养，培养1天后观察到培养瓶中溶液变浑浊，培养3天后显微镜观察到活菌碱性美蓝染色后，进行显微镜镜检，发现念珠藻菌株消失，含大量的长杆形非运动性细菌(革兰氏染色不明显)和部分长丝状的多细胞连接的细菌(革兰氏染色阳性)，观察到少量的运动性、细胞呈椭园形的细菌，还含有部分球形、细胞形态很小的细菌(革兰氏染色为阴性)，还具有少量的能快速弯曲变形运动的细菌；在第7天后观察到大量的具有运动性、细胞呈椭圆形，革兰氏染色为阴性的细菌出现，其它菌的数量明显减少。再取中下层的红色培养液重复本步骤4次，光学显微镜下观察到大量的优势菌种为短杆形或红色椭圆形细菌；(4)沼泽红假单胞菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)沼泽红假单胞菌菌株的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置15分钟，倒入40℃左右的仅含琼脂且含量为1.5％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于30℃，光照度为3000lx的光照恒温培养箱中光照培养10天；长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一而大、菌落颜色为红色者为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法重复进行4次分离纯化后，生长的菌落形态一致，菌落颜色为紫红色，光学显微镜下观察到细胞形态均为椭圆形，即判定得到纯菌种；其中，培养基的组成如下K2HPO4·3H2O0.8g/l；MgSO4·7H2O0.1g/l；KH2PO40.3g/l；FeSO4·7H2O0.02g/l；C6H12O6·H2O3.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0002g/l；NaCl1.8g/l；CaCl20.025g/l；NH4Cl2.3g/l；生长因子溶液浓度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0002g/l；按照实施例1和实施例2得到的光合细菌菌株已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏号CGMCC No.1947；具体内容为沼泽红假单胞菌CQK 01，Rhodoseudomonas palustris CQK 01，CGMCC No.1947。
实施例3(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，静置5小时，收集上清液；(2)胶状红长命菌菌株的增殖培养取上述滤液70ml倒入250ml的三角瓶中，同时加入30ml灭菌的新鲜培养基于瓶中，将滤液和新鲜培养基摇匀，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为3000勒克斯(lx)，培养温度为30℃，培养10天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；(3)胶状红长命菌菌株的富集培养取上述培养液的中下层液体40ml于灭菌的干净培养瓶中，再加入40ml的已灭菌的新鲜培养基，将培养液和新鲜培养基摇匀，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯为光源，光照度为3000勒克斯(lx)，培养温度为30℃，再次光照静置转化培养，培养1天后观察到培养瓶中溶液变浑浊，培养3天后显微镜观察到活菌碱性美蓝染色后，进行显微镜镜检，发现念珠藻菌株消失，含大量的长杆形非运动性细菌(革兰氏染色不明显)和部分长丝状的多细胞连接的细菌(革兰氏染色阳性)，观察到少量的运动性、细胞呈短杆形的细菌，还含有部分球形、细胞形态很小的细菌(革兰氏染色为阴性)，还具有少量的能快速弯曲变形运动的细菌；在第5天后观察到大量的具有运动性、细胞呈短杆形，革兰氏染色为阴性的细菌出现，其它菌的数量明显减少。再取中下层的红色培养液重复本步骤3次，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为短杆形或红色椭圆形细菌；(4)胶状红长命菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)胶状红长命菌的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的短杆形细菌富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置15分钟，倒入40℃左右的仅含琼脂且含量为1.8％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于30℃，光照度为5000lx的光照恒温培养箱中光照培养8天；长出菌落后，挑选菌落生长快，橙黄色菌落为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法进行培养基的制备和接种，重复进行4次分离纯化后，观察到生长的菌落形态一致，菌落颜色为橙黄色，且光学显微镜下观察到细胞形态均为长杆形，即判定得到纯菌种；该菌种菌落表面湿润，极易挑取，细胞不易分散，革兰氏染色为阴性，细胞运动性强，可见以二等分裂方式繁殖，分裂后的许多细胞连接成长杆形；电镜下可见细胞表面分泌有大量的粘液；鞭毛少而长，极生，长约2.1-1.2μm左右，宽约0.5-0.9μm左右；该菌种经生理生化分析和16SrRNA比对，鉴定该菌种属于红螺菌目、红螺菌科、长命菌属、胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)，并命名为Rubrivivax gelatinosus CJK 02。
其中，培养基的组成如下K2HPO4·3H2O1.2g/l；MgSO4·7H2O0.5g/l；KH2PO40.6g/l；FeSO4·7H2O0.05g/l；C6H12O6·H2O6.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0005g/l；NaCl1.5g/l；CaCl20.015g/l；NH4Cl1.5g/l；生长因子溶液浓度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.002g/l；实施例4(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，静置5小时，收集上清液；(2)胶状红长命菌菌株的增殖培养取上述滤液70ml倒入250ml的三角瓶中，同时加入60ml灭菌的新鲜培养基于瓶中，将滤液和新鲜培养基摇匀，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为5000勒克斯(lx)，培养温度为35℃，培养10天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；
(3)胶状红长命菌菌株的富集培养取上述培养液的中下层液体50ml于灭菌的干净培养瓶中，再加入30ml的已灭菌的新鲜培养基，将培养液和新鲜培养基摇匀，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯为光源，光照度为5000勒克斯(lx)，培养温度为30℃，再次光照静置转化培养，培养1天后观察到培养瓶中溶液变浑浊，培养3天后显微镜观察到活菌碱性美蓝染色后，进行显微镜镜检，发现念珠藻菌株消失，含大量的长杆形非运动性细菌(革兰氏染色不明显)和部分长丝状的多细胞连接的细菌(革兰氏染色阳性)，观察到少量的运动性、细胞呈短杆形的细菌，还含有部分球形、细胞形态很小的细菌(革兰氏染色为阴性)，还具有少量的能快速弯曲变形运动的细菌；在第5天后观察到大量的具有运动性、细胞呈短杆形，革兰氏染色为阴性的细菌出现，其它菌的数量明显减少。再取中下层的红色培养液重复本步骤4次，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为短杆形或红色椭圆形细菌；(4)胶状红长命菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)胶状红长命菌的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的短杆形细菌富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置15分钟，倒入40℃左右的仅含琼脂且含量为1.5％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于30℃，光照度为3000lx的光照恒温培养箱中光照培养10天；长出菌落后，挑选菌落生长快，橙黄色菌落为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法进行培养基的制备和接种，重复进行4次分离纯化后，观察到生长的菌落形态一致，菌落颜色为橙黄色，且光学显微镜下观察到细胞形态均为长杆形，即判定得到纯菌种；其中，培养基的组成如下K2HPO4·3H2O0.8g/l；MgSO4·7H2O0.1g/l；KH2PO40.3g/l；FeSO4·7H2O0.02g/l；C6H12O6·H2O3.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0002g/l；NaCl1.8g/l；CaCl20.025g/l；NH4Cl2.3g/l；生长因子溶液浓度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0002g/l；按照实施例3和实施例4得到的光合细菌菌株已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏号CGMCC No.1948；具体内容为胶状红长命菌CJK 02，Rubrivivax gelatinosus CJK 02，CGMCC No.1948。
实施例5将实施例1或实施例2得到的沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustris CQK 01株进行产氢试验，具体实验方法为将沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris CQK 01株制作菌悬液，将菌悬液按10％的比例加入长方体型的透明材质制成的生物反应器中的培养基中，反应器体积为500ml，反应液体积为300ml，上部空间体积为200ml，充入氩气获得厌氧环境，以发红光的LED灯为光源，光照度为3000lx，温度为30℃，静置恒温培养，采用的培养基组合物成分如下培养基成分及含量葡萄糖19.8g/l；NH4Cl1.99g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.38g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0834g/l；ZnSO4·7H2O0.0005g/l；MgSO4·7H2O0.05g/l；CuSO40.03g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.00075g/l；生长因子溶液2ml g/l；VB20.00002g/l；烟酸0.000015g/l；牛肉膏3g/l；水1000ml；pH值6.2将接种后的培养液按上述条件连续培养5天，期间定时检测产氢状况，发现在接种培养后第12h光合细菌开始产氢，产氢速率为0.5376ml·h-1·l-1，此时生物量(干重)为0.037g·l-1，当培养至第23h时，产氢速率达最大，为14.0672ml·h-1·l-1，此时生物量为0.28g·l-1。此后至第64h产氢速率基本维持在10.976-14.224ml·h-1·l-1之间，之后产氢速率逐渐下降，当培养至第120h，产氢仍继续为0.645ml·h-1·l-1，生物量略减少为0.12g·l-1。
实施例6将实施例3或实施例4得到的该菌株是胶状红长命菌(Rubrivivaxgelatinosus)CJK 02株，进行产氢试验，具体实验方法为
将胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)CJK 02株制作菌悬液，将菌悬液按10％的比例加入长方体型的透明材质制成的生物反应器中的培养基中，反应器体积为500ml，反应液体积为300ml，上部空间体积为200ml，充入氩气获得厌氧环境，以日光灯为光源，光照度为3000lx，温度为30℃，静置恒温培养，采用的培养基组合物成分如下葡萄糖19.8g/l；；NaCl1.5g/l；NH4Cl1.99g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.3g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0834g/l；ZnSO4·7H2O0.0005g/l；MgSO4·7H2O0.005g/l；CuSO40.03g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.00075g/l；VB20.00002g/l；烟酸0.000015g/l；牛肉膏2.5g/l；水1000ml；pH值6.5将接种后的培养液按上述条件连续培养5天，期间定时检测产氢状况，发现在接种培养后第12h光合细菌开始产氢，产氢速率为0.0103mg·h-1·l-1，此时生物量(干重)为0.083g·l-1，当培养至第28h时，产氢速率达最大，为1.35mg·h-1·l-1，此时生物量为0.49g·l-1。此后至第72h产氢速率基本维持在0.98-1.07mg·h-1·l-1之间，之后产氢速率逐渐下降，当培养至第120h，产氢仍继续为0.025mg·h-1·l-1，生物量略减少为0.37g·l-1。
通过实施例5和实施例6可以看出，用本发明技术方案培养获得的光合细菌菌种与国内外同类光合细菌菌种比较，产氢能力处于前列。
权利要求
1.一种具有产氢特性的沼泽红假单胞菌菌株的培养方法，其特征在于采用如下步骤(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集滤液或上清液；(2)沼泽红假单胞菌菌株的增殖培养取上述滤液或上清液放入无菌的培养瓶中，同时按与之1比7～7比7的比例加入新鲜灭菌的培养基到培养瓶中，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25～35℃，培养6～12天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；(3)沼泽红假单胞菌菌株的富集培养取上述红色培养液的中下层液体加入灭菌的干净培养瓶中，按与之1比7～7比7比例加入已灭菌的新鲜培养基，充入氩气获得厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯或发红光的LED灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25～35℃，再次光照静置转化培养3～10天，进一步淘汰非光合细菌，增强光合细菌的生长和适应能力，再取中下层的红色培养液重复本步骤2次以上，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为杆形或椭圆形细菌为止；(4)沼泽红假单胞菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的沼泽红假单胞菌富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)沼泽红假单胞菌菌株的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的沼泽红假单胞菌菌株富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置5-20分钟，倒入40～45℃的仅含琼脂且含量为1.5％-2.0％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于25℃～35℃，光照度为2000lx～7000lx的光照恒温培养箱中光照培养4～10天；待长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一，且菌落颜色为红色，细胞形态为椭圆形者为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法进行培养基的制备和接种，重复进行3次以上的分离纯化，直到观察到生长的菌落形态一致，菌落颜色为紫红色且光学显微镜下观察到细胞形态分别为椭圆形即判定得到相应的纯菌种。
2.根据权利要求1所述的具有产氢特性的沼泽红假单胞菌菌株的培养方法，所述培养基的组成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生长因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
3.一种具有产氢特性的胶状红长命菌菌株的培养方法，其特征在于采用如下步骤(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集滤液或上清液；(2)胶状红长命菌菌株的增殖培养取上述滤液或上清液放入无菌的培养瓶中，同时按与之1比7～7比7的比例加入新鲜灭菌的培养基到培养瓶中，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯或发红光的LED灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25～35℃，培养6～12天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；(3)胶状红长命菌菌株的富集培养取上述红色培养液的中下层液体加入灭菌的干净培养瓶中，按与之1比7～7比7比例加入已灭菌的新鲜培养基，充入氩气创造厌氧环境，将培养瓶置于恒温培养箱中，以日光灯或红色的LED灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培养温度为25～35℃，再次光照静置转化培养3～10天，进一步淘汰非光合细菌，增强光合细菌的生长和适应能力，再取中下层的红色培养液重复本步骤2次以上，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为杆形或椭圆形细菌为止；(4)胶状红长命菌菌株富集培养液的梯度稀释液的制备取步骤(3)得到的胶状红长命菌富集培养液用灭菌的蒸馏水按10-1-10-9级数进行稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、……10-10的梯度稀释液；(5)胶状红长命菌菌株的分离纯化采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境；首先在无菌的培养皿中制作下层基础营养固体平板培养基，待下层基础营养固体平板培养基冷却后分别在各固体平板培养基上接种步骤(4)得到的胶状红长命菌菌株富集培养液的10-3-10-10梯度稀释液，将固体平板培养基表面放置5-20分钟，倒入40～45℃的仅含琼脂且含量为1.5％-2.0％的上层覆盖液，盖上培养皿皿盖，放置冷却至上层琼脂覆盖液完全凝固，再将培养皿置于25℃～35℃，日光灯光照度为2000lx～7000lx的光照恒温培养箱中光照培养4～10天；待长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一，且菌落颜色为橙黄色，细胞形态为短杆形者为目的菌种；(6)挑取步骤(5)得到的目的菌种，按步骤(4)的方法进行稀释，再按步骤(5)的方法进行培养基的制备和接种，重复进行3次以上的分离纯化，直到观察到生长的菌落形态一致，菌落颜色为橙黄色且光学显微镜下观察到细胞形态为短杆形即判定得到相应的纯菌种。
4.根据权利要求3所述的具有产氢特性的胶状红长命菌菌株的培养方法，所述培养基的组成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生长因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
全文摘要
一种具有产氢特性的沼泽红假单胞菌菌株的培养方法，其特征在于采用如下步骤(1)采集菌源采集农田、污水沟等的上表层淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集滤液或上清液；(2)沼泽红假单胞菌菌株的增殖培养取上述滤液或上清液放入无菌的培养瓶中，同时按与之1比7～7比7的比例加入新鲜灭菌的培养基到培养瓶中，并充入氩气排除空气，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，光照度为2000勒克斯～5000勒克斯，培养温度为25℃～35℃，培养6～12天，直到培养液颜色逐渐变紫红，在培养瓶壁上有红色菌吸附生长时止；(3)沼泽红假单胞菌菌株的富集培养取上述红色培养液的中下层液体加入灭菌的干净培养瓶中。
文档编号C12R1/38GK101063098SQ20071007840
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者廖强, 王永忠, 朱恂, 田鑫, 石泳, 丁玉栋 申请人:重庆大学