专利名称：一种高效产氢光合细菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产氢光合细菌菌株，属于生物能源领域，主要通过从自然环境中进行筛选的方法得到一株以环境中有机废弃物为营养物质、能将太阳光能转换为清洁能源一氢能的光合细菌菌株，达到保护环境，实现资源的可持续利用的目的。
背景技术：
氢是自然界存在最普遍的元素，据估计它构成了宇宙质量的75％，氢能具有许多优点首先氢气燃烧发热值高。除核燃料外氢的发热值是所有化石燃料、化工燃料和生物燃料中最高的，为142,351kJ/kg，是汽油发热值的3倍。其次氢燃烧性能好，点燃快，与空气混合时有广泛的可燃范围，而且燃点高，燃烧速度快。此外氢本身无毒，与其他燃料相比氢燃烧时最清洁，除生成水和少量氮化氢外不会产生诸如一氧化碳、二氧化碳、碳氢化合物、铅化物和粉尘颗粒等对环境有害的污染物质，而且燃烧生成的水还可继续制氢，反复循环使用。同时氢能利用形式多，既可以通过燃烧产生热能，在热力发动机中产生机械功，又可以作为能源材料用于燃料电池，或转换成固态氢用作结构材料。用氢代替煤和石油，不需对现有的技术装备作重大的改造。由以上特点可以看出氢是一种理想的新的含能体能源。
西方国家特别是美国特别重视氢能的开发和利用。美国于2001年5月17日出台的《国家能源政策》，大胆提出了发展氢能、在未来彻底摆脱对进口能源依赖的构想。随后，美能源部便开始着手对这一构想进行可行性和实施政策的研究。作为第一步，同年11月能源部召开了“国家氢能发展展望”研讨会，并形成了题为《美国向氢经济过渡的2030年远景展望》的报告。2002年4月，能源部又组织召开了有220多位各界人士参加的“国家氢能发展蓝图”研讨会，并在此基础上于11月出台了题为《国家氢能发展路线图的》报告。2003年1月28日布什总统国情咨文讲话中正式提出实施《国家氢燃料研究计划》，为发展氢经济提供技术支撑。2004年2月，美国能源部出台了《氢能技术研究、开发与示范行动计划》，并将生物制氢技术作为该计划的重要研发部分。该计划的出台是美国推动氢经济发展的又一重大举措，标志着美国发展氢经济已从政策评估、制定阶段进入到了系统化实施阶段。
目前世界上氢的年产量在3600万吨以上，主要来自化石燃料、生物质和水，主要是采用传统的物理化学方法如水电解、天然气催化重整和热裂解、煤炭气化、石油脑的部分氧化等制取氢气，传统的制氢方法实质上是以消耗大量化石能源为代价换取氢能，净增能值低，经济适用性不强，同时对环境产生污染。运用光电技术和电解技术结合的方法也可以制取氢气，用太阳能光伏电池或太阳能热收集器能产生较高的转化效率，但由于地球表面太阳能辐射率仅为1kW·m-2，因此需要建造巨大的面积以收集足够多的能量，这明显限制了其商业运用；同时这种方法的最重要的不利条件是需要非常高的投资成本和高技术要求，从而在技术方面阻碍了其在欠发达国家和地区对太阳光的运用。而利用微生物法制取氢气具有许多优点使用丰富的可再生资源—生物质和水为原料，直接或间接利用地球上最经济和最清洁的能源—太阳光，能治理环境污染，保护环境，经济适用性强，生产安全，设备简单，操作方便，不需消耗大量的能量，成本低、投资省，光合产氢微生物种类繁多，利用前景广阔，易于普遍推广应用。因此利用微生物法制取氢气已成为可再生能源利用和开发领域的研究热点。
目前利用太阳能制氢的方法有太阳能热分解水制氢、太阳能发电电解水制氢、阳光催化光解水制氢、太阳能生物制氢等等。其中以太阳能生物制氢展示了最广阔的前景。
在太阳能光生物制氢技术中光合细菌因能分解有机物质，转化和利用太阳光能为氢能而具有独特的优势，即在光能的驱动下以有机物为原料，分解有机物获得氢气，属于光能异养型。在微生物产氢系统中，光合细菌制氢被认为是最有前途的微生物产氢方法，这是由于(1)光合细菌制氢具有高的理论光氢转化量；(2)不产生O2，避免了O2造成的微生物失活问题；(3)光能利用中的光谱范围宽；(4)具有消耗废水处理过程中排放的有机底物的能力。实现了有机废物的综合利用和环境保护的目的，因此这对可再生能源的开发和可持续发展战略的实现将是很有前途的处理技术。国外文献报道光合细菌产氢速率一般为0.00518-1.58mg·h-1·l-1，这类光合细菌产氢效率仍然较低。
发明内容
本发明的目的是从自然环境中筛选获得一种具有高效产氢特性和降解有机废弃物能力的光合细菌菌株。
本发明所述光合细菌菌株是指沼泽红假单胞菌株，该菌株已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏号CGMCC No.1947；具体内容为沼泽红假单胞菌CQK 01，Rhodoseudomonas palustris CQK 01，CGMCC No.1947。
本发明技术方案是采集自然环境中的淤泥，对菌源进行富集增殖培养，获得大量光合细菌菌种，对培养液进行反复筛选和分离纯化，获得一株无毒性，产氢能力高，能吸收和转化太阳光能，有效分解和利用各种有机物质的光合细菌菌株，对该菌种进行生理生化特性分析和16S rDNA序列分析并与NCBI的BLASTn比对分析，按照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)关于光合细菌分类的方法进行生理和形态特征鉴定，判定该菌种属于红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属，种名为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)CQK 01株。
光合细菌Rhodopseudomonas palustris CQK 01的生物学特性(1)本产氢光合细菌菌种的形态特征本产氢光合细菌菌种在形态上该菌株为椭圆形，细胞形态较大，长约4.0μm左右，宽约2.5μm左右，革兰氏染色为阴性，鞭毛多而长，周生，细胞运动性强，电镜下可见细胞表面分泌有大量的粘液；菌落形态小而薄，直径为100-200μm，紫红色，表面湿润，极易挑取，细胞易分散；光学显微镜下可见以二等分裂方式或出芽生殖方式繁殖。
(2)本产氢光合细菌菌种的营养及类型本产氢光合细菌菌种为兼性厌氧生活方式，但在好氧条件下不产生氢气，在厌氧光照条件下能分解各种有机物质产生氢气。
在固体平板培养基表面，接种该菌种后，在厌氧条件下其生长较缓慢，在初期为无色的小菌落，在后期菌落形态变化不大，但色泽逐渐转化为紫红色，菌落易于挑取，尽管细胞产生粘液，但菌种细胞容易被分散成菌悬液。同时该菌种在好氧条件下也能够生长，表明该光合细菌属于兼性厌氧。该菌种在液体培养基中生长较固体培养基上生长快。
该菌株对底物的利用类型广泛，能有效分解和利用葡萄糖、酒石酸钠、乙酸钠、丙酸钠等有机物质，表明该菌株利用和代谢这类有机物质的能力较强，其中特别嗜好利用葡萄糖和多种有机酸，这有利于在环境污染治理中的应用。
该菌种在液体培养基中能利用亚硫酸盐和硫代硫酸盐作电子供体而进行缓慢生长，但不能利用硫化物作电子供体。
该菌种能利用多种氮源进行生长，但不能代谢利用硝酸盐的无机金属盐进行生长，其中尿素和铵盐是最适氮源类型。
(3)Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢过程中所需要的培养条件①本菌种产氢过程中对有机底物的要求研究表明该菌种能利用有机底物的浓度范围为1.98-35.64g/l(以葡萄糖为例)，其中适宜底物浓度范围为11.880-27.72g/l。在特定培养条件下Zn2+、Fe2+对Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢行为有较大影响，本菌种代谢中对Fe2+需求量大，当Fe2+达150μmol/l时产氢量最高。对Zn2+需求量较小，当Zn2+为0.031μmol/l时，产氢量最高，较高的Zn2+浓度明显抑制该菌种的产氢代谢。
②温度对Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢代谢的影响温度主要是影响光合细菌产氢代谢中酶催化活性。在特定培养条件下温度对Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢性能的影响为温度为25℃时，本菌种产氢能力最佳，达53.75mlH2/(100ml culture medium)，温度低于或高于25℃时，光合细菌产氢量皆呈下降趋势，但实际应用中还需考虑菌种产氢代谢速率。研究表明本菌种的生长温度范围为10-43℃，产氢适宜温度范围为20-35℃。
③培养基初始pH值对Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢影响由生化反应动力学可知光合细菌产氢代谢中酶活性受pH影响较大。在特定培养条件下，当初始pH为7、8、9时，Rhodopseudomonas palustrisCQK 01的产氢能力较强，特别是pH值略偏碱性为8时，光合细菌的产氢能力达到最大，为33.47mlH2/(100ml culture medium)。因此本菌种能生长的pH范围为4-9.5，其中有利于Rhodopseudomonas palustris CQK01产氢和生长的适宜pH范围为6.0-8.5。
同时研究发现本菌种产氢代谢的发酵液pH值基本维持在5.0-6.2之间，总体上随初始pH值的增加而呈增加的趋势。当培养液pH值酸性较强时，菌种可通过物质代谢途径或方向的变化，自动调节溶液的pH值，但这种调节能力很有限，因为在实验中发现当pH过于偏酸，培养液中出现大量的死菌，当pH值为9时，菌种生长较快，但随后培养液中很快出现大量死菌，极大地影响本菌种的产氢能力。
④光照强度对Rhodopseudomonas palustris CQK 01生长和产氢性能的影响Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢代谢中需要光能作为驱动力。研究表明本菌种生长和产氢过程中所需的光照强度为0-9000lx，其中适宜的光照强度为2000-5000lx。特定条件下光照强度对本菌种产氢行为的影响表现为该菌种在黑暗厌氧条件下基本不生长或生长缓慢，当光照度为4000lx时，获得的产氢量达到最大，为49.57mlH2/(100ml culturemedium)，为最佳的光照度，当光照度低于或高于4000lx时，都将限制或抑制光合细菌生理活动向合成氢气的方向进行。
同时本发明人利用液体培养基检测其产氢能力，发现在独特的培养基配方中该菌种才具有较高的产氢能力和生长能力。
(4)Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢过程中的培养基该菌种产氢所用的培养基设有严格限制，它可以采用现有技术中一般的组合培养基，但不能得到该菌种最佳的产氢能力，本发明人通过研究后发现，根据该光合细菌生长所需要的特殊的营养及保证最有利的产氢条件，应适当添加一定比例的微量元素(如锌、钼等)和生长因子。因为元素(铁、钙和镁等)对Rhodopseudomonas palustris CQK 01产氢具有较大的促进作用，同时适量的钙盐可在一定程度上提高本菌种的生长能力和维持细胞活性存在，但这类无机盐浓度必须遵循本培养基配方严格的限制，否则将影响产氢光合细菌的生长和产氢能力。另外，由于该菌种缺乏自身合成生长因子的能力，因此在培养基中需要适当补充生长因子如生物素、烟酸和牛肉膏等。
本发明所述菌株Rhodopseudomonas palustris CQK 01在产氢方面具有独特的优势，检测到该菌种在特定条件下，其产氢能力达22.32mg·h-1·l-1，国外文献报道光合细菌产氢速率一般为0.00518-1.58mg·h-1·l-1，与国内外同类光合细菌菌种产氢能力比较处于前列。同时本菌种的产氢能力通过基因工程还有进一步改进和提高的潜力。
由于本筛选纯化得到的Rhodopseudomonas palustris CQK 01是以有机底物为碳源、混合多种氮源、无机盐及生长因子等而得到，除在产生氢能方面具有独特的优势外，同时能分解有机物，特别是降低有机废水的COD值，研究发现该菌种对有机物质的分解和利用率最高可达到98％以上，而文献报道光合细菌对底物的转换率最高可达到80％，因此本菌种在转化和利用有机底物方面具有很大的优势，同时研究发现本菌种特别适合分解和利用厌氧发酵后的有机废水，能进一步降低废液中的有机物含量，取得良好的净化性能，充分利用了生物质能，实现了化害为宝，保护环境的目的。因此在环境保护和实现资源的可持续利用方面具有广阔的应用前景和社会价值。
Rhodopseudomonas palustris CQK 01在产氢过程中吸收太阳光能，充分利用太阳光能进行自身生长的同时通过能量聚集系统收集和转化能量于氢气中，研究发现Rhodopseudomonas palustris CQK 01对太阳光能的转化效率为5.6-11.2％。据报道辐射到地球上的太阳光能量是地球上最大的可再生能源，约5.7×1024J/年，比人类消耗的总能量的10000倍还多。我国幅员辽阔、日照时间长，特别是广大的西部地区具有丰富的太阳光能资源，因此合理而高效地转化和利用太阳光能对可持续发展和促进西部大开发战略的实施具有重要的意义。本菌种的筛选成功和进一步在基因工程、生化工程、化工传递和工程热物理等方面的研究和应用将对实现这一战略奠定良好的基础。其次，本菌种在环境保护方面具有广阔的应用潜力，研究发现该菌种对有机物质的分解和利用率最高可达到98％。特别适合分解和利用厌氧发酵后的有机废水，能进一步降低废液中的有机物含量，取得良好的净化性能，充分利用了生物质能，实现了化害为宝，保护环境的目的。
具体实施例方式
实施例(1)采集菌源采集重庆市周边地区的农田、污水沟等上表层淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集上清液，显微镜下初步镜检微生物的种类和数量分布，发现有大量的其它杂菌，如念珠藻菌、绿藻等，光合细菌数量很少。
(2)光合细菌的增殖培养取上述上清夜适量分别倒入4只干净无菌的250ml的三角瓶中(每个菌源各培养2瓶)，同时加入适量新鲜灭菌的培养基于瓶中，充入氩气排除空气，贴好标签，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，当培养液颜色逐渐变紫红，在瓶壁上有红色菌吸附生长时，取适量上述培养液和已灭菌的新鲜培养液加入灭菌的干净培养瓶中，充入氩气创造厌氧环境，进行再次光照静置转化培养，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为杆形或椭圆形细菌为止。
(3)光合细菌的分离纯化主要采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境。首先制作基础营养固体平板，待培养基平板冷却后分别接种光合细菌增殖培养液的各梯度稀释液，待平板表面稍蒸发后，倒入35-45℃左右的覆盖培养基，盖上培养皿皿盖，正置冷却。将接种后含双层固体培养基的培养皿置于30℃的光照恒温培养箱中光照培养4-7天；待长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一而大、菌落颜色为红色者为目的菌种，进行多次的分离转化，直到得到显微镜下观察到细胞形态皆为短杆形或椭圆形的菌落即判定得到纯菌种。
(4)光合细菌的鉴定按照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)关于光合细菌分类的方法进行生理和形态特征鉴定，同时提取16S rDNA基因序列进行分析并与NCBI(TheNational Center for Biotechnology Information，American)上BLASTn中标准菌的基因序列进行比对，测得构成该菌株该菌株16S rDNA基因序列片段为1453bp，经过与NCBI的BLASTn比对分析，发现该菌株与沼泽红假单胞Rhodopseudomonas palustris 16srDNA基因序列具有99％以上的同源性。综合其生理生化和培养特性以及特异基因序列的比对结果，可以判断该菌种属于红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，并命名为Rhodopseudomonas palustrisCQK 01。
(5)本产氢光合细菌菌种的保藏本菌种可采用多种方法进行保藏，如液体石蜡封藏4℃冰箱保藏、液氮冷冻甘油保藏、砂土保藏等等，一般要求保持厌氧条件以保证该菌种的产氢酶活性。同时使用保藏菌种时，最好将该菌种进行一定时期的复壮或复活，能进一步缩短该菌种在实际应用中的延迟期，提高菌种的活性。
权利要求
1.一种高效产氢光合细菌菌株，其特征为该菌株是沼泽红假单胞菌(Rhodoseudomonas palustris)CQK 01株，保藏日期是2007年03月01日，其保藏号为CGMCC No.1947。
全文摘要
本发明是一种高效产氢光合细菌菌株，属于红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属，种名为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQK01株，保藏号为CGMCC No.1947。利用本发明菌株可高效产氢，其产氢能力达22.32mg·h
文档编号C02F3/34GK101050443SQ200710078268
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月9日 优先权日2007年3月9日
发明者廖强, 王永忠, 朱恂, 王中康 申请人:重庆大学