专利名称：一种生产蓝色素的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然色素的生产方法及其生产菌株，特别是涉及一种生产蓝色素的方法及其专用培养菌株。
背景技术：
色素一般分为人工合成色素和天然色素，两者均已广泛应用于食品着色剂、日用化妆品及饲料添加剂等方面。人工合成色素是指用化学合成方法所制得的有机色素，主要是从煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯胺等芳烃类化合物为原料合成。人工合成色素出现后，以其色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、配色方便、价格便宜等优点迅速为使用者所接受，但是随着现代医学、食品卫生学等学科的发展，人们发现合成色素存在着毒理学问题，有些对人体健康有害，甚至诱发癌症等。因此，越来越多的国家停止使用了一些毒性较大的品种，有的国家甚至禁止了合成色素的使用。由于天然色素大部分是来自植物、微生物、动物的可食部分，提取加工过程是纯物理过程，结构上不会起变化。因此，天然色素因其安全性高和大多具有一定的营养价值而引起人们的广泛重视，其开发应用研究成为植物化学和食品科学领域中的热点。
蓝色素作为3个基本色素之一，具有很高的附加值，可与红、黄品系的天然色素调配成多种色调，使天然色素更加丰富。目前常用的天然蓝色素有桅子蓝色素和藻青素两种。桅子蓝色素是以植物栀子果实为原料，经预处理、有效成分抽提、酶促反应、蒸发浓缩及精制等过程得到蓝色素，但这种制备方法制备工艺复杂，成本高，生产原料受栀子果实产量限制，给大规模工业化生产蓝色素带来一定的困难(刘成伦，徐龙君.栀子色素研究的进展.天然产物研究与开发，1996，8(2)69～72)。藻青素是以螺旋藻(张昆，方岩雄.螺旋藻蓝色素的研究.食品与机械，1995，(4)21～23.)及念珠藻(赵良忠，段林东.念珠藻蓝色色素的提取及其性质研究.食品工业科技，1998，(2)24～26)为原料，经浸提、离心分离、浓缩、纯化而得，但藻青素的缺点是耐热、耐光性差。
从微生物中提取色素，不受资源、环境和空间的限制，具有植物色素和动物色素所不可比拟的优越性，但目前能生产蓝色素的微生物很少，已公开报道的均为链霉菌属，如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(Leonid V.Bystrykh，Miguel A.Fernández-Moreno，Jan K.Herrema，Francisco Malpartida，David A.Hopwood，LubbertDijkhuizen.Production of Actinorhodin-Related“Blue Pigments”by Streptomycescoelicolor A3(2).Journal of Bacteriology，1996，178(8)2238-2244)、Streptomycescoelicolor 100(张和春，季文明，王武.天蓝色链霉菌产蓝色素的工业化培养基优化.无锡轻工大学学报，2000，19(2)138～141)、Streptomyces sp LS-1(陆玲孙延涛，唐勇，秦怀兰一种放线菌发醇产天然蓝色素的研究微生物学通报.2001，28(4)50～54)等。这些菌株生长周期长，产色素的温度范围窄(26℃-30℃)，其蓝色素产量比较低，一般在0.2g色素粗提物/g细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种能分泌、生产蓝色素的菌株。
本发明所提供的产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1已于2004年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1194。
该菌株呈椭圆杆状，无芽胞、荚膜，革兰氏阴性。在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L)平皿上，菌落呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐。产色素前，细菌菌落大小为1～2mm，菌落为黄色。培养初期，色素在菌落中心产生，后扩及到四周，最终菌落直径可达到2～3mm，中心蓝色较深，四周蓝色较浅。该菌的氧化酶、细胞色素氧化酶、精氨酸双水介酶反应呈阳性，吲哚、酸化、脲酶、葡萄糖甙酶、蛋白酶及半乳糖甙酶反应为阴性，同化葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸及柠檬酸。用API 20 NE试剂盒(BioMérieux生物梅里埃公司)对该菌种进行鉴定，鉴定结果的编码为1147555，鉴定百分率为99.9％，模式频率T＝0.93，菌名为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。该菌在4℃-30℃的培养温度及pH6-7.6的范围下均能生长。
本发明的第二个目的是提供应用本发明菌株生产蓝色素的方法。
本发明所提供的生产蓝色素的方法，包括如下步骤1)菌株培养将产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1 CGMCC №1194在4℃-30℃条件下发酵培养24-240小时得到菌体；2)破碎菌体细胞得到蓝色素。
所述发酵培养的培养基含有下述物质胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，葡萄糖0.8-1.2g，磷酸氢二钾2-4g，加水到1000ml。其中优选的是胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾3g，加水到1000ml，pH为6-7.6。
为了使发酵的效果更好，在进行液体培养前，冻存的菌种还经过平板培养活化，常用平板培养基含有下述物质胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl 2.5g，琼脂10g，加水到500ml；所述平板培养基pH为7.2-7.6。
在生产过程中，所述得到的菌体一般可采用离心方式，如在6000rpm离心即可得到菌丝体。所述破碎菌体细胞得到蓝色素的过程是向菌体中加入浓度为5-100％的乙醇、5-100％的异丙醇或5-100％的四氢呋喃，超声振荡后得到蓝色素的乙醇溶液，干燥后得到蓝色素。溶剂优选的是5-100％的乙醇，在用乙醇提取蓝色素时，乙醇加入量通常可控制在每100ml发酵液加入20-300ml，带有色素的乙醇溶液常用的干燥方式可采用真空干燥，干燥后即可以得到蓝色素粗产品。
本发明的菌株生长速度快，培养温度范围宽，在4℃-30℃条件下发酵均可产色素，便于工业化生产；本发明的菌株生产蓝色素的产率较高，一般可以达到5g以上蓝色素粗产品/L发酵液，得到的蓝色素属纯天然产品，没有人工色素潜在的危害，实验证明，对动物体不会产生任何副作用，可以广泛应用于食品工业等各领域中。
具体实施例方式
实施例1、产蓝色素细菌B1的分离筛选1、样品采集从新疆1号冰川采集土壤样品。
2、菌株的分离和筛选配制平板培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，加水到1000ml，pH7.4-7.6。将上述培养基以1.05kg/cm2，121℃，高压蒸汽灭菌20分钟，倒平板。
将土壤样品制成0.2％的悬浮液，按10倍稀释至悬浮液浓度为2×10-8，取每个稀释度样品液0.2ml分别均匀涂布于培养基平板上，4℃-30℃培养24-240小时，观察并挑选产蓝色素的菌落，其中一株菌命名为B1，纯化后保藏。
实施例2、菌株的培养及蓝色素粗品的提取1、菌株培养配制平板培养基胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCL 2.5g，琼脂10g，加水到500ml，调节pH7.2-7.6。将平板培养基在121℃下灭菌15min，倒平板，冷却后接入B1菌株，在30℃下培养48小时。
配制液体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾3g，加水到1000ml，调节pH6-7。将100ml培养基装入500ml培养瓶中灭菌，从平板中挑取单个产色素的菌落接种于无菌液体培养基中，在30℃温度下培养，搅拌转速为150rpm-250rpm。培养14小时后菌体处于对数生长中期并开始产色素，50小时后菌体进入停滞期时而色素产生则处在中期阶段，当菌体进入停滞期40小时后色素产生进入停滞期，可以停止发酵。
2、蓝色素的提取将发酵液在6000rpm下离心10min，弃上清液，在沉淀物中加入无水乙醇(每100ml发酵液加入50ml乙醇)，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡1小时，将振荡液8000rpm离心5min得到色素的乙醇溶液。若仍有色素残留在细胞残渣中，可重复上述操作步骤，直至不再能提取出色素为止。
将所得到的乙醇溶液真空干燥，即得到蓝色素的粗提物，产率为5.3g蓝色素粗产品/L发酵液。
实施例3、菌株的培养及蓝色素粗品的提取1、菌株培养培养过程与实施例2相同，不同之处在于所用培养基为胰蛋白胨8g，酵母提取物6g，葡萄糖0.8g，磷酸氢二钾4g，加水到1000ml；培养温度为4℃，培养过程搅拌转速为150rpm-250rpm，培养240小时后即可以停止培养。
2、蓝色素提取将发酵液6000rpm离心10min得到菌体，向菌体中加入5％异丙醇溶液(每100ml发酵液加入300ml异丙醇溶液)，超声振荡破碎细胞得到蓝色素的异丙醇溶液，真空干燥即得到蓝色素的粗提物，产率为5.1g蓝色素粗产品/L发酵液。
实施例4、菌株的培养及蓝色素粗品的提取1、菌株培养培养过程与实施例2相同，不同之处在于所用培养基为胰蛋白胨12g，酵母提取物4g，葡萄糖1.2g，磷酸氢二钾2g，加水到1000ml；培养温度为30℃，培养过程搅拌转速为150rpm-250rpm，培养100小时后即可以停止培养。
2、蓝色素提取将发酵液6000rpm离心10min得到菌体，向菌体中加入50％四氢呋喃溶液(每100ml发酵液加入100ml四氢呋喃溶液)，超声振荡破碎细胞得到蓝色素的异丙醇溶液，真空干燥即得到蓝色素的粗提物，产率为5g蓝色素粗产品/L发酵液。
实施例5、本发明蓝色素的物理化学特性检测1、光稳定性将2ml实施例2中未经干燥的色素乙醇溶液加入至透光性较好的10ml玻璃试管中，用封口膜和石蜡密封以防乙醇挥发，置于户外自然光下照射，光照一定时间后色素的损失率如表1所示。
表1.色素在自然光照射下的损失率
由表中的数据可以看出，色素在乙醇溶液中的光稳定性较差，经过24小时后，色素损失超过90％，颜色也发生变化，由原先的深蓝色变为浅黄色。
2、热稳定性将1ml浓度为0.5g/L的色素乙醇(乙醇浓度为100％)溶液和浓度为1.0g/L水溶液分别置于1.5ml聚丙烯管中进行温度处理，根据色素的损失率来定性判断色素的热稳定性。采取三种温度处理方式空气浴60℃、100℃分别加热4h，高压蒸汽锅121℃加热15min，热稳定性结果如表2所示。结果表明，当以乙醇作为溶剂时，色素吸光度值没有损失。当以水作为溶剂时，作用温度为100℃时的色素损失大于60℃。
表2.色素在不同温度下的损失率
将实施例2中未经干燥的色素提取液用锡箔纸遮光在冰箱中4℃下保存，至少在30天内，色素颜色基本不发生变化。
3、色素的酸碱稳定性向5ml实施例2中未经干燥的色素乙醇溶液加入HCl，当溶液HCl浓度为2.4mol/L时，溶液颜色由原来的深蓝色变为绿色；加入NaOH，当溶液NaOH浓度为0.24mol/L时，溶液颜色由原来的深蓝色变为黄色。
4、色素在不同溶剂中的溶解性及溶解颜色所得蓝色素在不同的溶剂中所显示的颜色有很大不同。以水、石油醚为溶剂，显示为灰蓝色；以甲醇、乙醇、异丙醇、50％甲醇、50％乙醇、50％异丙醇、50％丙酮、50％四氢呋喃作为溶剂，显示为蓝色；以丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃作为溶剂，显示为紫色。
由目测可直接观察到一定量的色素粗提物可以很快溶于甲醇，溶解性最好；四氢呋喃和乙醇次之；水和石油醚对色素粗提物的溶解性最差。
权利要求
1.产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1 CGMCC №1194。
2.一种生产蓝色素的方法，包括如下步骤1)菌株培养将产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1 CGMCC№1194在4℃-30℃条件下发酵培养24-240小时得到菌体；2)破碎菌体细胞得到蓝色素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基含有下述物质胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，葡萄糖0.8-1.2g，磷酸氢二钾2-4g，加水到1000ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述培养基含有下述物质胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾3g，加水到1000ml，pH为6-7.6。
5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于所述产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1 CGMCC №1194在接种前还经过平板培养，所述平板培养基含有下述物质胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl 2.5g，琼脂10g，加水到500ml；所述平板培养基pH为7.2-7.6。
6.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于所述菌体是自发酵培养液中通过离心得到的。
7.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于所述破碎菌体细胞得到蓝色素的过程是向菌体中加入浓度为5-100％的乙醇、5-100％的异丙醇或5-100％的四氢呋喃作为溶剂，超声振荡后得到蓝色素的溶液，干燥后得到蓝色素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述溶剂是浓度为5-100％的乙醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述乙醇加入量为每100ml发酵液加入20-300ml乙醇。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述干燥采用真空干燥。
全文摘要
本发明公开了一种生产蓝色素的方法及其专用菌株。本发明所提供的菌株为产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1 CGMCC №1194，应用该菌株生产蓝色素的方法，包括如下步骤1)菌株培养将产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)B1 CGMCC №1194在 4℃－30℃条件下发酵培养24－240小时得到菌体；2)破碎菌体细胞得到蓝色素。所述液体培养基含有下述物质胰蛋白胨8－12g，酵母提取物4－6g，葡萄糖0.8－1.2g，磷酸氢二钾2－4g，加水到1000ml；用本发明的菌株生产得到的蓝色素属纯天然产品，没有人工色素潜在的危害，实验证明，对动物体不会产生任何副作用，可以广泛应用于食品工业等各领域中。
文档编号C09B61/00GK1586130SQ20041007432
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者邢新会, 娄恺, 卢元, 魏东, 茆军, 张志东 申请人:清华大学, 新彊农业科学院微生物应用研究所