专利名称：粤蓝链霉菌的制作方法
专利说明粤蓝链霉菌 本发明涉及一种新的链霉菌，属于微生物技术领域。近年来，无毒、无致畸病、稳定性强的微生物产天然色素的开发研究越来越受到人们的重视。微生物来源的色素种类多，数量大，成本低廉，生产工艺简单，具有植物色素和动物色素所不可比拟的优势。利用自然界中微生物发酵生产的色素种类较为丰富，但是国内外生产的天然蓝色色素种类却较少，而用微生物发酵生产的紫罗兰蓝色色素更是罕见。紫罗兰蓝色色素作为3个基本色素之一，具有很高的附加值，可与红、黄品系的天然色素调配成多种色调，使天然色素更加丰富。因此，通过微生物发酵途径来获得天然紫罗兰蓝色色素一直是研究热点。本发明的目的是提供一种能够产生紫罗兰蓝色色素的新种链霉菌——粤蓝链霉菌。
本发明所述的粤蓝链霉菌系由越南的DφO Xong pha森林根际土中采集的土壤，经分离培养获得。该菌培养条件为(1)培养基采用高氏合成1号琼脂培养基。具体配方为可溶性淀粉20.0g，硝酸钾(KNO3)1.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钠(NaCl)0.5g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01g，琼脂20.0g，水1000ml；(2)pH7.2～7.4；(3)培养温度28℃。该菌命名为粤蓝链霉菌Streptomyces vietnamensis(viet.nam.en’sis.N.L.adj.)，编号为GIMV4.0001。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心和国外菌种保藏单位日本IAM菌种保藏中心保藏，保藏日期分别为2005年12月9日和2006年2月16日，保藏登记号为CCTCCM No.205143和IAM15340。
本发明的粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)具有下述性质1.形态特征在扫描电镜下可见，孢子多，孢子链直，分支，孢子长柱形，表面有一层鞘。
2.在各种培养基上的特征在酵母精麦芽精琼脂(ISP2)、燕麦粉琼脂(ISP3)和高氏合成一号琼脂培养基等不同的培养基上的培养特征见表1。
表1粤蓝链霉菌在不同培养基上的培养特征
本发明的粤蓝链霉菌在培养基上所产生的紫罗兰蓝色色素易溶于碱性溶液和甲醇，微溶于酸性溶液(酸性越强则溶解度越低)和乙醇等极性大的有机溶剂，不溶于丙酮、乙醚等极性小的有机溶剂；该色素在pH≤5的范围内，颜色比较稳定；色素在紫外光下稳定性较强，该色素热稳定性较好，能耐较高温。
3.生理生化特征该菌株兼性厌氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，产生黑色素和H2S，牛奶胨化，明胶液化快，能水解淀粉，能还原硝酸盐。
4.碳源利用能利用蜜二糖、山梨糖、蔗糖、葡萄糖、D-果糖、木糖、D-半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖为碳源，但不能利用D-甘露醇。
5.其它性质最适生长温度28℃；细胞壁含有LL二氨庚二酸，属细胞壁I型；细胞水解物中含有甘露糖、半乳糖和核糖。细胞壁脂肪酸含有十四酸、十六酸、油酸、十六碳一烯酸、亚油酸和十八酸。
本发明所述的粤蓝链霉菌其形态特征与其他的链霉菌有显著差异，与基因序列同源性达98％-99％的链霉菌相比，也完全不同。比基尼链霉菌(Streptomyces bikiniensis)与本发明所述的粤蓝链霉菌16SrDNA序列同源性达99.4％，但形态特征完全不同，比基尼链霉菌孢子丝直、柔曲。孢子卵圆形、长圆形，表面光滑，在ISP培养基上无可溶性色素或迹量黄色；焦土(晓多)链霉菌(Streptomyces showdoensis)与本发明所述的粤蓝链霉菌16SrDNA序列同源性达99％，但焦土(晓多)链霉菌(Streptomyces showdoensis)在ISP培养基上不产生可溶性色素；Streptomyces viridobrunneus与本发明所述的粤蓝链霉菌16SrDNA序列同源性达99％，但Streptomyces viridobrunneus产生绿色可溶性色素；其他的与本发明所述的粤蓝链霉菌16SrDNA序列同源性达98％链霉菌种类也与粤蓝链霉菌在某些方面有明显的不同，Streptomyces tanashiensis，Streptomyces cinereoruber，Streptomyces filamentosus andStreptomyces venezuelae在ISP培养基上不产生色素(Shirling & Gottlieb，1968a，1968b，1969)；Streptomyces exfoliatus气生菌丝粉红色(Shirling & Gottlieb，1968a)；Streptomyces rubiginosohelvolus在ISP培养基上不产生或产生浅黄色可溶性色素(Shirling& Gottlieb，1968b)；Streptomyces crystallinus产生浅褐色或黑褐色可溶性色素(Williams，1989)。本发明的粤蓝链霉菌与其同源性最高的链霉菌菌株微生物学特性的比较见表2，并与部分相关菌株依据16SrDNA序列构建了系统发育树，见附图5。
表2粤蓝链霉菌与其同源性最高的链霉菌菌株微生物学特性比较
注表中+表示阳性，-表示阴性，W表示反应弱，ND表示没有测定。附
图1本发明所述的粤蓝链霉菌菌株的16SrDNA序列。
附图2本发明所述的粤蓝链霉菌产生色素的照片。
附图3本发明所述的粤蓝链霉菌孢子链的扫描电子显微镜照片，左图2μm，放大10000倍；右图10μm，放大2000倍。
附图4本发明所述的粤蓝链霉菌孢子的扫描电子显微镜照片(放大10000倍)。
附图5本发明所述的粤蓝链霉菌及部分相关菌株依据16SrDNA序列构建的系统发育树。实施例1粤蓝链霉菌的分离培养方法从越南Dφo Xongpha原始森林中采集植物根际0-30cm土样，取10g土壤放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻珠)，在180rpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后取上层液稀释10倍后取0.1mL均匀涂布在高氏合成1号琼脂培养基板上，翻转平板置于28℃培养箱中培养几天，即可获得本发明所述的粤蓝链霉菌CCTCCM No.205143。
高氏合成1号琼脂培养基可溶性淀粉20.0g，硝酸钾(KNO3)1.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钠(NaCl)0.5g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01g，琼脂20.0g，水1000ml，pH7.2～7.4。
培养温度为28℃。
用本发明所述的粤蓝链霉菌以高氏合成1号琼脂培养基进行发酵培养7天后，将其发酵液pH调至9，经8000rpm离心5min后取上清夜，再用pH9的缓冲液将其稀释25倍，在588nm下测得紫罗兰蓝色色素OD为0.5158，即该粤蓝链霉菌发酵液中色素的色价为12.5。
实施例2粤蓝链霉菌菌株16SrDNA的提取方法本发明还提供了该粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)CCTCCM No.205143的16SrDNA的提取及测序方法，具体按照下述操作进行1.所用试剂(1)5M NaCl(2)TE1(10mM Tris，25mM EDTA)pH8.0(3)TE2(10mM Tris，1mM EDTA)pH8.0(4)10％SDS
(5)氯仿∶异戊醇(24∶1)(6)异丙醇(7)CTAB/NaCl(8)蛋白酶K母液20mg/ml2.DNA提取方法(1)将菌丝转移至灭过菌的研钵中，充分研磨。
(2)加567ulTE悬浮，并加入30uL 10％SDS，3uL 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时。
(3)加100ul 5mol/L NaCl，混匀。
(4)加80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃温育20分钟。
(5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，10,000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。
(6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中。
(7)加0.6倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止1小时，沉淀DNA。
(8)14,000rpm离心20分钟，收集DNA沉淀。
(9)DNA沉淀加500uL 70％乙醇漂洗，自然风干。
(10)加50ul TE溶解DNA，-20℃保存。
3.PCR扩增方法本发明所述的粤蓝链霉菌的16SrDNA的PCR扩增所用的通用引物正向引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1522R(5’-AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA)，引物序列的设计参照Edwards & Rogall(1989)的文章，引物由上海英骏公司合成。扩增所用的试剂盒购买于大连宝生物公司。
PCR扩增体系为成分 终浓度浓缩反应缓冲液 1×工作浓度dNTP混合物 各0.2mmol/LTaq DNA聚合酶 0.5～1.0U/50uL氯化镁(MgCl2) 1.5mmol/L上游引物 1umol/L下游引物 1umol/L模板 102～105拷贝/50ul
无菌水将反应体积补足至50ulPCR反应程序 16SrDNA的序列测定委托上海英俊生物科技有限公司进行，在GenBank数据库上的登录号是DQ311081，测试结果见附图1。
序列表<110>广东省微生物研究所<120>粤蓝链霉菌<140>200610034149.7<141>2006-03-07<160>1<210>1<211>1419<212>DNA<213>粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)<400>1GCAAGTCGAA CGATGAAGCC CCTCGGGGTG GATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG 60GGCAATCTGC CCTTCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC CGGATACGAC 120CCGGGAAGGC ATCTTCCCGG GTGGAAAGCT CCGGCGGTGA AGGATGAGCC CGCGGCCTAT 180CAGCTTGTTG GCGGGGTAAC GGCCCACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC CTGAGAGGGC 240GACCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA 300TATTGCACAA TGGGCGCAAG CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA CGGCCTTCGG 360GTTGTAAACC TCTTTCAGCA GGGAAGAAGC GCAAGTGACG GTACCTGCAG AAGAAGCGCC 420GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGGCG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT 480
TGGGCGTAAA GAGCTCGTAG GCGGCTTGTC ACGTCGGGTG TGAAAGCCCG GGGCTTAACC 540CCGGGTCTGC ATCCGATACG GGCAGGCTAG AGTGTGGTAG GGGAGATCGG AATTCCTGGT 600GTAGCGGTGA AATGCGCAGA TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAAGGCGG ATCTCTGGGC 660CATTACTGAC GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT 720CCACGCCGTA AACGTTGGGA ACTAGGTGTT GGCGACATTC CACGTCGTCG GTGCCGCAGC 780TAACGCATTA AGTTCCCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC AAAGGAATTG 840ACGGGGGCCC GCACAAGCAG CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC GAAGAACCTT 900ACCAAGGCTT GACATATACC GGAAAGCATT AGAGATAGTG CCCCCCTTGT GGTCGGTATA 960CAGGTGGTGC ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG 1020AGCGCAACCC TTGTCCTGTG TTGCCAGCAT GCCCTTCGGG GTGATGGGGA CTCACAGGAG 1080ACCGCCGGGG TCAACTCGGA GGAAGGTGGG GACGACGTCA AGTCATCATG CCCCTTATGT 1140CTTGGGCTGC ACACGTGCTA CAATGGCCGG TACAAAGAGC TGCGATGCCG TGAGGCGGAG 1200CGAATCTCAA AAAGCCGGTC TCAGTTCGGA TTGGGGTCTG CAACTCGACC CCATGAAGTC 1260GGAGTTGCTA GTAATCGCAG ATCAGCATTG CTGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC 1320ACACCGCCCG TCACGTCACG AAAGTCGGTA ACACCCGAAG CCGGTGGCCC AACCCCTTGT 1380GGGAGGGAGC TGTCGAAGGT GGGACTGGCG ATTGGGACG 1419
权利要求
1.一种新的链霉菌，其特征是命名为粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2005年12月9日，保藏登记号为CCTCCMNo.205143。
2.权利要求1所述的粤蓝链霉菌，其16SrDNA部分的序列如下GCAAGTCGAACGATGAAGCCCCTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCCGGGAAGGCATCTTCCCGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATCCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGATGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACG。
3.权利要求1或2所述的粤蓝链霉菌，其生物学特征是兼性厌氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，产生黑色素和H2S，牛奶胨化，明胶液化快，能水解淀粉，能还原硝酸盐；在扫描电镜下可见，孢子多，孢子链直，分支，孢子长柱形，表面有一层鞘。
4.权利要求1或2所述的粤蓝链霉菌，具有产生大量紫罗兰蓝色色素的能力。
5.权利要求3所述的粤蓝链霉菌，具有产生大量紫罗兰蓝色色素的能力。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种能够产生紫罗兰蓝色色素的新的链霉菌菌种，本发明特征在于命名为粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)，现在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2005年12月9日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCM No.205143。本发明在酵母精麦芽精琼脂(ISP2)、燕麦粉琼脂(ISP3)和高氏合成一号琼脂等培养基上可产生大量可溶性紫罗兰蓝色色素，该色素在紫外光下稳定性较强，该色素热稳定性较好，能耐较高温，具有从中开发出新型、高效、无毒天然色素的巨大潜力。
文档编号C12P1/04GK1944630SQ200610034149
公开日2007年4月11日 申请日期2006年3月7日 优先权日2006年3月7日
发明者朱红惠, 郭俊, 孙晓棠, 羊宋贞, 李燕旋, 陈美标 申请人:广东省微生物研究所