诺瓦克病毒和轮状病毒多重rt－pcr检测方法及试剂盒的制作方法

专利名称：诺瓦克病毒和轮状病毒多重rt－pcr检测方法及试剂盒的制作方法
专利说明诺瓦克病毒和轮状病毒多重RT-PCR检测方法及试剂盒 本发明涉及一种同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的多重RT-PCR检测方法和试剂盒，可应用于医学、检验检疫、质量监督等部门，属于生物技术领域。诺瓦克病毒(norovirus)和轮状病毒(rotavirus)是世界范围内病毒性胃肠炎的重要病因，近年来的研究表明，胃肠炎病毒可直接通过人接触传播或间接地通过被污染的水、食物等传播，因此世界卫生组织又将其命名为食源性胃肠炎病毒。食源性胃肠炎病毒的感染剂量非常低，10-100个病毒粒子即可引发感染。在离体条件下存活力很强，对各种理化因子有较强抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反复冻融、超声波处理都不能使其失活。且这类病毒的序列变异较大，有多种血清型存在。根据VP7抗原特异性可将轮状病毒分为14个G型，根据VP4抗原特异性又可分为18个P型，G型和P型组合后代表某一轮状病毒的血清型；诺瓦克病毒已知有15个基因型，且这个数目还会不断的增加。而在世界不同地区，不同的时间，食源性胃肠炎病毒的流行株存在很大的差异，胃肠炎病毒的感染常伴有混合感染的趋势，而现今的检测方法灵敏度不够高，因此对于疾病的诊断和治疗带来了很大的困难。近年来，食源性胃肠炎病毒的流行在世界范围内有不断上升的趋势，且流行范围广，传染性强，二次攻击率高，常造成急性严重的呕吐和腹泻，虽然不同病毒感染的症状轻重不一，但一般患者都具有低烧、呕吐、腹泻、头痛等严重的脱水样胃肠炎的症状。人群对这几种病毒普遍易感，儿童和老人最为严重，为胃肠炎病毒的危险人群。胃肠炎病毒的流行有一定的季节性，但全年均可发生，可呈暴发流行，也可呈散发流行，因此致使对其不能进行及时有效的防护。
腹泻病毒历来是威胁人类健康特别是婴幼儿健康的重大传染病，目前对食源性胃肠炎病毒的治疗尚未有特效药物。无论在发达国家或是发展中国家，由轮状病毒引起的腹泻均有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的最主要病因，在我国，情况更加严重，由A型轮状病毒引起的婴幼儿腹泻和由B型轮状病毒引起的成人腹泻都非常流行。据WHO1997年统计，全世界每年有14亿轮状病毒感染者，在发展中国家有87万人因此而死亡。在美国，96％的严重非细菌性胃肠炎由NLV引起，其中24％为食源性的；1996年4月到1997年3月，我国北京的首都儿科研究所，利用杆状病毒表达的诺瓦克类病毒衣壳蛋白作抗原，对各年龄组的人群诺瓦克类病毒的IgG抗体进行了检测，发现人群中IgG抗体阳性高达89％，其中婴儿阳性率很高，为99％，这一调查结果反映了诺瓦克类病毒的感染在人群十分普遍。
轮状病毒、诺瓦克病毒是世界范围内通过食物传播的重要食源性病毒。由于在患者或无症状的携带者的粪便中病毒被大量排放，常导致胃肠炎疾病的暴发流行。这些病毒既可通过粪口途径传播，又可通过食源性或水体途径传播。食品(尤其是贝类)和水体性的感染可导致地域性大范围、大量人口的感染，因此对食品和水中病毒的检测显得尤为重要。迄今为止，由于高特异性和灵敏性，RT-PCR是检测食源性病毒最为高效的方法。但是常规的PCR都是单一地扩增，即每个反应只能扩增一个模板，在实际应用中很难处理高通量的样品，而且费时耗力、成本较大。为了克服这些缺点，提高PCR检测法的能力，Chamberlain等人在1988年首次建立了多重PCR技术(m-PCR)。m-PCR是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多个模板的目的。多重PCR已成功应用于细菌、病毒的检测。但尚未见有从环境样本如水、食品等样品中直接进行食源性诺瓦克病毒和轮状病毒多重PCR检测研究的报告。
随着环境的恶化，近年来，各种新型病毒相继不断出现和肆虐，SARS和禽流感的暴发流行，给人类的生活和健康带来了极大的危害，也给国民经济和社会发展带来极大的负面影响。因此，在现有检测方法基础上，发展快速有效的胃肠炎病毒诊断和检测方法及研制相关试剂盒投入实际应用，对保障食品安全提高公共卫生水平，未雨绸缪保障人类健康具有重大意义。本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种用于同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的特异性强、灵敏度高的多重RT-PCR检测方法，并在此基础上研制出同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，适用于处理大通量的样品，可以推广应用到环境检测、食品卫生领域、商品检验检疫等领域。
本发明以轮状病毒VP7基因的高保守区段设计各血清型通用的引物，碱基序列分别为上游引物5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；下游引物5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；以诺瓦克病毒RNA多聚酶高保守区为靶序列设计诺瓦克病毒GI、GII型的通用引物，碱基序列分别为上游引物5’-GAT TAC TCC AAG TGG GAC TCC AC-3’；下游引物5’-GAC AAT GTA ATC ATC ACC ATA-3’本发明的目的具体可按如下方案来实现1.提取病毒核酸(1)取一定量的样品，加900ul Trizol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min；(2)加入200ul氯仿，用力振摇15S，再静置2～3min；(3)4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；(4)加入500ul异丙醇，充分混匀，室温放置10min；(5)4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；(6)加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；(7)4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；(8)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中。
2.PCR扩增将反转录和扩增反应的所需试剂一次性加入反应管内，两次反应在一个反应管内完成，整个实验过程无须开盖。
多重PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1uL、2mmol/LdNTP 2.5uL、0.3-0.5μmol/L轮状病毒引物各1μL、0.3-0.5μmol/L诺瓦克病毒引物各1μL、1.5U TaqE 1.5uL、25mmol/L MgCl22.5uL、模板2.5μL，加DEPC水至25μL。
扩增条件采用降落PCR进行扩增，条件为变性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火温度每降低1℃2个循环，10个循环后退火温度降至为50℃进行20个循环，共30个循环后，72℃延伸10min。
3.电泳、PCR产物序列测定取扩增产物5ul，制备1.4％的琼脂糖凝胶直接进行电泳，以Gold view染料替代0.5μg/mLEB，凝胶成像分析系统UV I观察结果。
4.结果分析4.1多重RT-PCR特异性诺瓦克病毒和轮状病毒在多重扩增中均得到了清晰特异的预期扩增条带，与100bp标准分子量对照，轮状病毒的预期条带为392bp，诺瓦克病毒的预期条带为319bp。以混合模板单引物、单模板混合引物、混合模板混合引物三种反应模式验证了本发明所涉及引物的特异性，三种模式的扩增均有特异的预期带，而引物之间及引物与模板之间没有交叉反应发生，每一个RT-PCR反应都产生了清晰的大小为318bp和392bp的条带。阴性对照无扩增条带出现，见附

图1。
4.2多重RT-PCR灵敏度将经10倍梯度系列稀释的病毒核酸进行多重RT-PCR扩增，轮状病毒可检测到的最高灵敏度为50pg，诺瓦克病毒可检测到的最高灵敏度为100pg，见附图2。
本发明的同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒多重RT-PCR检测试剂盒由以下试剂构成轮状病毒上游引物、轮状病毒下游引物、诺瓦克病毒上游引物、诺瓦克病毒下游引物、200U MLV反转录酶、20U Rnasin、1.5U TaqE、2mmol/L dNTP、25mmol/L MgCl2、10×缓冲液、DEPC水组成。一次检测所用的组分量为轮状病毒上游引物1uL；轮状病毒下游引物1uL；诺瓦克病毒上游引物1uL；诺瓦克病毒下游引物1uL；MLV反转录酶1uL；Rnasin 0.5uL；TaqE 1.5uL；2mmol/L dNTP 2.5uL；25mmol/L MgCl22.5uL；10×缓冲液2.5uL；DEPC水补足剩余体积至25uL。图1多重RT-PCR特异性分析。M100bpDNA分子标准；N阴性对照；1-2诺瓦克病毒(319bp)；3-4轮状病毒(392bp)；5诺瓦克病毒和轮状病毒。
图2多重RT-PCR灵敏度分析。M100bpDNA分子标准；N阴性对照；1-6诺瓦克病毒(319bp)和轮状病毒(392bp)的多重PCR灵敏度检测，所对应的核酸量依次为10ng，5ng，1ng，100pg，50pg，10pg。
图3多重RT-PCR检测贝类样本结果。M100bpDNA分子标准；N阴性对照；1-5在贝类样本中100pg的诺瓦克病毒(319bp)和轮状病毒(392bp)核酸的多重扩增检测结果。实施例1多重RT-PCR检测方法用于同时检测贝类样品中轮状病毒和诺瓦克病毒(1)病毒的生物富集从本地的水产市场购买贝类，将其放养于一个盛有海水的容器中，然后投放诺瓦克病毒和轮状病毒样本于容器中，模拟自然水体的环境，使贝类自然富集。同时，以同样的条件(不投毒)设立阴性对照。每隔8h换水及重新投毒一次，整个生物富集时间为24h。
(2)贝类中病毒的活化和浓缩将上面经过生物富集的贝类，五只贝为一个样，剥壳，取其胃和消化道1.5g，然后转入50ml的Falcon管中，加入15ml冷的经灭菌的0.05mol/L甘氨酸～0.14mol/L氯化钠(pH7.5)，然后用Waring blender在冰上高速匀浆。为了防止交叉污染，应用70％的酒精对Waring blender消毒，并在每个样品匀浆后用Bursen beuner加热1min。具体的过程如下(a)4℃，5000g，离心20min，收集上清，4℃存放；(b)把沉淀重新悬浮于15ml，pH7.5的0.5mol/L的苏氨酸-0.14mol/L的氯化钠中，涡旋60s；(c)4℃，5000g，离心20in。将两次上清液混合，置于另一Falcon管中，弃去沉淀；(d)向上清液中加入15mlPEG6000(120g/L，即PEG6000，0.3mol/L的氯化钠)，在4℃下放置2h；(e)8000g，4℃，离心30min，弃上清。将沉淀重新悬浮于15ml的PBS中(pH7.5)，再加入15ml的氯仿，涡旋60s；(f)4℃，2000g离心30min，取上清；(g)再加7.5ml 120g/L的PEG，4℃下放置两小时；(h)4℃，14000g，离心15min，取上清；(i)PEG沉淀小球再用1ml，6mol/L的异硫氰酸胍溶液再悬浮，室温放置10min；(j)4℃，12000g离心10min，取上清，用于RNA抽提。
(3)RNA抽提用美国生命技术公司生产的Trizol试剂盒，抽提贝类浓缩物中的病毒RNA。取200～300ul样品，加900ul Trizol试剂，用移液器反复混合均匀，离心15min，弃去上层液体后加入500ul异丙醇，充分混匀，室温放置10min；4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中。在分光光度计上测定所提取的RNA浓度和纯度。
(4)多重RT-PCR检测多重PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5uL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV反转录酶1uL、2mmol/L dNTP 2.5uL、0.3-0.5μmol/L轮状病毒上下游引物各1uL、0.3-0.5μmol/L诺瓦克病毒上下游引物各1uL、1.5U TaqE1.5uL、25mmol/L MgCL22.5uL、模板2.5μL，加DEPC水至25μL。
扩增条件采用降落PCR进行扩增，条件为变性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃ 1min，72℃ 40S，退火温度每降低1℃2个循环，10个循环后退火温度降至为50℃进行20个循环，共30个循环后，72℃延伸10min。
(5)电泳、PCR产物序列测定取扩增产物5ul，制备1.4％的琼脂糖凝胶直接进行电泳，以Gold view染料替代0.5μg/mLEB，凝胶成像分析系统UV I观察结果。PCR产物测序由上海博亚生物公司完成。
(6)贝类中诺瓦克病毒和轮状病毒多重RT-PCR检测结果与100bp标准分子量对照，轮状病毒的扩增条带为392bp，诺瓦克病毒的扩增条带为319bp。电泳结果如图3，在1.5g贝类组织中，诺瓦克病毒和轮状病毒检测的核酸最高灵敏度均达到了100pg。
实施例2一种同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒多重RT-PCR试剂盒该试剂盒由以下试剂组成轮状病毒上游引物50uL、轮状病毒下游引物50uL、诺瓦克病毒上游引物50uL、诺瓦克病毒下游引物50uL、200U MLV反转录酶45uL、20U Rnasin 25uL、1.5U TaqE 60uL、2mmol/L dNTP 150uL、25mmol/L MgCl2150uL、10×缓冲液2mL、DEPC水2mL。
权利要求
1.一种同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的检测方法，主要包括以下步骤(1)提取病毒核酸a.取一定量的样品，加900uL Trizol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min；b.加入200ul氯仿，用力振摇15S，再静置2～3min；c.4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；d.加入500uL异丙醇，充分混匀，室温放置10min；e.4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；f.加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；g.4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；h.充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中。(2)PCR扩增多重PCR反应体系为10×PCR缓冲液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1μL，2mmol/L dNTP 2.5μL，0.3-0.5μmol/L轮状病毒上游引物和下游引物各1μL，0.3-0.5μmol/L诺瓦克病毒上游引物和下游引物各1μL，1.5U TaqE1.5μL，25mmol/L MgCL22.5μL，模板2.5μL，加DEPC水至25μL。将反转录和扩增反应的所需试剂一次性加入反应管内，两次反应在一个反应管内完成，整个实验过程无须开盖。扩增条件采用降落PCR进行扩增，条件为变性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火温度每降低1℃2个循环，10个循环后退火温度降至为50℃进行20个循环，共30个循环后，72℃延伸10min。(3)电泳、PCR产物序列测定取扩增产物5ul，制备1.4％的琼脂糖凝胶直接进行电泳，以Gold view染料替代0.5μg/mL EB，凝胶成像分析系统UV I观察结果。(4)结果分析如果出现392bp扩增条带，证明该样品存在轮状病毒；如果出现319bp扩增条带，则证明该样品存在诺瓦克病毒。
2.权利要求1所述的同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的检测方法，其特征在于所述的轮状病毒上游引物、轮状病毒下游引物、诺瓦克病毒上游引物、诺瓦克病毒下游引物分别为5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；5’-GAT TACTCC AAG TGG GAC TCC AC-3’；5’-GAC AAT GTA ATC ATC ACC ATA-3’。
3.一种权利要求1所述的同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的试剂盒，由以下试剂构成0.3～0.5μmol/L轮状病毒上游引物、0.3～0.5μmol/L轮状病毒下游引物、0.3～0.5μmol/L诺瓦克病毒上游引物、0.3～0.5μmol/L诺瓦克病毒下游引物、200U MLV反转录酶、20U Rnasin、1.5U TaqE、引物、2mmol/L dNTP、25mmol/L MgCl2、10×缓冲液、DEPC水组成。
4.权利要求3所述的同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的检测试剂盒由以下试剂组成轮状病毒上游引物50uL、轮状病毒下游引物50uL、诺瓦克病毒上游引物50uL、诺瓦克病毒下游引物50uL、200U MLV反转录酶45uL、20U Rnasin 25uL、1.5U TaqE 60uL、2mmol/LdNTP 150uL、25mmol/L MgCl2150uL、10×缓冲液2mL、DEPC水2mL。
全文摘要
本发明涉及一种同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒的多重RT－PCR检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过提取样品病毒核酸，经PCR扩增、电泳及PCR产物序列测定，结果如出现392bp扩增条带，证明该样品存在轮状病毒；如果出现318bp扩增条带，则证明该样品存在诺瓦克病毒。本发明还相应地建立了检测试剂盒，可特异性强、灵敏、高效地同时检测诺瓦克病毒和轮状病毒，适用于处理大通量的样品，可以推广应用到环境检测、食品卫生领域、商品检验检疫等领域。
文档编号C12Q1/68GK1876839SQ200610032890
公开日2006年12月13日 申请日期2006年1月17日 优先权日2006年1月17日
发明者吴清平, 寇晓霞, 张菊梅, 郭伟鹏 申请人:广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司