专利名称：浸矿细菌－嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离方法
技术领域：
本发明涉及到一种专性化能无机自养细菌-嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离方法。
背景技术：
各种证据表明，钩端螺旋菌(leptospirilla)在生物采矿过程中扮演了极为重要的角色。迄今为止，钩端螺旋菌属(The genus leptospirillum)至少包括4个种，即氧化亚铁钩端螺旋菌(L.ferrooxidan)、嗜热氧化亚铁钩端螺旋菌(已丢失)(L.thermoferrooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)和最近分离的第四个种-固氮铁氧化钩端螺旋菌(L.ferrodiazotrophum)。该属细菌均属于革兰氏阴性无机化能自养菌，都是通过氧化亚铁离子来获得维持生命活动的能量。相对于异养菌而言，由于这些专性化能自养菌对有机质非常敏感，以至于它们在普通的固体培养基上难以分离。各种试验结果表明，这些中度嗜温细菌在生物冶金领域具有广阔的应用前景，然而，到目前为止，有关嗜铁钩端螺旋菌的生物学研究报道得很少，究其原因，就在于这种细菌纯培养的困难。目前，真正在实验室条件下分离这些细菌最成功、最有效的方法为双层平板分离技术(Johnson，D B.Selective solid media for isolating and enumerating acidophilicbacteria.J.Microbiol.Meth.1995，23(2)，205-218.)。这种技术的最成功之处是涉及到一种叫做嗜酸异养菌SJH(Acidiphilium SJH)的加入。这种异养细菌事先与双层平板中的底层混合，其目的是消除培养基释放出的简单糖类和一些代谢产物对其所产生的抑制作用，从而使目标细菌很好的生长。双层平板技术在分离上述化能自养细菌方面虽然非常有效，但嗜酸异养菌的加入使得这种双层平板的制备较之于传统的单层平板的制备要复杂得多，而且对亚铁离子氧化细菌不具备选择性分离能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离方法。
浸矿细菌-嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离方法，首先将样品接种到一只已高温灭菌的盛有9K液体培养基的容器中，培养基pH＝2.5，20-30g/lFeSO4·7H2O，将该容器置于30℃空气浴摇床中振荡，摇床转速为180rpm，当培养基颜色变成红色时，获得第一代培养富集物；镜检到螺旋状细菌后，将适量第一代富集物接种到上述9K液体培养基中，培养基中亚铁离子浓度为40-60g/l，pH＝2.5，温度30℃，当培养基颜色变成红色时，获得第二代培养富集物；镜检到螺旋状细菌后，将适量第二代富集物接种到9K液体培养基中，培养基中亚铁离子浓度为40-60g/l，pH＝1.6，温度为40℃，同时加入终浓度为5-10mM的Fe2(SO4)3，当培养基颜色变成红色时，获得第三代培养富集物；镜检到螺旋状细菌后，将适量第三代富集物接种到9K液体培养基中，培养基中亚铁离子浓度为40-60g/l，pH＝1.6，温度为40℃，同时加入终浓度为5-10mM的Fe2(SO4)3，加入终浓度为0.5-1.5mM的Al3+，当培养基颜色变成红色时，获得第四代培养富集物；镜检到螺旋状细菌后，将第四代富集物分别按稀释分离和平板分离进行纯化，稀释纯化时，将第四代富集物分别按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度，接种到9K液体培养基中培养，培养条件与第四代相同，选择最高稀释度的培养物按上述稀释分离法重复三次，最后获得目标菌株即纯培养物；平板纯化时，将上述第四代富集物接种到编号为Medium 882(DSMZ)的固体平板中培养，将第四代富集物接种到Medium 882培养基制备的固体平板中培养，在该培养基中加入终浓度为1mM的Al3+，其他成分保持不变，琼脂糖浓度为0.8-1.0％，培养温度37-40℃，pH为2.0，挑取第一次获得的单个菌落进行划线培养2-3次，既获得目标菌株的纯培养物。
与双层平板技术相比，上述稀释分离法和平板分离法均不涉及嗜酸异养细菌-AcidiphiliumSJH的加入，使得分离过程相对简单得多；本发明培养介质中较高的Fe3+/Fe2+比例即较高的氧化还原电位，对钩端螺旋菌的抑制作用较小；培养介质中较低的pH(≤1.4)和较高的温度(≥40℃)有利于钩端螺旋菌的生长；较低浓度的Al3+不但有利于嗜铁钩端螺旋菌对亚铁离子的生物氧化，而且还能促进嗜铁钩端螺旋菌。
图1嗜铁钩端螺旋菌YSK在平板上形成的单菌落；图2嗜铁钩端螺旋菌JE在平板上形成的单菌落；
图3稀释法分离后嗜铁钩端螺旋菌的扫描电镜照片。
具体实施例方式首先，将采自江西某矿堆浸液5-10ml样品接种到已灭菌的盛有9K液体培养基(pH＝2.5，20g/l FeSO4.7H2O)三角瓶中，将该三角瓶置于30℃空气浴摇床中振荡，摇床转速为180rpm。当培养基颜色变成红色时，获得第一代培养富集物。镜检到螺旋状细菌后，将适量第一代富集物接种到上述9K液体培养基中(除亚铁离子浓度改变为50g/l外，其它条件不变)，当培养基颜色变成红色时，获得第二代培养富集物。镜检到螺旋状细菌后，将适量第二代富集物接种到9K液体培养基中(亚铁离子浓度仍为50g/l，但pH＝1.6，温度为40℃，同时加入终浓度为10mM的Fe2(SO4)3)，当培养基颜色变成红色时，获得第三代培养富集物。镜检到螺旋状细菌后，将适量第三代富集物接种到9K液体培养基中(除了加入终浓度为1.0mM的Al3+外，其他培养条件与第三代相同)，当培养基颜色变成红色时，获得第四代培养富集物。镜检到螺旋状细菌后，将第四代富集物分别按稀释分离和平板分离路线纯化。稀释纯化时，将第四代富集物分别按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度，接种到9K液体培养基中培养(培养条件与第四代相同)，选择最高稀释度的培养物按上述稀释分离法重复三次，最后获得目标菌株(纯培养物)。采用该方法，获得了5株嗜铁钩端螺旋菌的纯培养物。
平板纯化时，将上述第四代富集物接种到编号为Medium 882(DSMZ)的固体平板中培养(琼脂糖浓度为1.0％，培养温度40℃，pH为2.0)，挑取第一次获得的单个菌落进行划线培养2-3次，最终获得一株螺旋状细菌，命名YSK。采用该方法，获得了6株嗜铁钩端螺旋菌的纯培养物，该菌株经过形态、生理、生化以及分子生物学的鉴定，确认为钩端螺旋菌属的嗜铁钩端螺旋菌，其16SrDNA序列的基因库登陆号DQ343299。
权利要求
1.浸矿细菌-嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离方法，其特征在于首先将样品接种到盛有9K液体培养基的容器中，培养基pH＝2.5，20-30g/lFeSO4·7H2O，将该容器置于30℃空气浴摇床中振荡，摇床转速为180rpm，当培养基颜色变成红色时，获得第一代培养富集物；将适量第一代富集物接种到上述9K液体培养基中，培养基中亚铁离子浓度为40-60g/l，pH＝2.5，温度30℃，当培养基颜色变成红色时，获得第二代培养富集物；将适量第二代富集物接种到9K液体培养基中，培养基中亚铁离子浓度为40-60g/l，pH＝1.6，温度为40℃，同时加入终浓度为5-10mM的Fe2(SO4)3，当培养基颜色变成红色时，获得第三代培养富集物；将适量第三代富集物接种到9K液体培养基中，培养基中亚铁离子浓度为40-60g/l，pH＝1.6，温度为40℃，同时加入终浓度为5-10mM的Fe2(SO4)3，加入终浓度为0.5-1.5mM的Al3+，当培养基颜色变成红色时，获得第四代培养富集物；将第四代富集物分别按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度，接种到9K液体培养基中培养，培养条件与第四代相同，选择最高稀释度的培养物按上述稀释过程重复三次，最后获得目标菌株即纯培养物。
2.根据权利要求1所述的选择性分离方法，其特征在于对第四代富集物还可以按下述方法分离，将第四代富集物接种到Medium 882培养基制备的固体平板中培养，在该培养基中加入终浓度为1mM的Al3+，其他成分保持不变，琼脂糖浓度为0.8-1.0％，培养温度37-40℃，pH为2.0，挑取第一次获得的单个菌落进行划线培养2-3次，既获得目标菌株的纯培养物。
全文摘要
浸矿细菌－嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离方法，将样品采用9K液体培养基培养，经过四代富集培养后，采用稀释分离法或平板纯化分离法对菌株进行纯化培养，最后获得目标菌株即纯培养物。与双层平板技术相比，上述稀释分离法和平板分离法均不涉及嗜酸异养细菌－Acidiphilium SJH的加入，使得分离过程相对简单得多；本发明培养介质中较高的Fe
文档编号C12N1/20GK101016520SQ200610032338
公开日2007年8月15日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者邱冠周, 高健, 康健, 吴学玲, 丁建南, 夏乐先 申请人:中南大学