专利名称：一种用于检测酚类物质的纳米传感器及其检测方法
技术领域：
本发明涉及酚类的检测方法，具体涉及一种纳米传感器及其检测酚类物质的方法。
背景技术：
酚类化合物是有机化工工业非常重要的一类基本原料，它被广泛应用于许多石油化工、合成纤维、医药、农药等众多工业生产中，随着化学工业的迅猛发展及人们生活水平的日益提高，大量酚类化合物往往作为直接工业污染物或转变来的间接污染物而进入环境中，成为环境中的主要污染物。酚类化合物即使在低浓度下也对生物具有毒害作用，且许多取代酚的毒性和生物难降解性随着取代基的增加而明显提高，严重地威胁着生态环境和人类健康。
近年来，白腐真菌用于环境中酚类污染物的治理成为环境微生物处理的一个热点。白腐真菌是引起木材白色腐朽的一类真菌，对木质素及木质素单元结构类似物如含有芳香环结构的环境污染物具有很强的分解能力。黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是一种白腐真菌，其分泌的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和酚氧化酶等多种酶均可以催化酚类物质的解毒和氧化。因此，黄孢原毛平革菌被广泛运用于土壤和水环境中的酚类物质的微生物降解发酵的研究中。这样对于黄孢原毛平革菌发酵环境中酚类物质的浓度变化的实时检测成为考察黄孢原毛平革菌降解能力的重要指标。而由于发酵环境中成分复杂，常用的酚类物质检测方法，如分光光度法往往受到溶液中的光干扰物质和浊度的干扰，而高效液相色谱法等操作复杂，成本高，不能实现微生物降解过程的实时、在线测定。因此迫切需要研制一种操作简单、成本低、又能实现实时在线测定的技术，以及时掌握环境污染程度。
发明内容
本发明的目的是运用Au纳米粒子在酚的还原作用下催化增长的原理和吸收光谱变化规律，提供一种纳米传感器及其酚类物质的检测方法，以解决当前酚类检测存在的上述问题。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的用于检测黄孢原毛平革菌好氧发酵液中酚浓度的纳米生物传感器，由作为反应培育晶种的基底层和纳米粒子粒径增大的反应增长层构成，基底层为固定在玻片上的Au纳米粒子，反应增长层为在含有酚的反应液中AuCl4-在Au纳米粒子表面催化还原生成的且粒径增大的Au纳米粒子。
基底层的玻片是在预处理后经氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅烷化的普通玻璃片，固定在玻片上的纳米粒子是直径为10nm、浓度为1×10-4M、滴加量为25μL的Au纳米粒子。
检测酚浓度的方法为用0.05M盐酸溶液稀释黄孢原毛平革菌发酵液至pH1.5，取3mL作为反应溶液，加入一定浓度的对苯二酚，将传感器置于反应溶液中培育8～12min，将培育前后的传感器先后置于检测池中进行光谱扫描，根据最佳条件下Au纳米粒子在波长为550nm附近的吸收峰值计算出反应液中对苯二酚的浓度，反应溶液的其他组成为十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)0.003MHAuCl40.0011M吸收峰值(I)与对苯二酚浓度(C，10-4M)之间的线性回归方程为I＝(0.0509±0.0021)+(0.0244±0.0012)×C (1)相关系数r2为0.9888其中，对苯二酚浓度的线性范围为7×10-6～3.81×10-4M，检测下限为7×10-6M。
下面结合附图进一步详述本发明
图1对苯二酚作用下Au纳米粒子催化增长示意2不同浓度对苯二酚作用下的传感器光谱图，其中，对苯二酚浓度为(a)0，(b)7×10-6M，(c)5.82×10-5M，(d)1.79×10-4M，(e)1.63×10-3M和(f)3.06×10-3M；图3Au纳米粒子催化增长前后的扫描电镜(SEM)图，其中(a)增长前，(b)增长后；图4光谱吸收峰值与对苯二酚浓度之间的线性回归图。
纳米粒子具有特殊的物理化学性质，在环境与生物分析检测领域表现出巨大的应用价值。金属纳米粒子具有良好的分散性、较为规则的形貌和稳定的吸收光谱，并且其吸收光谱随粒径和浓度的大小发生规律性变化，常被用作生物传感器中的光学标记，在核酸分子和免疫原的识别过程中产生可检测的光学信号。最近的研究表明，在氧化还原活性物质的催化下，Au纳米粒子(AuNP)可以增大，并通过紫外-可见吸收光谱进行定量分析。我们利用酚类物质普遍具有的还原性，设计出Au纳米粒子催化增长的传感器，实现对复杂的黄孢原毛平革菌好氧发酵液中酚类物质的光学在线检测。
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在Kirk培养基中进行好氧培养，用0.05M HCl溶液调节发酵液的pH值至1.5，取3ml作为反应液，加入不同浓度的对苯二酚，并加入0.003M十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和0.0011M HAuCl4作为反应物。
将普通玻璃片(长30mm，宽9mm，厚1mm)表面用Pirahna溶液和H2O2、NH3、H2O的混合溶液预处理后用氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)氨基硅烷化，将直径为10nm的Au纳米粒子(1×10-4M)25μL滴涂于玻片表面固定，制成Au纳米粒子修饰的生物传感器。
将传感器置于加入反应溶液中培育8～12min。AuCl4-在对苯二酚的作用下，在Au纳米粒子表面还原生成Au，从而使Au纳米粒子粒径增大，反应示意图见图1，其反应方程为 本发明采用日本岛津UV-2550紫外-可见分光光度计进行光谱分析，石英比色皿光程为1cm。所有工作均在室温(25℃)下完成。实验用水均为超纯水(美国Millipore超纯水系统)。在紫外-可见分光光度计的参比和待测池中均注入2.5mL超纯水。将培育前后的传感器先后置于检测池中进行光谱扫描。Au纳米粒子在波长为550nm附近有一个吸收峰，峰随着Au纳米粒子粒径改变而发生位移，且峰值随着Au纳米粒子粒径增大而增大，从而可根据峰值计算出反应液中对苯二酚的浓度。当反应液为发酵液(用0.05M HCl溶液稀释至pH1.5)，CTAC(0.003M)和HAuCl4(0.0011M)时，传感器对对苯二酚的响应最好，不同浓度对苯二酚的响应光谱见图2。其中，对苯二酚浓度为(a)0，(b)7×10-6M，(c)5.82×10-5M，(d)1.79×10-4M，(e)1.63×10-3M和(f)3.06×10-3M。由图可见，峰值随着对苯二酚浓度增大、Au纳米粒子粒径增大而增大。吸收峰在对苯二酚浓度较低时随着对苯二酚浓度增大而红移，在浓度较高时蓝移，这可能是因为在高浓度对苯二酚还原下，在原增长的Au纳米粒子表面上形成了许多小Au纳米粒子。
同时，对用反应液培育前后的Au纳米粒子修饰的传感器表面用日本电子JEOLJSC-1600自动离子溅射仪进行喷铂处理以增强导电性，喷铂厚度约为10nm。采用荷兰FEI Sirion 200场发射扫描电子显微镜进行扫描电镜分析。图3(a)为培育前的玻片表面Au纳米粒子，(b)为用含有发酵液(用0.05M HCl溶液稀释至pH1.5)，CTAC(0.003M)、HAuCl4(0.0011M)和对苯二酚(7.59×10-4M)的反应液培育后的玻片表面Au纳米粒子。由图可见，培育前Au纳米粒子粒径为10nm左右，培育后Au纳米粒子平均粒径增长为50.51nm，增长现象明显。
在实验中发现，传感器培育时反应液始终保持无色，只有传感器表面颜色加深，说明只有在Au纳米粒子催化下还原反应才能发生。传感器对对苯二酚的响应与玻片上Au纳米粒子的固定量有关，当玻片上Au纳米粒子的固定量过小，则传感器响应不灵敏，固定量过大时，传感器基底响应峰值过大，对相同浓度的对苯二酚的响应距离线性范围上限也过于接近。因此，在传感器制备中当玻片上Au纳米粒子的滴加量为25μL时，传感器响应最好，其Au纳米粒子固定量在550nm左右对应的吸光峰值为0.045。我们还考察了培育时间对传感器响应的影响，发现传感器在培育8min后响应峰值即达到最大，为了获得稳定的响应结果，我们采用8～12min为反应液培育时间。
在上述最佳测定条件下，将传感器的响应光谱的Au纳米粒子的吸收峰值(I)与对应的对苯二酚浓度值(C，10-4M)作线性回归，见图4。当对苯二酚浓度为7×10-6～3.81×10-4M时，回归方程为I＝(0.0509±0.0021)+(0.0244±0.0012)×C其中，相关系数r2为0.9888，检测下限为7×10-6M。
由于黄孢原毛平革菌的好氧发酵液中存在多种酚类物质，均具有还原性，因此在采用本发明所建立的光学纳米金传感器检测时得到的是酚类物质的总体水平。本方法操作简便，成本低，灵敏度高，抗干扰能力强，为土壤、水环境中酚类污染物的微生物降解进程的实时在线监测提供了技术支持。
具体实施例方式
1.菌种培养将30℃预热活化24h的黄孢原毛平革菌接种至PDA培养基，在37℃条件下静置培养4天用于菌的扩增。将其孢子分别接种至8个250mL锥形瓶装的25mL Kirk液体培养基，在37℃下静置培养2天。将每4个锥形瓶中的培养基混合，均质搅拌20s，倒入250mL锥形瓶中(100mL/瓶)，于28℃下振荡63h，转速150rpm。
培养基过滤得发酵液。
PDA培养基组成土豆40克，琼脂4g，葡萄糖4g，水200mL。
Kirk液体培养基组成葡萄糖20g/L，酒石酸铵0.22g/L，吐温801g/L，苯甲醇0.54g/L，KH2PO42.56g/L，MgSO4·7H2O1.46g/L，VB1 0.001g/L，琥珀酸1.18g/L，微量元素液70mL/L；用0.1M的NaOH调至最终pH4.5。
其中微量元素液(g/L)氨基乙酸0.6，MnSO4·H2O0.5，NaCl1，FeSO4·7H2O0.1，CoSO4·7H2O0.22，CaCl2·2H2O1.56，ZnSO4·7H2O0.1，CuSO4·5H2O0.1，AlK(SO4)2·12H2O0.01，HBO30.01，Na2MoO4·2H2O0.01。
2.纳米传感器制备将普通载玻片加工成长30mm，宽9mm，厚1mm，在Pirahna溶液(H2SO4，98％和H2O2，30％，体积比为4∶1)中于60℃下浸泡20min。水洗后，在H2O2，NH3和H2O的混合溶液(体积比为1∶1∶2)中于70℃下浸泡20min。用大量水、甲醇(色谱纯)冲洗除去物理吸附，在4℃下保存于甲醇中备用。配APTMS和甲醇混合溶液(体积比为1∶1.5)，将玻片置于其中浸泡18h，35℃，用甲醇冲洗去弱吸附，然后置于常温下干燥。将直径为10nm、浓度为1×10-4M、滴加量为25μL的AuNP滴涂于玻片一面固定，常温下静置干燥2h。用水冲洗，4℃下保存于水中。
3.对苯二酚浓度测定在参比池和待测池中均注入2.5mL超纯水，将培育前后的传感器先后置于检测池中进行光谱扫描。用0.05M的盐酸溶液稀释黄孢原毛平革菌好氧发酵液至pH1.5，取3mL作为反应液，依次加入0.003M的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、0.0011M的HAuCl4和对苯二酚，迅速混合均匀后将传感器浸入其中，常温下培育8～12min。将传感器从反应液中取出，置入检测池中进行光谱扫描。
4.发酵液中对苯二酚回收实验在最佳条件下，在反应液中加入一定浓度的对苯二酚，根据在波长为550nm附近的吸收峰值和回归方程计算出对苯二酚浓度，与加入的浓度对照，计算回收率，见下表。
发酵液中对苯二酚测定的平均回收率为101.6％，说明本发明的传感器检测酚类物质的方法是准确有效的。
权利要求
1.一种用于检测黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)好氧发酵液中酚浓度的纳米传感器，其特征在于传感器由作为反应培育晶种的基底层和纳米粒子粒径增大的反应增长层构成，基底层为固定在玻片上的Au纳米粒子，反应增长层为在含有酚的反应液中AuCl4-在Au纳米粒子表面催化还原生成且粒径增大的Au纳米粒子。
2.按照权利要求1所述的用于检测黄孢原毛平革菌好氧发酵液中酚浓度的纳米传感器，其特征在于基底层的玻片是在预处理后经氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅烷化的普通玻璃片，固定在玻片上的纳米粒子是直径为10nm、浓度为1×10-4M、滴加量为25μL的Au纳米粒子。
3.一种如权利要求1所述的纳米传感器检测酚浓度的方法，其特征在于用0.05M盐酸溶液稀释黄孢原毛平革菌发酵液至pH1.5，取3mL作为反应溶液，加入一定浓度的对苯二酚，将传感器置于反应溶液中培育8～12min，将培育前后的传感器先后置于检测池中进行光谱扫描，用Au纳米粒子在波长为550nm附近的吸收峰值计算出反应液中对苯二酚的浓度，反应溶液的其他组成为十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)0.003MHAuCl40.0011M吸收峰值(I)与对苯二酚浓度(C，10-4M)之间的线性回归方程为I＝(0.0509±0.0021)+(0.0244±0.0012)×C相关系数r2为0.9888其中，对苯二酚浓度的线性范围为7×10-6～3.81×10-4M，检测下限为7×10-6M。
全文摘要
本发明涉及一种纳米传感器及其检测黄孢原毛平革菌好氧发酵液中酚浓度的方法。本发明以固定在传感器表面的Au纳米粒子为晶种，运用在酚还原作用下Au纳米粒子催化增长的原理和吸收光谱变化规律，计算光谱中纳米粒子吸收峰值的变化测定酚浓度。本发明以对苯二酚浓度代表总酚水平，通过紫外－可见吸收光谱进行定量分析，并采用扫描电镜对传感器表面变化进行表征，测定对苯二酚浓度的线性范围为7×10
文档编号C12Q1/00GK1821752SQ20061003142
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者汤琳, 曾光明, 牛承岗, 沈国励, 杨朝晖 申请人:湖南大学