专利名称：利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法
技术领域：
本发明属于一种核酸错配识别的方法，具体涉及一种实现单碱基错配识别的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)是指基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的突变，这种突变可由单个碱基的转换或颠换所引起，二者之比约为2∶1。单碱基突变可以导致群体与群体、个体与个体之间的差异。许多疾病的易感性、个体的药物敏感性等均与单碱基突变相关。研究单碱基突变有助于解释个体的表现差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应，为制订合理的治疗方案、药物的开发提供依据。
核酸传感技术由于具有快速、灵敏、操作简单、无污染等特点，已经成为研究核酸的重要手段，广泛应用于突变检测、基因筛选、基因诊断、药物的研制与开发等领域。但在核酸传感技术中，由于单碱基错配的DNA可与固定化DNA探针进行部分杂交，引起信号变化，从而干扰完全互补的DNA(cDNA)的检测以及出现假阳性结果。通常采用调节杂交条件的严谨度(如温度、离子强度、甲酰胺浓度等)，在高严谨度条件进行洗脱来辨别单碱基错配DNA，但这种方法在减小单碱基错配DNA造成的影响的同时有可能降低cDNA杂交引起的信号变化。另外，采用一些特异性好的核酸探针(如肽核酸探针、分子信标)来代替ssDNA探针也可以提高识别单碱基错配的能力，但这种方法存在探针设计及制备相对复杂、成本高等不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷，提供一种简便易行、检测结果稳定、核酸探针设计简单、不降低cDNA杂交引起的信号变化、所制传感芯片可重复利用、成本低且能快速准确的利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法。
为解决上述技术问题，本发明方法以表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)传感器作为检测手段并采用下述技术方案a.在表面等离子体共振传感器金属薄膜表面上固定DNA探针，制成传感芯片，然后加入目标DNA进行杂交，中性缓冲溶液反复冲洗金属薄膜，利用表面等离子体共振传感器获得目标DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号；b.上述最终所得体系中加入巯基DNA修饰的纳米金颗粒，杂交完成后，中性缓冲溶液反复冲洗金属薄膜，利用表面等离子体共振传感器获得巯基DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号；c.调节金属薄膜与导电玻璃之间的电位差使金属薄膜表面荷负电，然后用中性缓冲溶液反复冲洗金属薄膜进行电洗脱，利用表面等离子体共振传感器获得电洗脱后的表面等离子体共振响应信号；d.比较目标DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号、巯基DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号和电洗脱后的表面等离子体共振响应信号，若电洗脱后的表面等离子体共振响应信号小于巯基DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号，则可知加入的目标DNA是单碱基错配的DNA。
所述步骤a中利用共价交联的方法将DNA探针固定于SPR传感器的金属薄膜表面；所述共价交联的方法可为氨基偶联方法、巯基偶联方法或生物素-亲和素交联方法；所述DNA探针可以是氨基的DNA探针、巯基DNA探针或生物素化的DNA探针；所述中性缓冲溶液为pH 7.0的6×SSC(6倍Saline-Sodium Citrate)缓冲溶液；所述巯基DNA修饰的纳米金颗粒粒径为10～20nm；所述金属薄膜为金膜；所述导电玻璃为氧化铟锡(ITO)导电玻璃；所述步骤c中，金属薄膜相对导电玻璃而言的电位为-5～-20V，电洗脱时间为5～15分钟。
若加入的目标DNA是单碱基错配的DNA，电洗脱后，单碱基错配的DNA与巯基DNA修饰的纳米金颗粒杂交形成的dsDNA被解旋，巯基DNA修饰的纳米金颗粒被缓冲溶液冲洗掉，从而引起体系SPR响应信号的变化，电洗脱后的SPR响应信号要小于巯基DNA杂交后的SPR响应信号；若加入的目标DNA是cDNA，电洗脱后，与巯基DNA修饰的纳米金颗粒杂交形成的dsDNA不会解旋，从而也不会引起体系SPR响应信号的变化，此时电洗脱后的SPR响应信号和巯基DNA杂交后的SPR响应信号相同。因此，根据体系SPR响应信号的变化可以明显区分单碱基错配DNA和cDNA，从而实现单碱基错配DNA的识别。
本发明方法的优点在于1.既可通过电洗脱简便有效地除去单碱基错配目标DNA所造成的干扰，又可确保cDNA杂交引起的信号变化在电洗脱中不受影响，非常方便地区分单碱基错配目标DNA和cDNA；2.本发明方法中采用的DNA探针设计简单、合成方便、制备成本低；所用的传感芯片可以重复利用，降低了成本；3.本发明方法简便易行、成本低，不仅在SPR传感器中可以采用，还可以拓展至其他生物传感器中；4.本发明方法不但为识别单碱基错配DNA提供了一种新的手段，而且为构建高选择性的生物传感器提供了一种新的思路。
图1纳米金颗粒和电洗脱作用相结合检测完全匹配目标DNA原理示意图。
图2纳米金颗粒和电洗脱作用相结合检测单碱基错配目标DNA原理示意图。
图3纳米金颗粒和电洗脱作用相结合检测完全匹配目标DNA的SPR光谱图。
图4纳米金颗粒和电洗脱作用相结合检测单碱基错配目标DNA的SPR光谱图。
图5电洗脱作用对单碱基错配目标DNA杂交形成的dsDNA的影响。
以上各图中标号表示1、金膜 2、DNA探针 3、完全匹配目标DNA4、巯基DNA探针修饰的纳米金颗粒41、巯基标记DNA探针42、纳米金颗粒5、在金膜表面荷负电条件下进行电洗脱6、单碱基错配目标DNAa、氨基修饰的DNA探针固定在金膜表面上的SPR光谱b、与33nM完全匹配目标DNA杂交之后的SPR光谱b′、与33nM单碱基错配目标DNA1杂交之后的SPR光谱c、与巯基标记DNA探针修饰的纳米金颗粒反应之后的SPR光谱d、电洗脱后的SPR光谱e、再生处理后的SPR光谱A、完全匹配目标DNAB、单碱基错配目标DNA1C、单碱基错配目标DNA2D、单碱基错配目标DNA3E、单碱基错配目标DNA4F、单碱基错配目标DNA5I、电洗脱之前的共振波长位移值(λ2-λ1)II、电洗脱之后的共振波长位移值(λ3-λ1)具体实施方式
采用基于波长调制的表面等离子体共振传感器(该传感器构造如下包括光源、平行光管、p偏振片、棱镜、棱镜支架、流通池、可调直流电源、光栅光谱仪和计算机，棱镜通过螺钉固定于棱镜支架中，光源置于平行光管之前，p偏振片粘在平行光管的出射口，置于棱镜支架中的棱镜位于平行光管之后，光栅光谱仪设置于棱镜的出射光路上，并通过数据线与计算机的接口相连。光源、平行光管和棱镜支架分别通过可调升降台固定于底座上，光栅光谱仪和计算机安放于底座上。流通池置于棱镜上方，该流通池由金膜和导电玻璃组成，金膜由折射率匹配油如香柏油粘合于棱镜底面上，本实施例中棱镜为等腰直角三棱镜，也可为等腰梯形棱镜，金膜粘合于棱镜的底面(即本等腰直角三棱镜中与直角相对的面)。导电玻璃的玻璃层底面与金膜粘合，导电玻璃的玻璃层底部开设有进样槽，进样槽的深度为0.05～0.15mm，长度等于导电玻璃的长度，在玻璃层与金膜之间形成进样通道，位于玻璃层顶面的导电玻璃的导电层与金膜分别通过导线与可调直流电源相连。本实例中光源采用卤钨灯；光栅光谱仪由平面光栅、准光系统、电荷耦合器件(CCD)检测器组成，电荷耦合器件(CCD)检测器的光谱响应区间为300～900nm。
该传感器的工作过程为通过可调升降台调整本装置的光路，使光源发出的光束经过平行光管、p偏振片后射入等腰直角三棱镜，与棱镜上的金膜发生耦合，反射光入射到光栅光谱仪，经光栅光谱仪中的准光系统入射到光栅光谱仪的平面光栅上，平面光栅将光束分为不同波长的平行单色光投射到光栅光谱仪的电荷藕荷器件(CCD)检测器上，电荷藕荷器件(CCD)检测器将光信号转换为电信号，经模/数转换后通过数据线传输到计算机中得到相应的光谱图。)作为检测手段，响应信号变化是共振波长(λ)的位移。
实施例一1.金膜表面在修饰前需要清洗，首先依次用丙酮、无水乙醇和二次水清洗干净，然后用体积比为3∶1的浓硫酸/30％双氧水溶液清洗1-2min，再用二次水反复冲洗干净，用N2吹干，即可用于表面修饰。金膜的修饰的步骤如下(1)首先用10mmol/L巯基丙酸/无水乙醇溶液至少处理70min，再用0.01mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.3)反复冲洗，洗去未吸附的巯基丙酸；(2)然后用100mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺在室温反应60min，而后用0.01mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.3)缓冲液反复冲洗干净；(3)最后注入0.57μmol/L氨基修饰的探针DNA2(购买于宝生物工程大连有限公司)在室温下培育，一段时间后用0.01mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.3)反复冲洗，即可将氨基修饰的DNA探针2固定于表面等离子体共振传感器的金膜1表面，获得DNA传感芯片。氨基修饰的DNA探针序列为5’-CGCCTCACAACCAAAAAA-C6H12-NH2-3’。记录此时的SPR光谱为曲线a，其共振波长λ0为663.0nm(如图3和图4所示)；2.如图1和图3所示，在步骤1基础之上加入33nM完全匹配目标DNA(cDNA)3进行杂交，杂交时间为30min，cDNA的序列为5’-GGTTGTGAGGCGCTGCCCAAGCGA-3；之后，用pH 7.0的6×SSC(该6×SSC是由0.9mol/L氯化纳和0.09mol/L柠檬酸钠组成，并用浓度为0.1mol/L盐酸调节该溶液的pH为7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现SPR光谱从曲线a朝长波方向移动，移至曲线b，曲线b的共振波长λ1为665.4nm，则共振波长位移(λ1-λ0)为2.4nm，说明cDNA已经被捕获在金膜表面；接着加入过量的巯基DNA修饰的粒径为13nm的纳米金颗粒4(巯基DNA修饰的纳米金颗粒制备方法首先用柠檬酸三钠还原氯金酸水溶液方法制备纳米金颗粒，具体步骤如下准确移取100mL 0.01％氯金酸溶液于烧杯，加热至沸，在剧烈搅拌下，快速加入3mL新配的1％柠檬酸三钠溶液，连续煮沸大约5min，溶液颜色由深蓝变为红色，并保持稳定，即得到红色的纳米金溶液。将制备好的纳米金溶液室温冷却后稀释至100mL容量瓶，摇匀，置于4℃环境中保存。然后在纳米金颗粒表面修饰巯基DNA，步骤如下首先取100μL 36μmol/L巯基DNA与900μL上述纳米金溶液混合，在4℃条件下培育16h，然后加入氯化钠和磷酸缓冲溶液(pH 7.0)(由磷酸二氢钾和磷酸氢二钠两种盐配制而成)，使上述的纳米金颗粒-巯基DNA的复合物在4℃条件下老化40h，氯化钠和磷酸缓冲溶液(pH 7.0)的终浓度分别为0.1mol/L和0.01mol/L。然后以13000rpm的速度离心30min之后，弃去上清液，将离心管底的红色油状沉淀分散到含0.1mol/L氯化钠的0.01mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中，再以13000rpm的速度离心30min，重复两次洗涤，将未结合的巯基DNA去除。洗涤完的巯基DNA修饰的纳米金颗粒分散在含0.3mol/L氯化钠的0.01mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中，置于4℃环境中保存备用。其中，巯基DNA的序列为5’-HS-C6H12-AAAAAATCGCTTGGGCAG-3’)，反应30min，6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现SPR光谱继续朝长波方向移动，移至曲线c，曲线c的共振波长λ2为672.1nm，共振波长位移(λ2-λ1)为6.7nm，反映此时纳米金颗粒已固定在金膜表面。然后接通电路，调节金膜(相对ITO导电玻璃而言)的电位为-10V，并用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗5min，而后，断开电路，记录SPR光谱为曲线d，曲线d与曲线c的共振波长相同。这说明在这种电场强度下利用电洗脱基本不会影响由cDNA与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交形成的dsDNA。最后利用90℃热水清洗5min，再用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现SPR光谱朝短波方向移动，移至曲线e，曲线e与曲线a的共振波长相同，说明热水可以再生传感芯片。
3.如图2和图4所示，在步骤1基础之上加入33nM单碱基错配目标DNA16进行杂交，杂交时间为30min，单碱基错配目标DNA1的序列为5’-GGTTGTGAGGCGGTGCCCAAGCGA-3’，之后，用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗，发现可引起SPR光谱从曲线a朝长波方向移动，移至曲线b′，曲线b′的共振波长λ1为665.3nm，则共振波长位移(λ1-λ0)为2.3nm，说明单碱基错配目标DNA1已经被捕获在金膜表面；接着加入过量的巯基DNA修饰的粒径为13nm的纳米金颗粒，反应30min，用6×SSC(pH7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现SPR光谱继续朝长波方向移动，移至曲线c，曲线c的共振波长λ2为669.5nm，共振波长位移(λ2-λ1)为4.2nm，反映此时纳米金颗粒也被捕获在金膜表面。其中，巯基DNA的序列为5’-HS-C6H12-AAAAAATCGCTTGGGCAG-3’。然后接通电路，调节金膜(相对ITO导电玻璃而言)的电位为-10V，并用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗5min，而后，断开电路，记录SPR光谱为曲线d，可发现SPR光谱明显朝短波方向移动，曲线d的共振波长与小于曲线c的共振波长。这说明在这种电场强度下利用电洗脱可以使由单碱基错配DNA1与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交形成的dsDNA解旋，被解旋的巯基DNA修饰的纳米金颗粒随缓冲溶液被冲洗掉，引起SPR光谱明显朝短波方向移动，回到没有加入巯基DNA修饰的纳米金颗粒之前的状态。最后用90℃热水清洗5min，再用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现SPR光谱朝短波方向移动，移至曲线e，曲线e与曲线a的共振波长相同，说明热水可以再生传感芯片。
由此可知，当金膜(相对于ITO导电玻璃而言)的电位为-10V时，利用电洗脱对cDNA与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移没有影响(比较图3中曲线d的共振波长与曲线b的共振波长)，而对单碱基错配DNA1而言，在这种电场强度下利用电洗脱可除去由单碱基错配DNA1与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移(比较图4中曲线d的共振波长与曲线b′的共振波长)。因此，可以利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配目标DNA1的识别。
实施例二1.利用如实施例一中步骤1方法将0.57μmol/L氨基修饰的探针DNA2固定于表面等离子体共振(SPR)传感器的金膜表面，氨基修饰的DNA探针的序列为5’-CGCCTCACAACCAAAAAA-C6H12-NH2-3’，记录其SPR光谱为曲线1，其共振波长为λ0；2.然后加入33nmol/L单碱基错配目标DNA2进行杂交，杂交时间为30min，单碱基错配目标DNA2的序列为5’-GGTTGTGAGGCGATGCCCAAGCGA-3’，之后，用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗，发现可引起SPR光谱从曲线1朝长波方向移动，移至曲线2，曲线2的共振波长λ1；接着加入过量的巯基DNA修饰的粒径为13nm的纳米金颗粒，反应30min，巯基DNA的序列为5’-HS-C6H12-AAAAAATCGCTTGGGCAG-3’，用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗金膜，发现SPR光谱继续朝长波方向移动，移至曲线3，曲线3的共振波长为λ2，共振波长位移(λ2-λ1)为4.4nm(见图5中C的I部分)。
3.然后接通电路，调节金膜(相对ITO导电玻璃而言)的电位为-8V，并用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗5min，而后，断开电路，记录SPR光谱为曲线4，曲线4明显朝短波方向移动，曲线4的共振波长λ3小于曲线3的共振波长λ2，共振波长位移(λ3-λ2)为-4.3nm，共振波长位移(λ3-λ1)为0.1nm(见图5中C的II部分)。
这说明在这种电场强度下利用电洗脱除去由单碱基错配DNA2与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移，而对cDNA而言，这种电场强度下利用电洗脱对cDNA与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移没有影响(比较图5中A的I和II部分)，因此，可以利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配目标DNA2的识别。
实施例三
1.同实施例二中步骤1。
2.然后加入33nmol/L单碱基错配目标DNA3进行杂交，杂交时间为30min，单碱基错配目标DNA3的序列为5’-GGTTGTGAGGCGTTGCCCAAGCGA-3’，用6×SSC(pH7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现可引起SPR光谱从曲线1朝长波方向移动，移至曲线2，曲线2的共振波长为λ1；接着加入过量的巯基DNA修饰的粒径为13nm的纳米金颗粒，反应30min，巯基DNA的序列为5’-HS-C6H12-AAAAAATCGCTTGGGCAG-3’，之后用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，发现SPR光谱继续朝长波方向移动，移至曲线3，曲线3的共振波长为λ2，共振波长位移(λ2-λ1)为4.3nm(见图5中D的I部分)。
3)然后接通电路，调节金膜(相对ITO导电玻璃而言)的电位为-15V，并用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗5min，而后，断开电路，记录SPR光谱为曲线4，曲线4明显朝短波方向移动，曲线4的共振波长λ3小于曲线3的共振波长λ2，共振波长位移(λ3-λ2)为-4.1nm，共振波长位移(λ3-λ1)为0.2nm(见图5中D的II部分)。这说明在这种电场强度下利用电洗脱可除去由单碱基错配目标DNA3与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移。而对cDNA而言，这种电场强度下利用电洗脱对cDNA与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移没有影响(比较图5中A的I和II部分)，因此，可以利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配目标DNA3识别。
实施例四1.同实施例二中步骤1。
2.然后加入33nmol/L单碱基错配目标DNA4进行杂交，杂交时间为30min，单碱基错配目标DNA4的序列为5’-GGTTGTGAGGCG CTGCCGAAGCGA-3’，之后，用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗，SPR光谱从曲线1朝长波方向移动，移至曲线2，曲线2的共振波长为λ1；接着加入过量的巯基DNA修饰的粒径为13nm的纳米金颗粒，反应30min，巯基DNA的序列为5’-HS-C6H12-AAAAAATCGCTTGGGCAG-3’，用6×SSC(pH7.0)缓冲溶液反复冲洗之后，SPR光谱继续朝长波方向移动，移至曲线3，曲线3的共振波长为λ2，共振波长位移(λ2-λ1)为1.3nm(见图5中E的I部分)。
3.然后接通电路，调节金膜(相对ITO导电玻璃而言)的电位为-5V，并用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗5min，而后，断开电路，记录SPR光谱为曲线4，曲线4明显朝短波方向移动，曲线4的共振波长λ3小于曲线3的共振波长λ2，共振波长位移(λ3-λ2)为-1.2nm，共振波长位移(λ3-λ1)为0.1nm(见图5中E的II部分)。这说明在这种电场强度下利用电洗脱可除去由单碱基错配目标DNA4与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移。而对cDNA而言，这种电场强度下利用电洗脱对cDNA与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移没有影响(比较图5中A的I和II部分)，因此，可以利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配目标DNA4识别。
实施例五1.同实施例二中步骤1。
2.然后加入33nmol/L单碱基错配目标DNA5进行杂交，杂交时间为30min，单碱基错配目标DNA5的序列为5’-GGTTGTGAGGCG CTGCCCAAGCGT-3’，之后，用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗，发现可引起SPR光谱从曲线1朝长波方向移动，移至曲线2，曲线2的共振波长为λ1；接着加入过量的巯基DNA修饰的粒径为13nm的纳米金颗粒进行反应30min，巯基DNA的序列为5’-HS-C6H12-AAAAAATCGCTTGGGCAG-3’，用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗，发现SPR光谱继续朝长波方向移动，移至曲线3，曲线3的共振波长为λ2，共振波长位移(λ2-λ1)为3.9nm(见图5中F的I部分)。
3.然后接通电路，调节金膜(相对ITO导电玻璃而言)的电位为-8V，并用6×SSC(pH 7.0)缓冲溶液反复冲洗5min，而后，断开电路，记录SPR光谱为曲线4，曲线4明显朝短波方向移动，曲线4的共振波长λ3小于曲线3的共振波长λ2，共振波长位移(λ3-λ2)为-3.8nm，共振波长位移(λ3-λ1)为0.1nm(见图5中F的II部分)。这说明在这种电场强度下利用电洗脱除去由单碱基错配目标DNA5与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移。而对cDNA而言，这种电场强度下利用电洗脱对cDNA与纳米金颗粒表面的巯基DNA杂交引起的共振波长位移没有影响(比较图5中A的I和II部分)，因此，可以利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配目标DNA5识别。
权利要求
1.一种利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，其特征在于包括以下步骤a.在表面等离子体共振传感器金属薄膜表面上固定DNA探针，制成传感芯片，然后加入目标DNA进行杂交，中性缓冲溶液反复冲洗金属薄膜，利用表面等离子体共振传感器获得目标DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号；b.上述最终所得体系中加入巯基DNA修饰的纳米金颗粒，杂交完成后，中性缓冲溶液反复冲洗金属薄膜，利用表面等离子体共振传感器获得巯基DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号；c.调节金属薄膜与导电玻璃之间的电位差使金属薄膜表面荷负电，然后用中性缓冲溶液反复冲洗金属薄膜进行电洗脱，利用表面等离子体共振传感器获得电洗脱后的表面等离子体共振响应信号；d.比较目标DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号、巯基DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号和电洗脱后的表面等离子体共振响应信号，若电洗脱后的表面等离子体共振响应信号小于巯基DNA杂交后的表面等离子体共振响应信号，则可知加入的目标DNA是单碱基错配的DNA。
2.根据权利要求1所述利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，其特征在于，所述步骤a中利用共价交联的方法将DNA探针固定于表面等离子体共振传感器的金属薄膜表面。
3.根据权利要求2所述利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，其特征在于，共价交联的方法为氨基偶联方法、巯基偶联方法或生物素-亲和素交联方法；所述DNA探针是氨基修饰的DNA探针、巯基DNA探针或生物素化的DNA探针。
4.根据权利要求1或2或3所述利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配的方法，其特征在于，所述中性缓冲溶液为pH 7.0的6×SSC缓冲溶液。
5.根据权利要求1或2或3所述利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，其特征在于，所述巯基DNA修饰的纳米金颗粒粒径为10～20nm。
6.根据权利要求1或2或3所述利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，其特征在于，步骤c中，所述金属薄膜相对导电玻璃而言的电位为-5～-20V。
7.根据权利要求1或2或3所述利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，其特征在于，所述步骤c中，电洗脱时间为5～15分钟。
8.根据权利要求1或2或3所述利用纳米金颗粒和电洗脱提高单碱基错配识别能力的方法，其特征在于，所述金属薄膜为金膜。
9.根据权利要求1或2或3所述利用纳米金颗粒和电洗脱提高单碱基错配识别能力的方法，其特征在于，所述导电玻璃为氧化铟锡导电玻璃。
全文摘要
一种利用纳米金颗粒和电洗脱实现单碱基错配识别的方法，包括以下步骤固定DNA探针，加入目标DNA，反复冲洗，检测目标DNA杂交后的SPR响应信号；加入巯基DNA修饰的纳米金颗粒杂交，反复冲洗，检测巯基DNA杂交后的SPR响应信号；金属薄膜表面荷负电进行电洗脱，检测电洗脱后的响应信号；若电洗脱后的SPR响应信号小于巯基DNA杂交后的SPR响应信号，则可知加入的目标DNA是单碱基错配的DNA。本发明方法既可除去单碱基错配目标DNA所造成的干扰，又可确保cDNA杂交引起的信号变化在电洗脱中不受影响；采用的DNA探针设计简单、传感芯片可重复利用。
文档编号C12Q1/68GK1944671SQ20061003247
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月27日 优先权日2006年10月27日
发明者王柯敏, 羊小海, 王青 申请人:湖南大学